Meting en analyse van de extracellulaire zuurproductie te bepalen glycolytisch Rate

Samenvatting

Glycolyse is een bepalende metabolische marker in meerdere biologische systemen. Het monitoren van glycolyse door het meten van de extracellulaire flux van H⁺ is gebruikelijk, maar vereist correctie om kwantitatief en eenduidig te zijn. Hier laten we zien hoe je extracellulaire fluxgegevens kunt verzamelen en corrigeren om onderscheid te maken tussen respiratoire en glycolytische bronnen van extracellulaire acidificatie.

Samenvatting

Extracellulaire meting van zuurstofverbruik en zuurproductie is een eenvoudige en krachtige manier om de snelheid van ademhaling en glycolyse te monitoren¹. Zowel mitochondriale (ademhaling) als niet-mitochondriale (andere redox) reacties consumeren zuurstof, maar deze reacties kunnen gemakkelijk worden onderscheiden door chemische remming van mitochondriale ademhaling. Echter, terwijl mitochondriale zuurstofconsumptie een ondubbelzinnige en directe meting van de ademhalingssnelheid is², hetzelfde geldt niet voor extracellulaire zuurproductie en de relatie met glycolytische snelheid ^3-6. Extracellulair zuur geproduceerd door cellen is afkomstig van zowel lactaat, geproduceerd door anaërobe glycolyse, als CO₂, geproduceerd in de citroenzuurcyclus tijdens ademhaling. Voor glycolyse is de omzetting van glucose naar lactaat^- + H⁺ en de export van producten naar het assaymedium de bron van glycolytische acidificatie. Voor ademhaling is de export van CO₂, hydratatie naar H₂CO₃ en dissociatie naar HCO₃^- + H⁺ de bron van respiratoire acidificatie. De verhoudingen van glycolytische en respiratoire acidificatie hangen af van de experimentele omstandigheden, inclusief celtype en substraat(s) die worden geleverd, en kunnen variëren van bijna 100% glycolytische acidificatie tot bijna 100% respiratoire acidificatie ⁶. Hier demonstreren we de gegevensverzameling en berekeningsmethoden die nodig zijn om respiratoire en glycolytische bijdragen aan totale extracellulaire acidificatie door hele cellen in cultuur te bepalen, met behulp van C2C12 myoblastcellen als model.

Inleiding

Het algemene doel van deze methode is om de glycolytische snelheid van cellen met behulp van extracellulaire flux analyse nauwkeurig te meten. Kwantitatieve meting van glycolytische snelheid met behulp van extracellulaire aanzuring is het gewenste eindpunt van veel experimenten. De totale snelheid van extracellulaire verzuring is de som van twee componenten: respiratoire verzuring, in de vorm van CO ₂ (die hydrateert H ₂ CO ₃ dissocieert dan HCO ₃ ^- + H ^+), en glycolytische verzuring in de vorm lactaat ^- + H ^+.

De bijdragen van de CO ₂ totale extracellulaire verzuring tot voor kort beschouwd als te verwaarlozen in het meetplatform hier gebruikt, de XF24 analyser ^7. Het is echter duidelijk verschillende andere systemen die CO ₂ kan een belangrijke bijdrage aan de extracellulaire zuurgraad ^4-5 zijn. Meerdere kranten erkennen dit conbijdrage, maar niet proberen directe kwantificering van CO ₂ -afgeleide zuur ^3,8,9. We hebben onlangs aangetoond dat kwantitatief CO ₂ productie is een belangrijke bron van extracellulaire verzuring in dit systeem ^6. Bovendien, hoewel er meerdere metabole routes die _CO2 genereren uit glucose catabolisme, die door matrix dehydrogenases uitgevoerd in de citroenzuurcyclus zijn overweldigende bijdragen en andere bronnen genereren hoeveelheden CO ₂ die binnen de experimentele fout ^6.

Zonder correctie voor CO ₂ productie, extracellulaire verzuring is dus een dubbelzinnige indicator van glycolytische tarief en kan niet kwantitatief worden gebruikt. Onze eerdere publicatie belicht verscheidene gevallen waarin respiratoire CO ₂ omvat het grootste deel van de totale verzuring signaal, zelfs in cellen algemeen aangenomen voornamelijk gebruik glycolyse ^6. Bovendien, derespiratoire CO ₂ bijdrage aan totale verzuring sterk varieert tijdens gemeenschappelijke metabool profilering experimenten aangetoond dat correcte vergelijking van de glycolytische frequentie tijdens verschillende delen van een experiment vereist correctie voor CO _2.

