Een Fast Air-droge Dropping Chromosome Bereidingswijze Geschikt voor vissen in planten

Samenvatting

Er wordt een protocol beschreven voor de bereiding van hoogwaardige mitotische plantenchromosoomuitstrekkingen door een snelle luchtdroog-druppelmethode die geschikt is voor de FISH-detectie van enkele en hoge kopie-DNA-sondes.

Samenvatting

Bereiding van chromosoom spreads is een voorwaarde voor de succesvolle uitvoering van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Voorbereiding van hoogwaardige plantaardige chromosoom spreads is een uitdaging te wijten aan de starre celwand. Eén van de erkende werkwijzen voor de bereiding van plantaardige chromosomen is een zogenaamd druppel preparaat, ook wel drop verspreiding of lucht-droogtechniek. Hier presenteren we een protocol voor de snelle bereiding van mitotische chromosoom spreads geschikt voor de FISH detectie van enkele en hoog kopie DNA-sondes. Deze werkwijze is een verbeterde variant van de luchtdroge neerzetten uitgevoerd onder een relatieve vochtigheid van 50% -55%. Dit protocol omvat een gereduceerd aantal wasstappen van zijn aanvraag eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar. Duidelijke voordelen van deze aanpak zijn goed gespreid, onbeschadigd en tal metafasechromosomen dienen als een perfecte voorwaarde voor een succesvolle FISH analyse. Met behulp van dit protocol verkregen wij hoogwaardige chromOsome spreads en reproduceerbare FISH resultaten voor Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum en Secale cereale.

Inleiding

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een doeltreffend instrument voor de fysieke kaart brengen van enkele en hoog kopie sequenties op het chromosomaal niveau. Voorwaarde is de bereiding van hoge kwaliteit chromosoom spreads. Er is geen algemene chromosoom voorbereiding protocol dat even geschikt voor dier- en plantencellen zou zijn. Bereiding van plantaardige chromosomen is bijzonder uitdagend te wijten aan de starre celwand en diverse cytoplasma consistentie binnen verschillende soorten. Eén van de gunstige werkwijzen voor de bereiding van plantaardige chromosomen is een zogenaamd druppel techniek ook wel drop strooitechniek en air-droogtechniek ^1,2. Deze werkwijze werd eerst geïntroduceerd in 1958 door rothfels en Siminovitch in vitro gekweekt zoogdiercellen ^3. Later Martin et al. ⁴ en Kato et al. ⁵ aangepaste methode voor planten.

Recenter een werkwijze genaamd "SteamDrop &# 39; ontwikkeld dat waterdamp voor de bereiding van niet-overlappende chromosomen ^6. Hoewel de positieve invloed van een hoge luchtvochtigheid was eerder ⁷ waargenomen, 'SteamDrop' levert een gecontroleerde workflow van hoogwaardige chromosoom voorbereiding ^6. De stoombehandeling veroorzaakt rekken chromosomen waarschijnlijk verbonden met een aantal wijzigingen van chromosomale eiwitten. De kwaliteit van de verkregen metafase smeersels is zeer hoog, hoewel behoud van voldoende totale metafase spreads volgende FISH experimenten vereist technische expertise.

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding van de mitotische granen chromosomen die geschikt zijn voor de FISH detectie van enkele en hoog kopie sondes ^5,8. Deze werkwijze is een verbeterde variant van de luchtdroge dropping beschreven door Kato ⁹ uitgevoerd onder relatieve vochtigheid van 50% -55% (figuur 1). Dit protocol omvat een gereduceerd aantalvan wasstappen maken van de toepassing ervan eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar. Met behulp van dit protocol verkregen wij hoogwaardige chromosoom spreads en FISH resultaten voor Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum en Secale cereale.

