Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de methoden voor het screenen van de genen die plasmodesmal doorlaatbaarheid en dus auxine verloop tijdens trope respons. Dit omvat het meten van de mate van respons in tropische hypocotyl van Arabidopsis thaliana en controleren plasmodesmal permeabiliteit door 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) laad- en tenslotte callose niveau assessment.

Samenvatting

Het plantenhormoon auxine speelt een belangrijke rol in veel groei en ontwikkelingsprocessen, waaronder tropische reacties op licht en zwaartekracht. De oprichting van een auxine gradiënt is een belangrijke gebeurtenis die leidt tot phototropism en gravitropisme. Voorheen polaire auxine transport (PAT) bleek een auxine gradiënt vestigen in verschillende cellulaire domeinen van planten. Echter, Han et al. Onlangs aangetoond dat juiste auxine gradiënt vorming plasmodesmal-gemedieerde callose symplasmic verbinding tussen aangrenzende cellen is ook een kritische factor. In dit manuscript, de strategie om de rol van bepaalde genen, die phototropism en gravitropisme kan beïnvloeden door het veranderen van symplasmic verbinding via moduleren plasmodesmal callose synthese verheldering besproken. De eerste stap is om afwijkende tropische antwoorden van 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen mutanten of overexpressie lijnen van een gen te screenen met het wildtype. Deze eerste screeningkan leiden tot de identificatie van een reeks genen functioneren in PAT of het regelen van symplasmic connectiviteit. Het tweede onderzoek betreft de sortering van kandidaten die veranderde tropische reacties door het beïnvloeden van symplasmic connectiviteit te tonen. Om dergelijke kandidaten pakken, de beweging van een symplasmic tracer en de afzetting van plasmodesmal callose onderzocht. Deze strategie zou nuttig zijn om nieuwe kandidaat-genen die symplasmic verbinding direct of indirect tijdens de tropische reacties en andere ontwikkelingsprocessen kunnen reguleren verkennen.

Inleiding

Planten, sessiele levende organismen hebben een zeer geavanceerde netwerk van cel-cel signalering naar diverse omgevingsstimuli aanpakken ontwikkeld. Trope reacties zijn een van de verschijnselen waarbij planten reageren op prikkels uit de omgeving. Planten vertonen twee belangrijke tropische reacties phototropism en gravitropisme. Fotosynthetische planten buigen in de richting van de lichtbron door phototropism om maximale energie te oogsten. Evenzo gravitropisme maakt de planten groeien naar het zwaartepunt. De fundamentele mechanisme dat leidt tot zulke tropische reacties impliceert asymmetrische gradiënt vorming van het plantenhormoon auxine ^1. De handeling van de lokale auxine gradient formatie goed gekarakteriseerd; de genen die betrokken zijn bij dit mechanisme te voorzien van een routekaart voor hormoon actie ^2-8. De specifieke positie van auxine efflux dragers, zoals PIN-GEVORMD (PIN) en P-glycoproteïnen, voert de beweging van auxine van het cytoplasma naar de celwand van donorcellen ^9,10. Furthermore, door de actieve H ⁺ / IAA symport activiteit van auxine instroom dragers, zoals AUX1 / LAX familie eiwitten, auxine is eindelijk geleverd aan de naastgelegen ontvanger cellen ^2,11,12. Deze gerichte beweging van auxine is bekend als polaire auxine transport (PAT). PAT leidt tot een differentiële auxine verdeling tijdens verschillende ontwikkelingsstadia en in reactie op verschillende omgevingsstimuli ^13,14. Bovendien, de verstoring van lokalisatie of expressie van een van deze auxine influx of efflux dragers leidt tot ernstige verandering in PAT, waarbij een verstoring van de auxine gradiënt oorzaken, wat leidt tot defecten in de ontwikkeling. Onlangs, Han et al. gemeld dat plasmodesmal verordening Ook moet de auxine gradiënt ¹⁵ handhaven. Tot op heden zijn meer dan 30 plasmodesmal eiwitten geïdentificeerd ^16. Van deze eiwitten is AtGSL8 gemeld als een sleutelenzym voor callose klanksynthese plasmodesmata (PD) en daardoor een belangrijke rol speelt in maintaining de PD uitsluiting op grootte limiet (SEL). Onderdrukte AtGSL8 expressie resulteerde in een vervormd auxine gradiëntpatroon leidt tot geen tropische reactie in tegenstelling tot wild type zaailingen ^15.

