Dit nieuwe model voor orthotope achterste ledematen transplantatie in de muis, van een niet-hechtingsmanchet techniek voor super-microvasculaire anastomose, een krachtig hulpmiddel voor in vivo mechanistische immunologisch onderzoek naar gevasculariseerd samengestelde allotransplantatie (VCA).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Orthotope Hind Limb Transplantation in de muis
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In vivo diermodelsystemen, en in het bijzonder muismodellen, zijn uitgegroeid tot krachtige en veelzijdige wetenschappelijke instrumenten die onmisbaar zijn voor fundamenteel en translationeel onderzoek op het gebied van transplantatiegeneeskunde. Een groot scala aan reagentia is exclusief in dit setting beschikbaar, inclusief mono- en polyklonale antilichamen voor zowel diagnostische als interventionele toepassingen. Bovendien staat een groot aantal gegenotypeerde, ingefokt, transgene en knock-out stammen gedetailleerd onderzoek toe van de individuele bijdragen van humorale en cellulaire componenten aan de complexe wisselwerking van een immuunrespons en maakt de muis de gouden standaard voor immunologisch onderzoek.
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) beschrijft een nieuw veld van transplantatie waarbij allogenen worden gebruikt om 'gelijksoortigs' te vervangen bij patiënten die lijden aan traumatische of aangeboren weefselverlies. Dit chirurgische methodologische protocol toont het gebruik van een niet-naad-manchettechniek voor super-microvasculaire anastomose in een orthotopisch muis achterpoottransplantatiemodel. Het model maakt specifiek vergelijking mogelijk tussen gevestigde paradigma's in solide orgaantransplantatie met een nieuwe vorm van transplantaten bestaande uit verschillende weefselcomponenten. Uniek staat dit model de transplantatie toe van een levensvatbaar gevasculariseerd beenmergcompartiment en niche die het potentieel hebben om een gunstig effect uit te oefenen op de balans tussen immuunacceptatie en afstoting. Deze techniek biedt een hulpmiddel om allogenenherkenning en allograft afstoting en acceptatie te onderzoeken, en maakt ook de voortzetting van functionele zenuwregeneratiestudies mogelijk om dit nieuwe veld van transplantatie verder te ontwikkelen.
Inleiding
De late jaren negentig luidden de baanbrekende dagen van reconstructieve transplantatie in met de eerste succesvolle handtransplantatie die in 1998 in Frankrijk werd uitgevoerd. Sindsdien is het gebruik van VCA's voor reconstructie van verwoestende weefseldervingen met succes toegepast bij een breed spectrum van patiënten. Tot op heden telt de wereld 76 ontvangers van 112 bovenste ledematen en 31 gezichten 1-3. Bovendien zijn verschillende andere soorten VCA's zoals buikwand 4, larynx 5, luchtpijp 6, gevasculariseerde gewrichten 7 en zelfs penis 8 uitgevoerd. Verder werd onlangs de levende geboorte van een baby gemeld na baarmoedertransplantatie 9. Deze groeiende wereldervaring is een indicatie voor hoe reconstructieve transplantatie een geldige therapeutische optie is geworden voor patiënten die lijden aan significante functionele weefseldervingen die niet geschikt zijn voor conventionele reconstructieve en herstellende chirurgie en behandeling.
Terwijl het idee van "het vervangen van gelijksoortige met gelijksoortige" klinische enthousiasme wekte, blijft er nog steeds scepsis met betrekking tot bijwerkingen van conventionele hoge dosis immunosuppressie die nodig is om allograften en hun functie te behouden 10,11. Echter, zoals aangetoond door baanbrekend werk van Lee et al., zijn deze samengestelde grafts minder vatbaar voor afstoting dan de afzonderlijke componenten ervan, en bovendien hebben sommige weefselcomponenten, zoals het gevasculariseerde botcompartiment, optimisme gewekt omdat ze unieke immunologische effecten kunnen uitoefenen op de balans tussen immuunacceptatie en afstoting 12.
Onze groep was pionier in verschillende microchirurgische diermodellen voor transplantatie van vaste organen, evenals voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie 13-19. Hier beschrijven we een nieuwe chirurgische procedure met behulp van een niet-naadloze manchettechniek om super microvasculaire anastomosen uit te voeren in een orthotopisch muismodel voor achterpoottransplantatie. Dit transplantatiemodel biedt een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van immuunacceptatie en afstotingsmechanismen, evenals de rol van individuele weefselcomponenten, zoals het gevasculariseerde beenmergcompartiment, bij het induceren van tolerantie in de immunologisch veelzijdige omgeving van de muissoort. Bovendien opent de orthotopische plaatsing van de poot de mogelijkheden voor zenuwregeneratie en functionele uitkomststudies, die van cruciaal belang zijn voor de setting van VCA.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van het National Institute of Health (NIH) en werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Dierverzorging en gebruik Comite (JHUACUC). De specifieke procedures werden uitgevoerd in het kader van het goedgekeurde ACUC protocol MO13M108.