Om de glycolytische snelheid van cellen waarbij de koers van extracellulaire aanzuring meten, is het noodzakelijk om de pH veranderingen omzetten Veranderingen H ⁺ gegenereerd, en de extracellulaire verzuring van CO ₂ vrijkomt bij de werking van de citroenzuurcyclus aftrekken. We beschrijven hier een eenvoudige methode voor het meten van de extracellulaire proton productiesnelheid (van extracellulaire veranderingen in pH en de gekalibreerde bufferend vermogen van het testmedium) en CO ₂ productie (van extracellulaire veranderingen in O ₂ concentratie) en demonstreren hoe glycolytische berekenen met behulp van deze metingen.

Deze methode sterkte ens het nut van extracellulaire verzuring meting door het te gebruiken om goed te berekenen glycolytisch tarief zoals gedefinieerd door lactaat productie. Zonder correctie voor respiratoire CO ₂ (of directe meting van lactaat), is het onmogelijk te bepalen of en in welke mate de totale verzuringssnelheid weerspiegelt glycolytische rate, verwarren de interpretatie van experimenten die de totale extracellulaire aanzuring als een directe meting van lactaat productie.

BEREKENINGEN

CO ₂ en lactaat zijn, binnen de experimentele fout, de enige twee bijdragen aan extracellulaire zuurproductie, gebaseerd op experimenten met myoblastcellen ^6. Daarom kan de snelheid van de totale extracellulaire verzuring (PPR, proton productie tarief) worden gedefinieerd als:

PPR _tot = PPR _resp + PPR _glyc vergelijking 1

. _content "> waarbij tot = totaal; resp = luchtwegen; glyc = glycolytisch glycolytisch PPR is dus:

PPR _glyc = PPR _tot - PPR _resp Vergelijking 2

Hier,

PPR _tot = ECAR _tot / BP Vergelijking 3

waarbij ECAR = extracellulair aanzuursnelheid (mijl / min), en BP = buffering vermogen (mijl / pmol H ⁺ in 7 ui), terwijl

PPR _resp = (10 ^{pH-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-pk ₁₎₎} (max H ⁺ / _O 2) (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} Vergelijking 4

waarbij K = ₁ combined evenwichtsconstante CO ₂ hydratatie en dissociatie te HCO ₃ ^- + H ^+; max H ⁺ / O ₂ = the CO ₂ afgeleide aanzuren van een bepaalde metabole transformatie zoals complete oxidatie van ^glucose-6; OCR = zuurstofverbruik rate (pmol _O 2 / min), en OCR _{rot / myx} = niet-mitochondriale OCR.

Vergelijking 4 isolaten mitochondriale OCR door het aftrekken van niet-mitochondriale OCR (gedefinieerd als OCR die bestand is tegen de mitochondriale respiratoire vergiften rotenon en myxothiazol) en verklaart de maximale H ⁺ geproduceerd per O ₂ verbruikt voor elk substraat (max H ⁺ / O ₂ ) (zie ^6), alsmede het percentage CO ₂ die tot H ⁺ bij de experimentele temperatuur en pH (10 ^{pH-pK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-pK _1).} Voor de volledige oxidatie van glucose, mitochondriale Oxygen Consumptie Rate (OCR) exact gelijk is aan de snelheid van CO ₂ productie. In het omsloten testvolume extracellulair flux meting CO ₂ producerend door ademhaling blijft opgesloten in de test medium. De meeste gevangen CO ₂ wordt gehydrateerd H ₂ CO _3, welke vervolgens dissocieert tot HCO ₃ ^- + H ^+. Een kleine fractie opgelost blijft, maar niet gehydrateerd, en een klein deel is gehydrateerd, maar niet gedissocieerd zoals thermodynamisch bepaald door de gecombineerde evenwichtsconstante CO ₂ hydratatie en dissociatie te HCO ₃ ^- + H ⁺ bij experimentele temperatuur (37 ° C) en pH (~ 7.4).