In dit manuscript, methoden om nieuwe kandidaat-genen die betrokken zijn bij PD regelgeving zijn voorzien verkennen. AtGSL8 werd gebruikt als een modeleiwit deze methoden te testen, omdat het een sleutelenzym bijdraagt ​​aan callose biosynthese PD. Door de zaailing-dodelijkheid van gsl8 knock-out mutanten ¹⁷ werden dexamethason (Dex) induceerbare RNAi lijnen gebruikt volgens een eerder gepubliceerd rapport ^15. De strategie die hier kan worden aangepast aan genen die zijn betrokken bij hypocotyl tropische reactie gecontroleerd door PD SEL screenen.

Protocol

1. Screening van mutanten met veranderde fototropische en gravitropic Responses

1. Bereid 1x Murashige en Skoog (MS) Medium, pH 5,7, met 0,8% Agar Een dag voor het experiment.
   1. Voeg 800 ml dubbel gedestilleerd water om een ​​2 L erlenmeyer en roer met een magneetstaaf.
   2. Voeg 4,4 g MS zout in de conische kolf.
   3. Voeg 0,5 g 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) en roer totdat al het zout is opgelost.
   4. De pH van het medium op 5,7 met 1 M KOH.
   5. Breng het medium tot een massa cilinder en breng uiteindelijke volume tot 1 L met DDH ₂ O.
   6. Giet terug het medium in een 2 L erlenmeyer en voeg 8 g van plantaardige agar.
   7. Wikkel de mond van de kolf goed af met aluminiumfolie.
   8. Autoclaaf het MS medium en DDH ₂ O 15 minuten bij 121 ° C, 15 psi en na autoclaveren, houdt het medium in een 60 ° C incubator en DDH ₂ O bij KT.
   9. Na afkoelen tot 60 ° C, giet het medium in 125 x 125 x 20 mm ³ vierkante platen op een laminaire stroming bank (50 ml per plaat).
   10. Laat de agar gestold bij kamertemperatuur gedurende 1 uur door het houden van de platen gedeeltelijk open. Indien de platen niet direct worden gebruikt, verzegelen met plastic folie en bewaar bij 4 ° C in een koelkast.
2. Oppervlakte-steriliseren van de zaden met 1,1% natriumhypochloriet en de puntjes op de zaden op 1x MS agarplaten die werden opgesteld in paragraaf 1.1.
   Opmerking: Hier, Arabidopsis thaliana {Col-0 seeds, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ worden gebruikt voor tropische respons, callose kleuring en HPTS laden Arabidopsis thaliana {Col-0 en dsGSL8 (Col-0) EMS mutant} zaden (. ongepubliceerd) worden gebruikt voor tropische respons in figuur 2.
   1. Autoclaaf 300 ml van DDH ₂ O in een fles.
   2. Voeg ongeveer honderd zaden per achtergrond, dwzmutant / overexpressie lijn en wild type (Col-0) zaden, om een 1,5 ml microcentrifugebuis.
   3. Neem 1x MS agarplaten van een 4 ° C koelkast en droog ze op een laminaire stroming bankje in een gedeeltelijk open positie.
   4. Oppervlakte-steriliseren van de zaden door toevoeging van 1 ml van een 0,2 x bleekwater oplossing (1,1% natriumhypochloriet) en houd de microcentrifugebuizen op schudinrichting bij 250 rpm gedurende 5 minuten.
   5. Laat de zaden naar de bodem door de zwaartekracht en verwijder het bleekmiddel oplossing van micropipet.
   6. Voeg 1 ml vers DDH ₂ O (geautoclaveerd) om de zaden en goed meng door de microcentrifugebuis meerdere malen. Laat de zaden weer af te wikkelen en verwijder het water.