1. Donor Operation
- Dien pijnstilling op het juiste tijdstip voor elke farmacologische formulering voorafgaand aan de operatie. Zoals aangegeven in de goedgekeurde dier zorg en het gebruik protocol gebruik 0,1 mg / kg lichaamsgewicht van buprenorfine subcutaan 1 uur voorafgaand aan de huid incisie.
- Sedate de donor met isofluraan aangebracht door een kamer die aan een isofluraan vaporizer op 4%; onderhouden sedatie en anesthesie bij 2% door middel van een neuskegel. Voer teen knijpen terugtrekking reflectie om de diepte van de anesthesie voorafgaand aan de inleiding van de procedure te volgen.
- Maskers dragen, wegwerp isolatie jassen en handschoenen.
- Scheer de chirurgische area, met name de achterste ledematen en lies en prep met 10% povidon - jood.
- Gebruik een steriele laken, geautoclaveerd instrumenten en een hoge vergroting microscoop (40X).
- Maak lies huid incisie met een schaar proximaal naar het halverwege de dij en de omtrek sluit de incisie aan de achterste ledematen van de rest van de muis lichaam af te bakenen.
- Identificeren en ontleden de femorale slagader, ader en zenuw. Scheid alle drie structuren met behulp van een tang en micro-schaar.
- Zodra de vaatsteel wordt ontleed verdelen de schepen op het niveau van het inguinale ligament behulp van micro schaar.
- Vervolgens blijven de individuele ventrale (gracilis en mediale dijspieren) en dorsale spiergroepen 20 proximaal verdelen op het niveau van het midden van de dij naar het transplantaat te scheiden van de donor dier met een schaar.
- Doorsnijden het dijbeen en op het midden van de femurschacht met een schaar te snijden.
- Euthanaseren van dieren door isofluraan overdosis folgevolgd door cervicale dislocatie. Bevestig stopzetting van de hartslag en de ademhaling.
- Spoel de ledemaat met 2 ml gehepariniseerde (30 IE) koud (4 ° C) zoutoplossing met behulp van een 33 G naald spoelen gemonteerd op een injectiespuit (zie Materialen tabel).
- Plaats een polyimide manchet op de femorale ader en slagader, respectievelijk.
- Wikkel graft in natte gaasje, plaats in de petrischaal en bewaar bij 4 ° C tot inzet.
2. Ontvanger Operation
- Verwijdering van de achterpoot
- Dien pijnstilling op het juiste tijdstip voor elke farmacologische formulering voorafgaand aan de operatie. Zoals aangegeven in de goedgekeurde dier zorg en het gebruik protocol gebruik 0,1 mg / kg lichaamsgewicht van buprenorfine SC 1 uur voorafgaand aan de huid incisie.
- Sedate de donor met isofluraan aangebracht door een kamer die aan een isofluraan vaporizer op 4%; onderhouden sedatie en anesthesie bij 2% door middel van een neuskegel. Voer teen knijpen terugtrekking reflectie aan de dept controlerenh van anesthesie voorafgaand aan de inleiding van de procedure.
- Gebruik veterinaire zalf op de ogen van de muis tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
- Scheer de chirurgische gebied, in het bijzonder de achterste ledematen en lies en prep met 10% Povidon - Jodium.
- Maak lies huid incisie met een schaar proximaal naar het halverwege de dij en de omtrek sluit de incisie aan de achterste ledematen van de rest van de muis lichaam af te bakenen.
- Identificeren en ontleden de femorale slagader, ader en zenuw en scheiden alle drie structuren met behulp van een tang en micro-schaar.
- Zodra de vaatsteel wordt ontleed, klem de femorale vaten ter hoogte van het inguinale ligament.
- Snijd de vaten distale ter hoogte van de oppervlakkige epigastrische slagader.
- Vervolgens blijven de individuele ventrale (gracilis en mediale dijspieren) en dorsale spiergroepen 20 proximaal op het niveau van het midden van de dij te verdelen aan de inheemse achterpoten li scheidenmb van de ontvanger dieren met behulp van een schaar.
- Doorsnijden het dijbeen in het midden van de femorale schacht met een schaar.
- Cauterize eerder doorsneden dijspieren om het bloeden van de dissectie plaats en dus ontvanger bloedverlies te voorkomen.
- implantatie
- Minimaliseren vochtverlies door de irrigatie van het operatieve veld met warme zoutoplossing (37 ° C) en het injecteren van 0,3 ml warm zoutoplossing voor en na de operatie.
