Methodenartikel

Voorbereiding van de thermoresponsieve nanogestructureerde oppervlakken voor Tissue Engineering

7.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53465

⸱

1 maart 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Tokyo University of Science, 2Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Nanoschalige zee-eilandoppervlakken, samengesteld uit thermoresponsieve blokcopolymeren, werden vervaardigd door de Langmuir-Schaefer-methode voor het controleren van spontane celhechting en loslating. Zowel de bereiding van het oppervlak als de hechting en loslating van cellen op het oppervlak werden gevisualiseerd.

Samenvatting

Thermoresponsieve poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-geïmmobiliseerde oppervlakken voor het regelen van celadhesie en loslating werden vervaardigd door de Langmuir-Schaefer-methode. Amfifiele blokcopolymeren samengesteld uit polystyreen en PIPAAm (St-IPAAms) werden gesynthetiseerd door middel van reversibele additie-fragmentatie ketenoverdracht (RAFT) radicaalpolymerisatie. Een chloroformoplossing van St-IPAAm-moleculen werd voorzichtig in een Langmuir-trogapparaat gedruppeld en beide barrières van het apparaat werden horizontaal bewogen om de film te comprimeren en de dichtheid te regelen. Vervolgens werd de St-IPAAm Langmuir-film horizontaal overgebracht op een hydrofoob gemodificeerde glazen substraat door een oppervlaktegefixeerd apparaat. Atomaire krachtmicroscoopbeelden toonden duidelijk nanoscale zee-eilandstructuren op het oppervlak. De sterkte, snelheid en kwaliteit van celadhesie en loslating op het bereide oppervlak werden gemoduleerd door veranderingen in temperatuur binnen het onderste kritische oplostemperatuurbereik van PIPAAm-moleculen. Bovendien werd een tweedimensionale celstructuur (celblad) succesvol hersteld op de geoptimaliseerde oppervlakken. Deze unieke PIPAAm-oppervlakken kunnen nuttig zijn voor het regelen van de sterkte van celadhesie en loslating.

Inleiding

Nanogestructureerde oppervlakken hebben onlangs trok veel aandacht vanwege hun verschillende mogelijke toepassingen, inclusief patronen, celkweek, het schoonmaken en het oppervlak switching. Bijvoorbeeld superhydrofobe oppervlakken geïnspireerd door de nanostructuur van de lotusblad en andere reagerende oppervlakken kunnen reageren op externe stimuli 1-4.

De Langmuir film is een van de meest bestudeerde polymeercoating. Een Langmuir film wordt gevormd door het droppen van amfifiele moleculen op een lucht-water-interface 5-8. De film kan vervolgens op een vast oppervlak worden overgedragen door fysische of chemische adsorptie, en de moleculaire conformatie op een stevige ondergrond kan worden gecontroleerd met behulp van verticale en horizontale overdracht methoden 9-12. De dichtheid van de Langmuir film kan nauwkeurig worden geregeld door het comprimeren van de lucht-water grensvlak. Onlangs heeft deze methode ook effectief gebleken voor het vervaardigen van nanometerschaal zee-eiland structures door gebruik amfifiele blokcopolymeren. De nanostructuren worden verondersteld te bestaan ​​uit een kern van hydrofobe segmenten en een schil van hydrofiele segmenten 13-17. Bovendien is het aantal nanostructuren op een oppervlak geregeld door regeling van de oppervlakte per molecuul (A m) van het blokcopolymeer bij het ​​grensvlak.