   7. Herhaal stap 1.2.6 5-6 keer.
   8. Voeg dubbele hoeveelheid water om het volume van de zaden die bleven na de laatste wasbehandeling.
   9. Dot de gesteriliseerde zaden op een semi-gedroogde 1x MS agar plaat met behulp van een 1 ml micropipet tip die 200 ul van zaden (inclusief water).
      1. Houd ongeveer 0,1 cm afstand tussen twee zaden en minimaal 1,8 cm tussen twee rijen zaden. Puntjes op de zaden in vijf horizontale rijen per vierkante plaat (125 x 125 x 20 mm ^3). Laat het water iets te drogen voordat u het deksel op de plaat.
   10. Dicht de platen met chirurgische tape, stapelen alle van de platen verticaal, en wikkel met aluminiumfolie.
   11. Breng de verpakte platen naar een donkere doos (die geen toegang hebben tot licht). Blijf dan de donkere doos in een 4 ° C kamer / koelkast voor 3 dagen.
   12. Vanaf deze stap gaat richting platen ongewijzigd. Na 3 dagen koudebehandeling, houden de donkere box aan een installatie kweekkamer bij 22 ° C gedurende de volgende 3 dagen. Na 3 dagen, controleer dan de kieming status van de zaden onder groen licht in een donkere kamer.
       LET OP: Meestal 3 dagen oude Col-0 geëtioleerde zaailingen kunnen groeien tot 1,6 cm in lengte.
3. Analyseer de veranderde phototropic eennd gravitropic respons in mutanten of overexpressie lijnen van een specifiek gen. Selecteer alleen vergelijkbare grootte en verticaal gegroeid recht zaailingen onder groen licht in een donkere kamer. Transfer geselecteerd zaailingen vers 1x MS agarplaat met de punt van een steriele tandenstoker.
   1. de zaailingen van het laagste deel van de hypocotyl selecteren zacht zonder andere onderdelen aanraakt. Zorg ervoor dat alle van de zaailingen hebben dezelfde zaadlob / hook oriëntatie, en na het overbrengen, dat de oriëntatie van de zaailing haken blijven hetzelfde. Gebruik ten minste 20 zaailingen per achtergrond in elke rij en ten minste twee platen voor elk tijdstip voor verdere analyse.
      Opmerking: Vier verschillende achtergronden kunnen worden vergeleken in elke plaat (4 rijen).
      Optioneel: Tijdens het gebruik van dexamethason (Dex) induceerbare RNAi / overexpressie lijnen, de overdracht van de hierboven zaailingen een 1x MS plaat samen met de + dex MS plaat (plaat met 1x MS, 0,8% agar medium, aangevuld met 20 uM dex) for 3 uur en houden de platen verticaal in donkere doos.
   2. Om phototropic reactie te controleren, de overdracht van de bovenstaande borden verticaal om een ​​zwarte doos met slechts één kant geopend. Breng de zwarte doos met platen om een ​​plantengroei kamer met een unilaterale wit licht. Eenzijdige licht te garanderen, plaatst u de rand van de plaat in de richting van de lichtbron (niet de voorkant). Raadpleeg de opstelling in figuur 1.
   3. Ook de gravitropic reactie te controleren, houden de platen met overgedragen zaailingen verticale, en dek af met aluminiumfolie. Vervolgens verandert de plaat oriëntatie verticaal tot 90 ° en hou het binnen de zwarte doos bedekt van alle kanten. Raadpleeg de opstelling in figuur 1.