- Plaats het implantaat zodanig dat de juiste anatomische positie van het natieve achterpoot door uitlijnen van de femur bot van de ontvanger en het transplantaat en sluit ze met een 20 G naald spinale als een intramedullaire staaf weerspiegelt.
- Coapt de ventrale en dorsale spiergroepen gebruikt absorbeerbare hechtmateriaal (6-0 Polysorb).
- Sluit de femorale vaten met behulp van de niet-hechtingsmanchet techniek; in detail, trekt u de ontvanger zijde van het schip over de manchetten eerder gemonteerd op het schip uiteinden van het graft. Gebruik een 10-0 nylon hechtdraad en het uitvoeren van een rondlopende band met het ontvangende vaartuig op de manchet op te lossen.
- Naast de klemmen los. In dit stadium visueel te controleren manchet rotatie en optimale positionering te mis-rotatie en knikken van de vaten te voorkomen.
- Voer zorgvuldige hemostase met behulp van electro cautery met een bijzondere focus op de spier ontvanger donor interface en het bot eindigt.
- Sluit de huid met behulp van niet absorbeerbaar nylon hechtingen (6-0 Ethilon).
- Vestigen normotherme voorwaarden doordat het dier te herstellen in zijn kooi onder een warmtelamp. Doorgaan regelmatige controle gedurende tenminste 4 uur voorafgaand aan de terugkeer naar de behuizing faciliteit.
- Post-operatieve analgesie met buprenorfine in een dosis van 0,1 mg / kg SC elke 6-8 uur gedurende 3 dagen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Uitvoeren gevasculariseerde composiet allotransplantation in een muizenmodel met een niet-hechtingsmanchet techniek maakt uitstekende lange termijn graft en dierlijke overleving bereiken zoals getoond in figuur 1. Bovendien is een betrouwbare methode om reproduceerbare resultaten geleidelijke allograft afstoting bij gevasculariseerde composiet allotransplantatie zoals blijkt uit de in figuur 2 beelden. H & E histologie van weefsel va...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Doorbloed Composite allotransplantatie, zoals de bovenste ledematen en het gezicht transplantatie voor de wederopbouw van de verwoestende weefsel gebreken, heeft zich ontwikkeld als een geldige behandelingsoptie voor patiënten die niet amendeerbaar conventionele reconstructieve procedures. Technische ontwikkelingen op het gebied van reconstructieve microchirurgie en ruime ervaring met krachtige immuunonderdrukkende en immuunmodulerende therapieën in orgaantransplantaties, nu mogelijk langdurige allograft overleving bij ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het leger, de marine, NIH, Air Force, VA en Health Affairs aan de AFIRM II te steunen, onder Award No. W81XWH-13-2-0053. De US Army Medical Research overnameactiviteit, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21702-5014 is het toekennen en beheren van acquisitie kantoor. Adviezen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en zijn niet per se door het ministerie van Defensie onderschreven.
De auteurs willen graag Jessica Izzi, DVM, Caroline Garrett, DVM en Julie Watson, DVM bedanken voor hun uitstekende veterinaire steun tijdens deze studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Suture, 6-0 Nylon | MWI | 31849 | |
| Suture, 6-0 Polysorb | MWI | 72667 | |
| Suture, 10-0 Nylon | Aero Surgical | TK-107038 | |
| Polyimide Tubing, Size 25 | Vention Medical | 141-0023 | |
| Polyimide Tubing, Size 27 | Vention Medical | 141-0015 | |
| Microvascular Clamps (Single) | Synovis | 00396 | |
| Microvascular Clamps (Double) | Synovis | 00414 | |
| Micro-Scissors | Synovis | SAS-18 | |
| Micro-Forceps | Synovis | FRS-15 RM-8 | |
| Micro-Dilators | Synovis | FRS-15 RM-8d.1 | |
| Micro-Needledriver | Synovis | C-14 | |
| Micro-Clamp Applicator | Synovis | CAF-4 | |
| Micro-Flushing Needle | Hamilton | 10MM, 30°, 33G | |
| Lactated Ringers Solution | Fisher Scientific | NC9968051 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; verkregen bij de ziekenhuisapotheek. | ||
| Enrofloxacin; Baytril | Bayer Health Care | 186599 | |
| Heparin | Verkregen bij de ziekenhuisapotheek |
Referenties
- Khalifian, S., et al. Facial transplantation: the first 9 years. Lancet. , (2014).
- Petruzzo, P., Dubernard, J. M. The International Registry on Hand and Composite Tissue allotransplantation. Clin. Transpl. , 247-253 (2011).