We hebben ons gericht op een originele, unieke scaffold-free tissue engineering aanpak, cellaag techniek, met behulp van een op temperatuur reagerende cultuur oppervlak. De ontwikkelde technologie is toegepast op regeneratieve therapieën voor verschillende organen 18. Een temperatuur reagerende kweekoppervlak werd vervaardigd door enten poly (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), een temperatuur reagerende molecuul op een oppervlak 19-27. PIPAAm en zijn copolymeren vertonen een lagere kritische oplossing temperatuur (LCST) in waterige media bij temperaturen rond de 32 ° C. De cultuur oppervlak vertoonde ook een temperatuur reagerende wisselspanning is tussen hydrofobiciteit en hydrofiliciteit. Bij 37 ° C, werd de PIPAAm-geënte oppervlak hydrofoob en cellen gemakkelijk bevestigd en verspreid over het oppervlak alsook conventionele weefselkweek polystyreen. Wanneer de temperatuur werd verlaagd tot 20 ° C, werd het oppervlak hydrofiel, en cellen spontaan los van het oppervlak. Daarom kon gekweekte confluente cellen op het oppervlak worden geoogst als een intacte blad door de temperatuur te veranderen. Deze cel adhesie en onthechting eigenschappen werden ook weergegeven door een oppervlak vervaardigd door Langmuir film coating voor laboratorium demonstratie 26, 27. Een Langmuir film van blokcopolymeren bestaande uit polystyreen (P (St)) en PIPAAm (St-IPAAm) werd vervaardigd. De Langmuir film met een Bk meter kan horizontaal worden overgedragen aan een hydrofoob gemodificeerde glassubstraat. Bovendien celadhesie aan en onthechting van het voorbereide oppervlak in reactie op temperatuur geëvalueerd.

_content "> We beschrijven protocollen voor de productie van een nanogestructureerde Langmuir film samengesteld uit warmte reagerende amfifiele blokcopolymeren op een glazen substraat. Onze werkwijze kan een effectieve fabricatietechniek voor organische nanofilms op verschillende gebieden van oppervlaktekunde en kunnen meer vergemakkelijken effectieve controle van celadhesie en op spontane loslating van het oppervlak.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Synthese van polystyreen blok poly (N -isopropylacrylamide) door twee stappen Reversible Addition-fragmentatie Chain Transfer (VLOT) radicale polymerisatie

  1. Ontbinden styreen (153,6 mmol), 4-cyaan-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic zuur (ECT; 0,2 mmol) en 4,4'-azobis (4-cyanovaleriaanzuur) (ACVA; 0,04 mmol) in 40 ml 1, 4-dioxaan. Bevries de oplossing in vloeibare stikstof onder vacuüm gedurende 15-20 min de reactieve species te verwijderen en geleidelijk ontdooien bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de oplossing volledig is ontdooid en herhaal deze vries-pomp-ontdooi ontgassingscyclus drie keer.
  2. Haal de polystyreen (PSt) (Mw: 13.500) als macro RAFT middel door polymerisatie bij 70 ° C gedurende 15 uur in een oliebad.
  3. Precipitaat PSt macro RAFT middel met 800 ml ether en droog in vacuo.
  4. Ontbinden IPAAm monomeer (4,32 mmol), PSt macro RAFT middel (0,022 mmol) en ACVA (0,004 mmol) in 4 ml 1,4-dioxaan.
  5. Verwijderende zuurstof in de oplossing van de vries-pomp-ontdooi ontgassingscycli zoals vermeld in stap 1,1.
  6. Voer een polymerisatie bij 70 ° C gedurende 15 uur in een oliebad na ontgassen. Verkrijgen gesynthetiseerd St-IPAAm molecule (Mw: 32.800) op dezelfde wijze als de PSt macro RAFT middel.

2. Voorbereiding van Silanized hydrofobe Modified glassubstraten

  1. Wassen glassubstraten (24 mm x 50 mm) met een overmaat van aceton en ethanol en ultrasone trillingen gedurende 5 min verontreinigingen te verwijderen.
  2. Droog de substraten in een oven bij 65 ° C gedurende 30 minuten. Gebruik vervolgens zuurstofplasma (400 W, 3 min) aan de oppervlakken van de substraten bij KT geactiveerd.
  3. Dompel de substraten in tolueen die 1% hexyltrimethoxysilaan nacht bij RT om het substraat silaniseren.
  4. Was de gesilaniseerde substraten in tolueen en onder te dompelen in aceton gedurende 30 min om niet-gereageerd agenten te verwijderen.
  5. Ontlaten substraten gedurende 2 uur bij 110 ° C grondig immobiliseren de sjouw gezicht.
  6. Snij de gesilaniseerde substraten door een glassnijder tot 25 mm x 24 mm aan de celkweek gerechten (schotel size: φ35 mm) passen.