Dus de volledige vergelijking voor het berekenen PPR _g door het aftrekken van _resp PPR PPR is _tot:

PPR _glyc = ECAR _tot / BP - (10 ^{pH-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-pk ₁₎₎} (max H ⁺ / _O 2) (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} Vergelijking 5

ikn Zo snelheden van ademhaling en glycolyse, alsmede bijbehorende ATP productiesnelheden kunnen kwantitatief worden bepaald uit eenvoudige metingen (zuurstofverbruik, de extracellulaire zuurgraad, buffercapaciteit) en invoer of berekening van andere noodzakelijke waarden (H ⁺ / O ₂ , P / O en de evenwichtsconstante K ₁₎ ^6. De hier beschreven experiment een uitbreiding van standaard technieken voor het gebruik van de extracellulaire Flux Analyzer zoals Seahorse XF24 ^10,11; voor andere extracellulaire flux meting formaten (bijv XF ^e 96, of XFP), moeten alle volgende volumes op passende wijze worden geschaald.

De bufferende vermogen van de voedingsbodem kan worden gemeten door constructie van een standaardkromme rechtstreeks in het extracellulaire flux platform of afzonderlijk met een gekalibreerde pH-sonde. Hier, drie opties voor het meten bufferen van de extracellulaire flux testmedium worden opgegeven met behulp van alle injectiop de poorten van de extracellulaire flux analyser met celvrije monsterputjes, of met alleen de laatste injectie haven in-cel met putten (deel 1) of met behulp van een externe pH-meting (paragraaf 2). Zie de bijgevoegde spreadsheet voor de volledige berekening van voorbeeldgegevens.

Om buffering stroom met de pH-detectie vermogen van de extracellulaire flux instrument meet, is het veiligste celvrije putjes om signaalverloop minimaliseren. Binnen het fout bestaat geen statistisch verschil tussen celvrij en celbevattende putjes bij het uitvoeren van deze meting (gegevens niet getoond). Opmerking: De variatie in stap 1.7 beschreven draagt ​​het voordeel van de verantwoording van eventuele wijzigingen op toegevoegde bufferende verbindingen of door de aanwezigheid van cellen verleende het nadeel luidruchtiger signaal. Zoals hierboven vermeld, werden geen significante verschillen gevonden in de berekende bufferende vermogen tussen het celvrije ontwerp getoond in Tabel 1 ende post-experiment ontwerp in tabel 2 onder de hier beschreven experimentele omstandigheden.

Bovendien, over kleine ApH bereiken (<0,4 eenheden; experimenteel best beperkt tot 0,2 eenheden), de lineaire helling verkregen door het uitzetten van Δ mph / pmol H ⁺ adequaat benadert de logaritmische relatie tussen ApH en [H ^+]. De helling van deze standaard curve geeft daarom het bufferend vermogen van het testmedium te testen op pH / nmol H ⁺ in 7 pi of Mph / pmol H ⁺ van 7 pl. We raden toenemende medium buffering macht of afnemende celdichtheid voor monsters die een 0,2 pH-eenheid veranderen tijdens de meettijd overschrijden. De meettijd kan ook worden verlaagd, maar dit kan de steady state aanzuursnelheid verkorten en fouten te introduceren in het tarief berekening.

Protocol

1. Meten Buffering Macht in een extracellulaire Flux Instrument: Twee Variaties

OPMERKING: de berekeningen en methoden hier beschreven werden ontwikkeld met behulp van een extracellulaire Flux Analyzer. Voor de andere instrumenten, moet de meting volume op passende wijze worden geschaald.

1. Bereid 0,1 M standaard HCl in water met behulp van HCl concentraat (zie materialen en apparatuur) volgens de instructies van de fabrikant.
   Opmerking: Een rekenvoorbeeld voorbereidende HCl injecties voor gebruik in alle vier injectieopeningen is weergegeven in tabel 1:

Tabel 1. Opeenvolgende HCl injecties in een extracellulaire flux test goed.