   4. Na de gegeven tijd punten (meestal 1,5 uur, 3 uur, 6 uur en 12 uur) het scannen van de platen met een scanner, en sla de foto's in JPEG-formaat.
   5. Meet de buighoek van de zaailingen met behulp van ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2).
      1. Start het ImageJ programma door dubbel te klikken (Figuur 2A).
         Opmerking: De belangrijkste instrumenten die gebruikt werden in de hoekmeting worden getoond in figuur 2B.
      2. Klik op de optie "file", gevolgd door sub-optie "open" in de werkbalk ImageJ, open foto's zijn opgeslagen in JPEG-bestandsformaat naar de tropen buighoek (figuur 2C) te meten.
      3. Klik op het vergrootglas instrument in of uit te zoomen op de foto door te klikken op de linker of rechter muisknop, respectievelijk zoals weergegeven in figuur 2B.
      4. Klik op het scrollen gereedschap te slepen en de positie van de foto (figuur 2D) .Next, klikt u op de hoek instrument om de hoek van het buigen (figuur 2E) te meten.
         1. Maak een dubbele klik links op de originele hypocotyl groeirichting punt 'a', sleep de muis naar de buigende initiatie punt 'b' (figuur 2F), en klik op de linker kontop de eerste lijn (figuur 2G) te trekken.
         2. Sleep de muis vanaf punt b om het buigen eindpunt 'c', en klik op de linker knop om de tweede lijn (figuur 2H) tekenen en vormen een vast A. Opmerking: De ware buigen hoek B, die gelijk is aan 180 ° is - A. (figuur 2F).
         3. Meet en opnemen Een door op 'M' op het toetsenbord. Het resultaat bestand zal afzonderlijk te openen zoals weergegeven in figuur 2I. Meet en alle zaailingen, geregistreerd voor één. Bijvoorbeeld eerst meten van de buighoek van alle hypocotylen van Col-0 en vervolgens voor mutant lijnen.
   6. Breng de dataset van ImageJ naar spreadsheet-bestand naar de av makendelde van buighoeken van elke achtergrond.
   7. Voor kwantitatieve analyse maakt een staafdiagram diagram statistische testresultaten, waaronder standaard foutbalken en waarschijnlijkheidswaarden (zie figuur 2).
      1. Bereken de ware buigen B, en het ontwerpen van een formule met behulp van spreadsheet, dat wil zeggen, B = 180 ° - Een briefje: A is de waarde die was afgeleid van ImageJ analyse.
      2. Meet de gemiddelde Buigingshoek B voor elke achtergrond met behulp van spreadsheet gereedschappen (figuur 2J).
      3. Analyseer de standaardafwijking tussen herhalingen voor elke meting met behulp van de spreadsheet "formules" tool (figuur 2J).
      4. Test de sigkenis van de resultaten door een t-test om de gemiddelde buighoek en standaarddeviatiewaarden berekend zoals hierboven vermeld.
      5. Teken een staafdiagram met behulp van de bovenstaande waarden grafisch vertegenwoordigen de kwantitatieve verschil in de buigende hoek tussen twee verschillende achtergronden met behulp van de spreadsheet "insert" tool (figuur 2K).
         Opmerking: Mutant / overexpressie lijnen van de sterke kandidaat-genen zouden duidelijke verschillen ten opzichte van wild type, zoals geen buigen tonen, snel buigen of langzaam buigen.