3. Voorbereiding van Langmuir Films en-Film overgebracht Surface

  1. Plaats de Langmuir film instrument in een kast om de ophoping van stof te voorkomen.
  2. Was de Langmuir trog (grootte: 580 mm x 145 mm) en barrières met gedestilleerd water en ethanol om verontreinigingen te verwijderen.
  3. Droog de goot en barrières door af te vegen met een handdoek zonder pluizen. Vul dan het dieptepunt met ongeveer 110 ml gedestilleerd water, en zet de barrières aan beide zijden van de trog. Merk op dat gedestilleerd water moet worden toegevoegd zonder morsen in de volgende stappen 3,5-3,13.
  4. Verhit een platina Wilhelmy plaat (perimeter: 39,24 mm) voor het bewaken van de oppervlaktespanning met een gasbrander totdat de plaat wordt rood en daarna wassen met gedestilleerd water om verontreinigingen te verwijderen. Hang de Wilhelmy plaat op een draad verbonden aande oppervlakte-druk-meetinstrument.
  5. Het oppervlak nul-druk-meetinstrument overeenkomstig protocol van de fabrikant. Druk de lucht-water interface op de bak door de barrières aan beide zijden van de goot tot de interface er ongeveer 50 cm 2 zonder druppels polymeer.
  6. Zuig kleine verontreinigingen tot het oppervlak druk is bijna 0 mN / m.
  7. Verplaats de barrières aan beide kanten, en voeg gedestilleerd water om te compenseren voor de daling van gedistilleerd water uit stap 3.6.
  8. Los 5 mg van het gesynthetiseerde St-IPAAm molecuul in 5 ml van een oplossing ontwikkeling chloroform.
    Opmerking: Dichloormethaan of tolueen kunnen ook worden toegepast als het oplosmiddel.
  9. Voorzichtig laten vallen 27 ul van St-IPAAm opgelost in chloroform op de trog met een micro-of micropipet.
  10. Na wachten op 5 min naar volledige verdamping van chloroform toe, bewegen beide barrières horizontaal naar St-IPAAm molecu comprimerenle aan het grensvlak. Handhaaf compressieverhouding van de barrières bij 0,5 mm / sec tot het doelgebied van 50 cm 2 komt.
    Opmerking: Een snelle compressieverhouding veroorzaakt gebreken in de Langmuir film.
  11. Meet de oppervlaktedruk (π) -A m isothermen met platina Wilhelmy plaat tijdens de compressie volgens het protocol van de fabrikant aan het oppervlak-druk-meetinstrument.
  12. Na het doelgebied grootte bereiken, houden het oppervlak gedurende 5 minuten om de St-IPAAm moleculen te ontspannen; de moleculen niet evenwicht onmiddellijk bereiken na compressie.
  13. Breng de Langmuir film op een hydrofoob gemodificeerd glassubstraat met een overdrachtsinrichting voor 5 min krachtig adsorberen de film. Bevestig de hydrofobe glassubstraat parallel aan het apparaat. Sluit het apparaat aan een uitlijning podium en loodrecht bewegen.
  14. Til het substraat horizontaal met de overdracht apparatuur en droog gedurende 1 dag in een desiccator.

4. het kweken van cellen en het optimaliseren van de Cel Adhesie en Detachement op de Langmuir Film Overgedragen Surface

  1. Om celsuspensies, cultuur runder halsslagader endotheelcellen (BAECs) met weefselkweek polystyreen (TCPS) bereiden eenderde confluentie bij 37 ° C in 5% CO2 en 95% lucht met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U / ml penicilline.
  2. Nadat confluentie is bereikt, behandel BAECs met 3 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 3 min bij 37 ° C in 5% CO2 en 95% lucht.
  3. Deactiveren trypsine-EDTA door toevoeging van 10 ml van het DMEM bevattende 10% FBS, en het verzamelen van de celsuspensie in een 50 ml conische buis.
  4. Centrifugeer bij 120 xg gedurende 5 minuten, en zuig de supernatant. Resuspendeer de cellen met 10 ml van het DMEM.
  5. Plaats de St-IPAAm oppervlakken onder ultraviolet licht op een schone werkbank voor het steriliseren gedurende 5 min.
  6. Zaad van de herstelde cells de St-IPAAm oppervlakken bij een concentratie van 1,0 x 10 4 cellen / cm2 geteld door een wegwerp hemocytometer en observeer de cellen op het oppervlak van een microscoop uitgerust met een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 95% lucht.
    Let op: Steriliseer de St-IPAAm oppervlakken door ultraviolet licht uitgerust om een ​​schone werkbank.
  7. Record time-lapse beelden van hechtende BAECs ongeveer 24,5 uur bij 37 ° C door een fase-contrast microscoop met 10x vergroting. Na BAEC hechting, opnemen detachement van de BAECs van de Sint-IPAAm oppervlak bij 20 ° C gedurende ongeveer 3,5 uur.