2. Bereid verdunningen van het HCl standaard in het medium te worden getest zoals in tabel 1 voor het aantal technische repliceert dat Carried in één plaat, plus één toe te staan ​​voor het pipetteren fout, bijvoorbeeld voor vier technische replica van de haven Een injectie, bereiden een voorraad (1,1 pi x 5) 0,1 M HCl in (48,9 pi x 5) test medium.
3. Verdeel 50 ul in elk poort A van de meting sonde cartridge. Herhaal deze procedure voor overige poorten B, C en D.
4. Run een extracellulair flux assay ¹⁰ met een standaard kalibratie cyclus, gevolgd door twee cycli van [2 min mix, 1 min wachten, en 5 min meten] voor elk van de vier poort toevoegingen (zie figuur 2).
   1. Programmeer het experiment boven in het instrument software volgens de instructies van de software. Laad de voorbereide cartridge in de machine en voer de kalibratie volgens de software-instructies.
   2. Wanneer u wordt gevraagd door het programma, verwijder de-kalibrant met plaat en plaats de plaat met test medium in elk putje in het instrument; het programma voort.
5. U zingen het gemiddelde van 8-10 gegevenspunten verkregen bij steady state (meestal de laatste 8-10 punten) van voor en na elke haven Bovendien berekent de (cumulatief) verschil in pH (ApH) veroorzaakt door elke injectie zuur di.
6. Plot ApH tegen nmol H ⁺ in de 7 pl volume gevangen door de meetsonde. De lineaire helling is de buffering vermogen (BP) in mph / pmol H ^+.
7. Alternatief stappen 1,2-1,3, voeren de ApH metingen na een test waarin poorten A, B en C worden gebruikt voor het uitvoeren van een experiment, gevolgd door een injectie HCl in Port D. Zoals in tabel 2, zijn vier technische repliceert gebruikt om elk punt van een 5-punts standaardcurve in het 20 experimentele putjes (exclusief de vier achtergrond temperatuurcorrectie putjes) van de extracellulaire flux testplaat genereren.

53464table2.jpg "/>
Tabel 2. Single HCl injectie in een extracellulaire flux test goed.

2. Meten buffer vermogen Gebruik van een externe pH Meter

Opmerking: Om de buffer kracht van een medium een ​​externe pH-sonde meet, kalibreert de sonde bij 37 ° C en deze temperatuur gedurende alle reagentia tijdens het experiment te handhaven.

1. Bereid 0,1 M standaard HCl in water met behulp van HCl concentraat volgens instructies van de fabrikant.
2. Warm pH sonde, pH normen, het testmedium waarvan buffering vermogen wordt gemeten, en 0,1 M HCl tot 37 ° C in een waterbad.
3. Kalibreer pH-probe bij 37 ° C volgens de instructies van de fabrikant. Handhaaf alle reagentia bij 37 ° C gedurende de test met behulp van een warmteplaat of waterbad.
4. Aliquot 10 ml van de voedingsbodem in een kleine beker of conische buis. Monitor pH continu met behulp van een ondergedompeld pH-sonde.
5. Voeg 0,1 M HCI om het alszeggen medium in 10-20 pl porties.
   1. Zorgen voor het mengen met behulp van een roerstaafje of door het handmatig wervelende de container na elke zuur toevoeging.
   2. Wacht een paar seconden voor de pH-meting te stabiliseren, dan nemen de pH na elke toevoeging.
   3. Zoals aangetoond in Tabel 3, maakt een voldoende aanvullingen op nauwkeurige helling berekening waarborgen en de pH verwacht tijdens het experiment te dekken.

Tabel 3. Meten buffering energiegebruikende een pH-meter. De gegevens geven een typisch experiment zes 20 gl toevoegingen van 0,1 M HCl.

6. Plot ApH tegen nmol H ⁺ toegevoegd per 7 pl, waardoor een lineaire helling die de bufferende vermogen (figuur 1) representeert.

Figuur 1. Bepalen buffering macht. HCl standaardkromme gemeten zoals in Tabel 1, Tabel 2 of (hier) zoals in tabel 3. De helling van de lineaire curve fit geeft het bufferende vermogen (pH / nmol H ⁺ in 7 ui). Elk punt staat gemiddelde ± SEM van n = 9 technische herhalingen.