2. Screen Plant Lijnen met Defecte Tropic Responses gevolg van veranderingen in PD SEL met een veranderde PD callose Level

1. Voer een hypocotyl Laden Assay met 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) Dye laden op de top van Zaailingen met HPTS Agarose Blocks en vergelijk de Beweging van Dye Tussen Mutant / Over-expressie Lines en Col-0.
   1. Bereid HPTS Agarose blokken voor het laden hypocotyl assay.
      1. Neem 10 ml DDH ₂ O in een 50 ml conische kolf en voeg 0,1 g agarose met een 1% agarose gel te bereiden. Kook de agarose in een magnetronoven gedurende 1-2 minuten met onderbroken schudden en laat het afkoelen 5 minuten.
      2. Voeg 50 mg HPTS tot 10 ml van 1% agarose-oplossing en meng goed totdat de oplossing groen wordt.
      3. Giet het bovengenoemde mengsel van een 10 mm petrischaal, en laat het stollen gedurende 15 minuten.
      4. Snij de gestolde HPTS agarose met een scherp mes dissectie kleine agarose blokken (0,5 x 2 cm ²⁾ te maken.
   2. Bereid plantaardige monsters voor de HPTS dye-loading assay.
      1. Stel een platform voor de HPTS dye laden assay; Plaats een microscoop dekglaasje (24 x 50 mm ²⁾ op een nieuwe MS-medium plaat zoals getoond in figuur 3A.
      2. Accijnzen 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen van de basis van de haak met een scherp chirurgische schaar.
      3. Per directBreng de hierboven zaailingen (minimaal 5 zaailingen van elke achtergrond) aan het oppervlak van een microscopisch dekglas zodanig dat slechts 0,5 cm van hypocotyl van de excisie positie dekglaasje moet blijven, en de rest van de hypocotyl zou aanraken het medium zoals getoond in figuur 3B.
      4. Plaats de HPTS agarose blok boven de hypocotyl (met een uitgesneden haak) gedurende 5 min op een zodanige wijze dat het uitgesneden gebied aanraakt HPTS agarose blok.
      5. Na 5 minuten van het laden, verwijder de agarose blok van de hypocotyl oppervlak, de overdracht van de hypocotylen aan de 10 mm petrischaal met DDH ₂ O en was hypocotylen in DDH ₂ O gedurende 15 minuten onder voortdurend schudden.
   3. Bereid Monsters voor confocale microscopie.
      1. Selecteer minimaal 5 zaailingen van elke achtergrond voor observatie onder de confocale laser scanning microscoop.
      2. In de laser-kanaal, stel de golflengte van 488 nm voor specifieke excitation en 500-550 nm voor band-pass-emissie.
      3. Overdracht zaailingen in 2 sets (een Col-0 + één mutant) in nieuw microscopisch preparaat na wassen met DDH ₂ O. Voeg 100-150 ul van dubbel gedestilleerd water aan de dia, en dek af met een deksel glijbaan. Schuif de schuif naar de fase van de confocale microscoop.
      4. Focus de hypocotyl regio (met een 20x of 40x objectief) met behulp van bright-veld (wit licht) verlichting. Vervolgens scant de dia's voor fluorescentie.
      5. Maak opnamen gedurende minimaal 10 sets, en de twee achtergronden vergelijken door eerst de mate van kleurstof vanop het laadpunt.
         Opmerking: Mutant / overexpressie lijnen met gewijzigde symplasmic beweging verschillende patronen kleurstof laden in vergelijking met wildtype Col-0 tonen.
2. Analyseer de callose Level in Mutant / Over-expressie lijnen die Altered fototropische en gravitropic Response en Resultaat Distinct HPTS Dye Movement Compared Col-0.
   1. Bereid aniline blauw callose kleuring kleurstof.
      1. Voeg 1 M glycine, pH 9,5 en 0,1% (W / V) aniline blauw geautoclaveerd DDH ₂ O.
      2. Maak de vlekken buffer door het mengen van 0,1% aniline blauw en 1 M glycine in 2: 3 volume ratio's. Bijvoorbeeld, voor 50 ml vlekken buffer, neem 20 ml 0,1% aniline blauw en 30 ml 1 M glycine. Let op: Maak de vlekken buffer minimaal 48 uur voorafgaand aan het gebruik en op te slaan in het donker.
   2. Stain gebogen of niet-gebogen zaailingen met callose-specifieke aniline blauwe kleurstof.
      1. De de novo synthese callose blokkering tijdens het kleurproces, voeg het eindvolume van 1,5 mM 2-deoxy-D-glucose (DDG) tot 50 ml vlekken buffer.
      2. Neem 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen voor callose kleuring (met of zonder tropische respons).