Protocol

1. Chromosome Voorbereiding

1. Zaadontkieming en fixatie van wortelpunten
   1. 10-20 zaden ontkiemen gerst twee lagen vochtig filtreerpapier in een petrischaal onder donkere omstandigheden gedurende 2 dagen bij 22-24 ° C. Snijd krachtige wortels met een lengte van 1-2 cm uit het zaad door gebruik van een scheermesje.
   2. Bereid ijskoud water door het plaatsen van een 500 ml glazen fles met koud leidingwater in gemalen ijs-water. Beluchten het ijskoude water en dompel wortel tips voor 20 uur om de frequentie van de metafasecellen verhogen.
   3. Transfer wortels water tot 50 ml ethanol: azijnzuur (3: 1) fixeermiddel ze op te lossen bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen. WINKEL wortels in een vers bereide ethanol: azijnzuur (3: 1) fixatief bij 4 ° C tot gebruik tot een jaar.
2. Wassen en enzymbehandeling
   1. Was de 10-20 wortels met 30 ml ijskoud kraanwater gedurende 5 minuten tweemaal met een 50 ml glazen beker. Gebruik binoculair microscoop. Overdracht roots een voor een in30 ml 0,01 M citraatbuffer (0,01 M citroenzuur + 0,01 M natriumcitraat, pH 4,8) met behulp van een tang en was door schudden bekerglas gedurende 5 min tweemaal. Plaats wortels op filterpapier om de vloeistof volledig te verwijderen en cut-off ongewenste niet-meristeemweefsel met een scheermesje.
   2. Incubeer maximaal 20 wortelpunten in 1 ml enzymmengsel bij 37 ° C gedurende 50 min naar het plantenweefsel te verzachten (tabel 1) in een horlogeglas. Enzymmengsel bevat 0,7% cellulase R10, 0,7% cellulase, 1% en 1% Pectolyase cytohelicase verdund in 0,01 M citraatbuffer. Bewaar het enzymmengsel bij -20 ° C en opnieuw maximaal vijf keer.
   3. Verwijder het enzym door pipetteren en was de wortel tips op ijs met 5 ml 0,01 M citraatbuffer twee keer om de resterende enzym te vervangen.
3. Root maceratie
   1. Was wortelpunten met 1 ml 96% ethanol tweemaal zorgvuldig in dezelfde horlogeglas. Vervang ethanol met vers bereide fixatief (75% azijnzuur 25% ethanol). Gebruik 10-15ul fixatief per wortel tip.
   2. Transfer wortelpunten samen met het fixeermiddel in een 2 ml buisje en desintegreren wortel meristemen met een dissectie naald of pincet. Tik de buis 20 tijden resuspendeer cellen om een ​​celsuspensie te verkrijgen. Bewaar de celsuspensie bij -20 ° C tot twee maanden.
4. Het laten vallen van de celsuspensie
   1. Plaats 2-3 lagen water doordrenkte papieren tissue op een hete plaat bij 50 ° C. Dompel microscopische preparaten in ijskoud water uit de kraan in de koelkast gedurende 30 minuten. En plaats glijdt bovenop de vochtige papieren tissue.
   2. Pipet 7-10 ul van celsuspensie en zet het op een afstand van 20 cm op de gekoelde dia geplaatst op de hete plaat. Pipetteer 10 gl azijnzuur-ethanol mengsel op dezelfde plaats als celsuspensie op de dia en houd de schuif op de hete plaat gedurende nog 2 min. Plaats de dia op de hete plaat zonder het natte doekje en laat het drogen gedurende 1 minuut.
5. Kwaliteitscontrole en opbergdoose glijbanen
   1. Controleer slides met een fasecontrastmicroscoop de kwaliteit van het chromosoom spread besturen. Gebruik slides hetzij dezelfde dag of op te slaan door onderdompeling in 96% ethanol in een Coplin jar bij -20 ° C.
6. Voorbehandeling van dia's voor vis; alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur uitgevoerd
   1. Plaats de glaasjes in een Coplin pot met 50 ml 2x SSC (20x SSC bevat 3 M NaCl en 300 mM trinatriumcitraat) gedurende 5 min. Met behulp van een tang, overdracht van dia's een Coplin pot met 50 ml 45% azijnzuur voor 3-10 min.
   2. Transfer schuift een Coplin pot met 50 ml 2 x SSC gedurende 10 minuten. Overdracht dia's een Coplin pot met 50 ml van 4% formaldehyde (in 2x SSC) en dompel dia's voor 10 min om chromosomen te lossen.
   3. Verwijder formaldehyde door spoelen van de glaasjes 3 keer gedurende 4 minuten elk, in een Coplin pot met 50 ml 2 x SSC. Uitdrogen objectglaasjes in een Coplin jar gedurende 2 min in series van 70%, 90% en 100% ethanol, respectievelijk droge schuift verticaalpositie.

2. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH)

1. Voor elk objectglaasje, stelt een hybridisatie-oplossing van 20 ul in totaal via 10 pl gedeioniseerd formamide, 5 ui 4x hybridisatiebuffer (200 pl buffer bevat 80 pl 20x SSC, 8 pi 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 ui 0,5 M EDTA, 11,2 gl 10 ug / ul zalmsperma en 99,2 ul DNase-vrij water), 3 pl van de probe en 2 gl DNase-vrij water.
2. Voeg 20 ul van hybridisatie-oplossing per glijbaan en deksel met een 24 x 32 mm dekglas en arresteren de cover slip met rubber cement. Denatureren slides met probes gelijktijdig bij 80 ° C gedurende 2 minuten op een hete plaat.
3. Transfer schuift een vochtige kamer en incubeer glijbanen bij 37 ° CO / N vermijden licht. Verwijder dekglaasjes door het spoelen van de dia's in een Coplin pot met 2x SSC. Plaats de glaasjes in een Coplin pot met 55-60 ° C 2x SSC en incubeer gedurende 20 min.
4. Plaats de dia's 2x SSC in een Coplin jar gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Uitdrogen objectglaasjes in een Coplin jar gedurende 2 min in series van 70%, 90% en 100% ethanol, respectievelijk.
5. Lucht drogen de dia's en tegenkleuring met 1 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) in antifade montage medium, vermijd intens licht.

3. Microscopische Analyse en opslag

1. Analyseer de dia's met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. De keuze van de filter afhankelijk van de fluorochroom voor probe labeling. Eventueel slides opslag bij 4 ° C onder donkere omstandigheden tot een jaar.

Resultaten

Microscopische objectglaasjes met metafase mitotische smeersels werden bereid met een snelle drogen dropping chromosoom bereidingsmethode beschreven (Suppl. Figuur 1). FISH analyse werd uitgevoerd met zowel repetitief en single-copy sequenties. Beelden werden verkregen door een epifluorescentiemicroscoop met een set van filters waardoor excitatie van overeenkomstige fluoroforen en opgevangen door een zeer gevoelige CCD monochrome camera. Voor het beeld overname gebruikten we een computer met een beeld a...

Discussie

Het chromosoom voorbereiding experiment is uitgevoerd met behulp van de jonge wortels van granen behoren tot het gras familie (Poaceae). Alle geanalyseerde soorten hebben 14 relatief lange mitotische metafasechromosomen (11-15 pm) in het diploïde genoom set en behoren tot grote genoom-soorten (5,1-7,9 GBP).

Lengte van ontkiemde wortels niet meer dan 2 cm tot maximaal meristeem weefsel te verkrijgen. Synchronisatie van delende cellen werd bereikt door een 20 uur lange ijswater behandeling die...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Hot Plate	MEDAX GmbH	12603
Cellulase R10	Duchefa	C8001
Cellulase	CalBioChem	219466
Pectolyase	Sigma	P3026
Cytohelicase	Sigma	C8274
Texas Red-12-dUTP	Invitrogen	C3176	direct fluorochrome
Fluor488-5-dUTP	Invitrogen	C11397	direct fluorochrome
Fluorescent microscope	Olympus BX61	BX61
CCD camera	Orca ER, Hamamatsu	C10600
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	fluorescent dye