7. Zodra de buffering stroom is bekend door middel van methode 1 of 2 hierboven, zet de ECAR signaal (mijl / min) naar PPR (pmol H ⁺ / min / ug eiwit) door te delen ECAR door buffering vermogen (BP) (mijl / pmol H ⁺⁾ en schalen om het eiwitgehalte van elk putje:
   PPR _tot (pmol H ⁺ / min / ug eiwit) = ECAR (mijl / min) / BP (mijl / pmol H ⁺ in 7 pl) / eiwit per putje (ug) Vergelijking 6
8. U kunt ook gebruik maken van dezelfde experimenten in methodes 1 of 2 om de buffercapaciteit (BC) waarde die door het instrument software berekent automatisch PPR tijdens het verzamelen van gegevens te berekenen.
   NB: Het instrument handleiding ¹² (pagina 107) geeft gedetailleerde informatie over het berekenen en het gebruik van buffercapaciteit, waarbij BC wordt beschreven als
   BC (mol / L) = mol H ⁺ / (ApH x buffer volume (L)) Vergelijking 7
   Opmerking: De buffercapaciteit zoals gedefinieerd in vergelijking 7 kan worden berekend in het instrument of externe pH-probe die hierboven is beschreven. Conversie tussen buffering macht en buffercapaciteit is eenvoudig te doen (zie bijgevoegde spreadsheet):
   BC = 1 x 10 ^-9 / BP ((mijl / pmol H ⁺ in 7 pl) / 7 pl) Vergelijking 8
   LET OP: Als bekend voorafgaand aan het uitvoeren van de test, de buffercapaciteit kan worden rechtstreeks in de software instrument tijdens de experimentele opstelling ingevoerd.
9. Breng deze procedure en de bovenstaande berekeningen gebruikt om de meeste gebruikelijke buffersystemen, zoals beschreven in voorgaande publicatie ^6.
   OPMERKING: Tabel 4 somt de buffering kracht en de buffercapaciteit van verschillende conventionele media.

Tabel 4. buffer kracht en de buffercapaciteit van de geselecteerde media.

3. Het uitvoeren van een extracellulaire Flux Bepaling gebruiken C2C12 myoblastcellen

Opmerking: In stap 3.4.3, waren er geen verschillen waargenomen in CO ₂ -afgeleide zuurproductie afhankelijk van de aanwezigheid van koolzuuranhydrase in C2C12 cultuur, wat suggereert dat de aanwezigheid niet vereist voor volledige omzetting van CO ₂ tot HCO ₃ ^- + H ^+. Echter, empirisch deze testen in verschillende experimentele systemen wordt aanbevolen voor het OMitting koolzuuranhydrase.

1. Culture muis C2C12-myoblasten ¹³ bij 37 ° C onder 95% lucht / 5% _CO2 in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 11,1 mM glucose, 2 mM glutamine, 10% v / v foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
2. 24 uur voorafgaande aan assay plaat / zaadcellen in 100 ul van hetzelfde kweekmedium bij 20.000 cellen / putje in een 24-well polystyreen extracellulaire flux testplaat (zie Materialen en Werkwijzen) zonder extra coating.
3. Verdunnen oligomycin, FCCP en rotenone plus myxothiazol en HCl (optioneel) tot 10x uiteindelijke concentratie in Krebs Ringer Fosfaat HEPES (KRPH) test medium (2 mM HEPES, 136 mM NaCl, 2 mM NaH ₂ PO _4, 3,7 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 1,5 mM _CaCl2, 0,1% w / v vetzuur-vrij runderserumalbumine, pH 7,4 bij 37 ° C).
4. Celpreparaat
   1. 30 min vóór de test was hechtende cellen drie keer door opzuigen om gently Verwijder het medium uit de put en dan langzaam toevoegen van 500 pi KRPH.
   2. Incubeer cellen na de derde wasstap bij 37 ° C onder lucht (niet bij 5% _CO2, waarbij de pH van het bicarbonaat-vrij medium zal veranderen).
   3. Bij test start, vervang KRPH in putjes met 500 ui verse KRPH met 500 U / ml koolzuuranhydrase en ofwel glucose (10 mm) of alleen medium, zonder extra substraat.
5. Laden van de sensorcartridge
   1. Pipet 50 ul porties van elk 10x verbinding bereid in stap 3.3 in de cartridge havens van een extracellulaire flux sensorcartridge als volgt (uiteindelijke concentraties in de test goed gegeven): Poort A: 2 ug / ml oligomycin, Port B: 0,5 uM FCCP, Port C : 1 uM rotenon, 1 uM myxothiazol, Port D: HCl (als het uitvoeren van een in-assay zuur calibratie zoals hierboven en in tabel 2 beschreven).
      NB: voor het doel van volledige respiratoire keten remming hier beschreven, 1 uM mijnxothiazol kunnen onderling verwisseld worden met 1 uM antimycin A.
6. Extracellulaire flux test:
   1. Voer een standaard extracellulaire flux gekwantificeerd door respiratoire controle zoals beschreven in ^10.