      3. Snijd de zaailingen uit de haak regio met behulp van dunne chirurgische schaar.
      4. Overdracht van de zaailingen in een kleine petrischaal bevattening 2 ml vlekken buffer met de punt van een tandenstoker.
      5. Incubeer de zaailingen met kleurbuffer in het donker gedurende 2 uur onder voortdurend schudden bij 30 rpm.
      6. Na het kleuren, was de zaailingen met DDH ₂ O 2 min om het overtollige vlekken buffer te verwijderen.
      7. Selecteer minste 5 zaailingen elke plant achtergrond voor observatie onder de confocale laser scanning microscoop.
   3. Bereiden monsters voor confocale microscopie:
      1. Breng de zaailingen in set (één Col-0 + een mutant) aan de microscoop schoon dia's na het wassen met DDH ₂ O.
      2. Voeg 100-150 ul van DDH ₂ O en dek af met een deksel glijbaan. Schuif de schuif naar de fase van de confocale microscoop.
      3. In een laser kanaal ingesteld als golflengte 405 nm specifieke excitatie en 500-550 nm emissie voor de beeldvorming van aniline blauwe fluorescentie.
      4. Breng de hypocotyl regio in beeld, eerst met 10X en later met 20X of 40X objectief lenzen met behulp van bright-veld (wit licht) verlichting.
      5. Schakel dan over gefilterd licht, scan de dia's voor fluorescentie, en sla de afbeeldingen.
      6. Meet de callose signaalintensiteit met ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (zie figuur 4).
         1. Verander het formaat van confocale microscopie foto's van Olympus Image Binary-formaat (* .oib) naar JPEG-bestandsformaat. Opmerking: Alleen JPEG-formaat wordt ondersteund door ImageJ software.
         2. Start het ImageJ programma door dubbel te klikken (Figuur 4A). Opmerking: Pijlen geven de rechthoek gereedschap voor gebruik in de callose intensiteitsmeting (figuur 4B).
         3. Klik op de optie "file", gevolgd door de sub-optie "open" in de werkbalk ImageJ, open microscopie foto's die in JPEG-formaat zijn opgeslagen op de callose intensiteit (Figuur 4C) te meten.
         4. Klik op het rechthoekige symbool op de ImaGej werkbalk (figuur 4D).
         5. Om de intensiteit van het signaal te analyseren, sleep de cursor over het beeld en selecteer het gebied te onderzoeken (Figuur 4E)
         6. Meet en de numerieke waarden voor de intensiteit van het signaal opnemen door op 'M' op het toetsenbord (Figuur 4E). Opmerking: Het resultaat bestand wordt afzonderlijk (Figuur 4F) te openen.
         7. Meet en noteer de intensiteit waarden één voor één voor elk van de zaailingen van elke plant achtergrond.
            Opmerking: In ImageJ, het resultaat bestand "Mean" geeft het signaal intensiteit van de geselecteerde "Area".
      7. Kopieer de gemiddelde waarden van de ImageJ resultaat bestand, en plakken in spreadsheet-bestand voor de kwantitatieve analyse.
      8. Voor kwantitatieve analyse maakt een staafdiagram diagram met statistische tests, waaronder standaard foutbalken en waarschijnlijkheidswaarden (figuur 4).
         1. Meet de gemiddelde signaalintensiteit(gemiddelde van ImageJ) voor elke achtergrond met behulp van de spreadsheet "formules" tool (figuur 4G).
         2. Analyseer de standaardafwijking tussen herhalingen voor elke meting met behulp van de spreadsheet "formules" tool (figuur 4G).
         3. Bereken de standaardfout (SE) met behulp van thespreadsheet "formules" tool.
            Opmerking: SE = s / √ n, waarbij (s) is de standaarddeviatie van de populatie, en (n) is de grootte (aantal waarnemingen) van het monster.
         4. Test de significantie van de resultaten door een t-test om de gemiddelde signaalintensiteit en standaardfouten berekend zoals hierboven vermeld.
         5. Teken een staafdiagram diagram met behulp van de bovenstaande waarden grafisch vertegenwoordigen de kwantitatieve verschil in callose niveau tussen twee verschillende achtergronden met behulp van de spreadsheet "insert" tool (figuur 4H).
            Opmerking: Mutant / overexpressie lijnen van sterke kandidaten shoe verschillende niveaus van callose in vergelijking met wild-type, zoals geen callose, weinig callose of hyper PD callose accumulatie.