- Shores, J. T., Brandacher, G., Lee, W. A. Hand and Upper Extremity Transplantation: An Update of Outcomes in the Worldwide Experience. Plast. Reconstr. Surg. , (2014).
- Levi, D. M., et al. Transplantation of the abdominal wall. Lancet. 361, 2173-2176 (2003).
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. N.Engl.J. Med. 344, 1676-1679 (2001).
- Rose, K. G., Sesterhenn, K., Wustrow, F. Tracheal allotransplantation in man. Lancet. 1, 433(1979).
- Hofmann, G. O., et al. Allogeneic vascularized transplantation of human femoral diaphyses and total knee joints--first clinical experiences. Transplant. Proc. 30, 2754-2761 (1998).
- Hu, W., et al. A preliminary report of penile transplantation. Eur. Urol. 50, 851-853 (2006).
- Brannstrom, M., et al. Livebirth after uterus transplantation. Lancet. , (2014).
- Sarhane, K. A., et al. Diagnosing skin rejection in vascularized composite allotransplantation: advances and challenges. Clin. Transplant. 28, 277-285 (2014).
- Schneeberger, S., Khalifian, S., Brandacher, G. Immunosuppression and monitoring of rejection in hand transplantation. Tech. Hand Up. Extrem. Surg. 17, 208-214 (2013).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast. Reconstr. Surg. 87, 401-411 (1991).
- Sucher, R., et al. Hemiface allotransplantation in the mouse. Plast. Reconstr. Surg. 129, 867-870 (2012).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , (2014).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90, 1374-1380 (2010).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp. , (2010).
- Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J. Surg. Res. 93, 97-100 (2000).
- Zhang, F., et al. Development of a mouse limb transplantation model. Microsurgery. 19, 209-213 (1999).
- Schneeberger, S., et al. Upper-extremity transplantation using a cell-based protocol to minimize immunosuppression. Ann. Surg. 257, 345-351 (2013).
- Azari, K., Brandacher, G. Vascularized composite allotransplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 631-632 (2013).
- Pomahac, B., Gobble, R. M., Schneeberger, S. Facial and hand allotransplantation. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4, (2014).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 3, a015495(2013).
- Lin, C. H., et al. The neck as a preferred recipient site for vascularized composite allotransplantation in the mouse. Plast. Reconstr. Surg. 133, 133e-141e (2014).
- Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. J. Surg. Res. 24, 501-506 (1978).
- Leto Barone, A. A., et al. The gracilis myocutaneous free flap in swine: an advantageous preclinical model for vascularized composite allograft transplantation research. Microsurgery. 33, 51-55 (2013).
- Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. J. Reconstr. Microsurg. 26, 201-207 (2010).
- Barth, R. N., et al. Prolonged survival of composite facial allografts in non-human primates associated with posttransplant lymphoproliferative disorder. Transplantation. 88, 1242-1250 (2009).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Res C Embryo Today. 96, 39-50 (2012).
- Foster, R. D., Liu, T. Orthotopic hindlimb transplantation in the mouse. J. Reconstr. Microsurg. 19, 49(2002).
- Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a Mouse Model for Heterotopic Limb and Composite-Tissue Transplantation. J. Reconstr. Microsurg. 17, 267-274 (2001).
- Zhang, F., Shi, D. Y., Kryger, Z., Moon, W. Development of a mouse limb transplantation model. Microsurgery. 19 (5), 209-213 (1999).
- Schneeberger, S., et al. Atypical acute rejection after hand transplantation. Am. J. Transplant. 8, 688-696 (2008).
- Mathes, D. W., et al. Stable mixed hematopoietic chimerism permits tolerance of vascularized composite allografts across a full major histocompatibility mismatch in swine. Transpl. Int. 27, 1086-1096 (2014).
- Yamada, Y., et al. Use of CTLA4Ig for induction of mixed chimerism and renal allograft tolerance in nonhuman primates. Am. J. Transplant. 14, 2704-2712 (2014).
- Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4, a015529(2014).
- Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N. Engl. J. Med. 358, 353-361 (2008).
- Kawai, T., Sachs, D. H. Tolerance induction: hematopoietic chimerism. Curr Opin Organ Transplant. 18, 402-407 (2013).
- Kawai, T., Sachs, D. H., Sykes, M., Cosimi, A. .B. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N. Engl. J. Med. 368, 1850-1852 (2013).
- Leventhal, J., et al. Chimerism and tolerance without GVHD or engraftment syndrome in HLA-mismatched combined kidney and hematopoietic stem cell transplantation. Sci. Transl. Med. 4, 124-128 (2012).
- Cendales, L. C., et al. The Banff 2007 working classification of skin-containing composite tissue allograft pathology. Am. J. Transplant. 8, 1396-1400 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