Opmerking: Voor elk segment van het experiment, bepalen de mix, wacht en meettijden gewenst, evenals het aantal cycli per segment.

Opmerking: De gegevens in Tabel 5 werden verzameld gedurende twee assay cycli 2 min mix, 1 min wachten, en 5 min maat voor elk segment, drie assay cycli optreedt na het poort D toevoeging van verschillende hoeveelheden HCl (kalibratie bufferen macht zoals in tabel 2).

Tabel 5. Extracellulaire flux assay configuratie.

4. Measuring End-point lactaatconcentratie

Opmerking: De indirecte assay beschreven in een aantal verschillende systeem eindpunt lactaat concentratie aan het einde van een extracellulair flux experiment kan direct in een gebruikelijke 96-putjesplaat worden bepaald valideren door het meten van de initiële snelheid (meer dan 2 min) vermindering van NAD ⁺ NADH → gekatalyseerd door lactaatdehydrogenase, in detail beschreven in onze eerdere publicatie ^6. Voor de gepresenteerde in Representatieve resultaten van gegevens, het eindpunt lactaatconcentratie in glucose bevattend test putten was ~ 40 uM.

1. Bereid 2x hydrazine medium: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hydrazine, pH 9,8 bij 22 ° C). Onmiddellijk voor assay start, voeg NAD ⁺ tot 4 mM en lactaat dehydrogenase (LDH) met 40 U / ml. Uiteindelijke testmedium samenstelling (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM hydrazine, 2 mM NAD ^+, 20 U / ml LDH.
2. Onmiddellijk na de extracellulaire flux test, verwijder 100pl assay medium uit elk putje van de extracellulaire flux testplaat overgebracht in een putje van een ondoorzichtige (zwart) 96-wells plaat.
3. Aan elk monster goed, voeg 100 ul 2x hydrazine medium.
4. Onmiddellijk laden van de plaat in een microplaataflezer en beginnen met het toezicht op NADH fluorescentie bij 340 nm excitatie / 460 nm emissie.
5. Noteer de initiële snelheid gedurende ongeveer 2 min.
6. Voer een soortgelijk experiment met een standaardkromme te construeren door het uitzetten van de initiële snelheid tegen de lactaat concentratie toegevoegd lactaatconcentraties vanaf 0 tot 50 uM.
7. Bereken lactaatconcentratie in elke experimentele goed gebruik van de standaard curve.

5. Het meten van het eiwitgehalte

1. Verwijder resterende test medium uit elk putje van de testplaat.
2. Was putjes drie keer met 250 ul-BSA vrije KRPH, voorzichtig om het loskomen van de cellen van de bodem en het oppervlak te minimaliseren.
3. Voeg 25 ul RIPA lysismedium (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% v / v Triton X-100, 0,5% w / v natrium deoxycholaat, 0,1% v / v SDS, pH 7,4 bij 22 ° C) aan elk putje van de testplaat.
4. Incubeer plaat op ijs gedurende 30 min.
5. Schud plaat op een plaat schudder bij 1200 rpm gedurende 5 min.
6. Meet eiwitconcentratie met standaardmethoden, bijvoorbeeld door BCA assay, zodat de lysisbuffer samenstelling verenigbaar is met de meetmethode. Het eiwitgehalte in het experiment in Figuur 2 is ~ 4 ug / putje.