Resultaten

In de huidige setup, dexamethason (Dex) induceerbare RNAi lijnen van AtGSL8 [hierna dsGSL8 (+ dex / -dex)] werden gebruikt, zoals homozygote gsl8 T-DNA insertie mutanten worden zaailing dodelijk ^18. Drie dagen oude geëtioleerde zaailingen van dsGSL8 en wild type zaailingen met ± dex werden blootgesteld aan phototropic en gravitropic stimuli. We vonden dat dsGSL8 (+ dex) zaailingen waren defectief in phototropism en gravitropisme

Discussie

In dit manuscript, een strategie voor mutant / overexpressie lijnen die defect in phototropic en gravitropic reacties zijn vanwege veranderde PD callose en derhalve PD SEL wordt beschreven screenen. PD callose synthese en afbraak wordt vooral bereikt door callose synthases en β-1,3-glucanasen, maar regulering van deze enzymen wordt door vele factoren upstream. Om te zoeken naar een dergelijke upstream factoren of kandidaten die rechtstreeks betrokken zijn bij PD regelgeving, hebben we het opzetten van deze methode voor ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescente kleurstof als symplasmisch tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Gebazig voor HPTS agaroseblok
Microgolfoven	LG-Goldstar		Apparaat voor het koken van agarosegel
100 ml glazen kegelkolf	Dong Kwang	A0205	Gebazig voor het koken van HPTS agarosegel
Petrischaal (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Gebazig voor het maken van HPTS agaroseblokken en het wassen van plantmonsters
Microscoopdekselglazen en glasplaatjes (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Gebazig voor HPTS agaroseblokken en microscopische monstervoorbereiding
MS medium platen 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Platen om MS agarmedium te maken
Schaar	Germany Stainless	HSB 942-11	Gebazig om de haakregio van plantmonsters te exciseren
Murashige en Skoog (MS) basale zoutmix	Duchefa	P10453.01	MS medium inclusief vitaminen.
(N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) monohydraat	Bioshop	3G30212	Om MS media te maken.
Planten agar	Duchefa	P1001.1000	Om MS media te bevestigen.
Autoclaaf	ALP	CL-40L
Schudler	Wise Mix	SHO-1D	Om de anilineblauwe kleuringsbuffer en HPTS kleurstof rustig af te wassen.
1 ml Blauwe tips	Sorenson	10040
1 ml pipet	BioPette	L-1101-2
Chirurgisch tape	MIcropore	1530-0	Om de MS plaat te verzegelen
Aniline blauw (Methyl blauw)	Sigma	M5528-25G	Gebazig om aniline blauwe kleuringsbuffer voor te bereiden.
Glycine	Bioshop	GLN001	Gebazig om aniline blauwe kleuringsbuffer voor te bereiden.
DDG	Sigma	D8375-1G	Gebazig voor het remmen van callose synthases.
Confocale microscoop	Olympus	FV1000MPE SIM	Om anilineblauwe kleuring en HPTS kleurstof ladingsresultaat te controleren.
Roerder	I lab	K400	Om mediaoplossing te mengen.
Aluminiumfolie	SW kookfolie		Om platen in donkere omstandigheden te wikkelen.
Natriumhypochloriet	Samjin Industry		Om zaden oppervlakkige gesteriliseerd te maken