5. cellaag Fabrication op de Langmuir Film-overgebracht Surfaces

  1. Cultuur BAECs op dezelfde wijze beschreven in Sectie 4.
  2. Seed totaal 1,0 x 10 5 cellen / cm2 op St-IPAAm oppervlakken en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C in 5% CO2. Confluente BAECs spontaan los bij 20 ° C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Blok-copolymeren bestaande uit polystyreen en poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) met specifieke moleculaire gewichten werden gesynthetiseerd door RAFT radicaalpolymerisatie. ECT bereid als een ketenoverdrachtsmiddel, zoals beschreven in Moad et al. 28. Twee St-IPAAm moleculen van verschillende PIPAAm ketenlengtes gesynthetiseerd en het verkregen blokpolymeren werden gekarakteriseerd door 1H nucleaire magnetische resonantie (NMR) en gelpermea...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een temperatuur reagerende oppervlak werd vervaardigd door de Langmuir-Schaefer-methode, en de oppervlakte-eigenschappen voor celadhesie / onthechting en cellaag herstel werden geoptimaliseerd. Bij gebruik van deze werkwijze voor de vervaardiging van oppervlakken, verschillende stappen zijn kritisch. De moleculaire samenstelling van de St-IPAAm moleculen heeft een groot effect op de oppervlaktestructuur en de stabiliteit van het oppervlak, en daarmee ook op celadhesie en onthechting. Met name dient de St-IPAAm moleculen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs hebben gelijkwaardig bijgedragen aan het schrijven van het manuscript en hebben de uiteindelijke versie goedgekeurd. De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Deze studie werd financieel ondersteund door het Project voor de Ontwikkeling van Innovatiesystemen "Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)" van het Programma voor de Creatie van Innovatiecentra voor Geavanceerd Interdisciplinair Onderzoek van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT), Japan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
N-isopropylacrylamideKohjinGeen catalogusnummer
Azobis(4-cyanovalerinezuur)Wako Pure Chemicals016-19332
StyreenSigma-AldrichS4972
1,3,5-trioxaanSigma-AldrichT81108
1,4-DioxaanWako Pure Chemicals045-24491
DMEMSigma D6429
PBSNakarai11482-15
StreptomycineGIBCO BRL15140-163
PenicillineGIBCO BRL15140-122
Trypsine-EDTASigmaT4174
FBSJapan BioserumJBS-11501
BAECsHealth Science Reserch Resources BankJCRB0099
DekglasjesMatsunami Glass IndustryC024501
AFM NanoScope VVeeco
1H NMR INOVA 400Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPCTosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000Tosoh
Langmuir-Blodgett Depositiebakken KSV InstrumentsKN 2002KSV NIWA Medium bak
Nikon ECLIPSE TE2000-UNikon

Referenties

  1. Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
  2. Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
  3. Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
  4. Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
  5. Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
  6. Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
  7. Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
  8. Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
  9. Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
  10. Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
  11. Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
  12. Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
  13. Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
  14. Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
  15. Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
  16. Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
  17. Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
  18. Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering. Mater. Today. 7 (5), 42-47 (2004).
  19. Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
  20. Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
  21. Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
  22. Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
  23. Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
  24. Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
  25. Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
  26. Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
  27. Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
  28. Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
  29. Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  30. Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
  31. Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Thermoresponsieve oppervlakkenLangmuir Schaefer methodecontrole van celadhesiecontrole van celdetachementherstel van celvellenatoomkrachtmicroscopiepolymeersynthesetemperatuurresponsieve materialen

Gerelateerde artikelen