Resultaten

Figuur 2 toont de ruwe gegevens voor een typisch experiment. De laatste 10 meetpunten van de point-to-point registratie van zowel OCR en pH (gearceerde verticale balken) werden gebruikt voor de berekeningen. Aanvankelijke bezorgdheid dat de gemiddelde waarde (middelste punt meting) van elke test cyclus zou niet voldoende resolutie van tarief voor een nauwkeurige berekening, vooral omdat er bleek een lichte vertraging tussen de haven naast en steady state aanzuursnelheid zijn, werden niet bewaarheid, aangezien dit lijkt niet bijdragen tot rekenfout (niet getoond). Een defect juiste buffercapaciteit in experimentele opstelling wordt ingevoerd, PPR kan rechtstreeks uit de collectie instrument uitlezen van gegevens gelezen door het weergeven van de PPR output in de instrumentsoftware of de PC-compatibel formaat beschikbaar als een van de gegevensuitvoer instellingen.

ftp_upload / 53.464 / 53464fig2.jpg "/>
Figuur 2. Representatieve extracellulaire fluxsporen O ₂ en H ^+. OCR en pH sporen van het voorbeeld experiment in Tabel 5, bevattende 10 mM glucose bij test start. Poort D hadden verschillende HCl concentraties kalibratie bufferende vermogen (niet in die gemiddelde sporen weergegeven). Gegevens uit eerdere publicatie ^6. Elk punt staat gemiddelde ± SEM van n = 8 biologische herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Data-analyse van representatieve resultaten

De in tabel 6 en ontvangen als bijlage spreadsheet, kunnen datawaarden van afzonderlijke putjes in de getoonde gele headers zuilen worden ingevoerd. Alle zes kolommen het recht zijn berekend op basis van deze data. Het voorbeeld in tabel 6 toont de berekening van PPR _resp en PPR _glyc behulp ECAR en OCR gegevens van afzonderlijke putjes van de natieve omstandigheden met of zonder toegevoegde glucose, vóór toevoeging van poort A oligomycin. Technische herhalingen aan elke biologisch preparaat worden gewoonlijk gemiddeld om enkele waarden van de uitvoeren in de laatste vier kolommen oplevert, gegevens uit verschillende biologische preparaten worden gemiddeld passende voortplanting van foutstatistieken BP en deze vier waarden.

Tabel 6. Berekening van de luchtwegen en glycolytische verzuring. Kolommen in het geel te geven waarden worden ingevoerd van de berekening (bijvoorbeeld, BP, max H ⁺ / O _2), of uit het verzamelen van gegevens (bijvoorbeeld ECAR _tot, OCR). ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken |. Klik hier om deze tabel te downloaden als een Excel-spreadsheet .

Bijdragen van de glycolyse en de ademhaling te PPR na correctie

Figuur 3 toont de grafische weergave van de gegevens berekend als in tabel 6 voor inheemse tarieven van de glycolytische en respiratoire verzuring, tarieven volgende oligomycin toevoeging (Port A), en de tarieven volgende FCCP toevoeging (Port B). Deze gegevens tonen duidelijk aan hoe de verhoudingen van respiratoire en glycolytische aanzuren verandering keuze substraat (glucose versus controle (CTL) met geen toegevoegd) en mitochondriale verlenen (natieve functie vs. farmacologisch veranderde functie).

">
Figuur 3. Proton productie (PPR) van glycolytische en respiratoire bronnen. PPR van de ademhaling (open gedeelten) en glycolyse (gevuld porties) van C2C12 cellen berekend met behulp van Vergelijking 5 met toegevoegde glucose (drie links bars) of zonder toegevoegde glucose (drie rechts bars). Gegevens van ^6. Alle gegevens representeren gemiddelde ± SEM van n = 8 biologische herhalingen.

Discussie

Extracellulaire verzuring is een gemakkelijk te meten indicatie van cellulaire stofwisseling. Correct bepalen van de snelheid van cellulaire glycolyse (zoals gedefinieerd door lactaat productie) is het essentieel om het bufferend vermogen van het testmedium kennen, en de extracellulaire flux meting van het zuurstofverbruik en verzuring omzetten productiesnelheden proton. Door het uitvoeren van deze berekening, kan de verzuring van CO ₂ vrij in de citroenzuurcyclus worden afgetrokken, waardoor de verzuring als gevolg van lactaat productie.

De meerdere verschillende manieren hier gegeven buffering vermogen maat voor deze correctie dragen verschillende voor- en nadelen. Externe meting met een pH-sonde zeer nauwkeurig en reproduceerbaar, maar kunnen kleine verschillen in pH detectie geïntroduceerd door de fluoroforen bevat binnen de testplaat, de toevoeging van verbindingen tijdens de test, of de aanwezigheid van t niet weerspiegelenHij cellen zelf. De in-plaat pH-metingen te pakken deze problemen, maar ook de invoering van een verschillende mate van experimentele noise.

Het CO ₂ correctie ECAR maakt het eerst eenduidig ​​en kwantitatieve berekening van glycolytische rate en onthult variatie in respiratoire en glycolytische bijdrage aan de totale ECAR tijdens een experiment. Met behulp van Vergelijking 5 en de metingen van OCR, ECAR en bufferen van de macht, kan glycolytische tarief worden berekend met behulp van de eenvoudige spreadsheet verstrekt (Tabel 6). Dit tarief kan worden geverifieerd door post-hoc lactaat meting desgewenst ^6. In cellen waarin de pentosefosfaatroute zeer actief, kan het gebruik van route remmers zoals 6-aminonicotinamide nuttig zijn glycolytische rate isoleren. Berekening van de bijdragen van zowel de CO ₂ ^- en-lactaat afgeleid H ⁺ van de totale gemeten Extra Cellulaire aanzuursnelheid en zuurstof meterstandion Rate is een waardevol instrument voor het gebruik van extracellulaire flux data naar krachtige en kwantitatieve uitspraken over de metabolische activiteit te maken.

Volgens de hieronder beschreven procedures, waaronder diverse modificaties voor het meten buffering kracht en optimaliseren van de extracellulaire flux-experiment voor de cellen in onderzoek en data gewenst kan de snelheid van glycolyse in intacte cellen worden gekwantificeerd onder uiteenlopende experimentele omstandigheden. Deze werkwijze is beperkt tot cellen die kunnen groeien in hechtende kweek op (of cellen of organellen die kan worden gevolgd) een polystyreen oppervlak. Het is het meest betrouwbaar wanneer gekweekte cellen homogeen en confluent, maar toch bruikbare gegevens worden verkregen over een reeks van deze voorwaarden. De berekeningen vereisen enige kennis van het metabolisme van de cellen, max H ⁺ / O ₂ varieert van 0,65 om 1,0 voor volledige oxidatie van verschillende substraten en voor partiële oxidatie ⁶ echter, indien de cellen known om glucose oxideren, een waarde van 1,0 kan worden aangenomen.

Hoewel alle metabole karakterisering relevant kan deze werkwijze bijzonder nuttig zijn wanneer gebruikt in systemen waarin een verschuiving tussen respiratoire en glycolytische stofwisseling handhaven cellulaire ATP voorziening is een cruciale fenotype, waaronder de karakterisering van stamcellen en tumor afgeleide kankercellen. Inzicht stofwisseling veranderingen in deze en andere contexten zal een hogere mate van verfijning en nauwkeurigheid in het experimentele ontwerp en de analyse van deze celtypen mogelijk maken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Pherastar FS	BMG	n/a	microplate reader
Seahorse XF-24	Seahorse Bioscience	n/a	extracellulair flux instrument
Seahorse XF assay plate	Seahorse Bioscience	V7-PS	verbruiksartikel
XF Calibrant	Seahorse Bioscience	100840-000	oplossing
HCl standaard	Sigma	38280	chemisch product
oligomycine	Sigma	O4876	chemisch product
FCCP	Sigma	C2920	chemisch product
Rotenone	Sigma	R8875	chemisch product
Myxothiazol	Sigma	T5580	chemisch product
DMEM	Corning	10-013-CV	mediumcomponent
FBS	Corning	35-010-CV	mediumcomponent
penicilline/streptomycine	Corning	30-002-CI	mediumcomponent
koolzuuranhydrase	Sigma	C2624	chemisch product
96-wells assay plate	Corning	CLS3991	verbruiksartikel
NAD+	Sigma	N7004	chemisch product
LDH	Sigma	L1254	chemisch product