Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Samenvatting

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Samenvatting

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex (RSC) van muizen mogelijk maakt met behulp van in vivo twee-fotonmicroscopie in de Thy1-GFP transgene muizenlijn. Deze aanpak creëert een mogelijkheid om de correlatie van gedragsmanipulaties met veranderingen in neuronale morfologie in vivo te onderzoeken.

De procedure voor de implantatie van een craniumvenster werd beschouwd als beperkt tot de gemakkelijk toegankelijke cortexgebieden zoals het barrelveld. Onze aanpak maakt visualisatie van neuronen in de sterk gevasculariseerde RSC mogelijk. RSC is een belangrijk element van de hersencircuit verantwoordelijk voor ruimtelijk geheugen, dat eerder als problematisch werd beschouwd voor in vivo twee-fotonbeeldvorming.

De implantatie van het craniumvenster over de RSC wordt gecombineerd met een injectie van mCherry-expresserend recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV^mCherry) in de dorsale hippocampus. Het uitgedrukte mCherry verspreidt zich naar axonale projecties van de hippocampus naar de RSC, waardoor visualisatie van veranderingen in zowel presynaptische axonale boutons als postsynaptische dendritische stekels in de cortex mogelijk wordt.

Deze techniek maakt langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in de RSC mogelijk.

Inleiding

Twee-foton microscopie een revolutie in de observatie van de hersenactiviteit in levende en gedragen dieren. Sinds de introductie in 1990 al snel aan populariteit gewonnen en wordt nu geïmplementeerd als een van de meest interessante en innovatieve benaderingen in de richting van het onderzoek van een groot aantal aspecten van de hersenactiviteit in vivo ^1,2. Deze toepassingen omvatten metingen van de bloedstroming, neuronale activering (bijvoorbeeld met behulp van calcium niveau-indicatoren of onmiddellijke vroege genen expressie) en de morfologie van neuronale cellen. Steeds laboratoria twee-foton microscopen, waarmee de techniek gehele wetenschap als een nieuwe standaard voor in vivo beeldvorming van de hersenen.

De standaard aanpak omvat de implantatie van het craniale venster (een rond gat in de schedel bedekt met een deksel glas) over het vat of de visuele cortex van de hersenen van muizen ^3. Volgende, afhankelijk van de experimentele protocol, het mouse ondergaat een reeks visualisatie en gedragsmatige trainingen, zodat de veranderingen in de hersenactiviteit en neuronale morfologie tijd ^4,5 volgen. In beide gevallen craniotomie alleen invloed op de pariëtale botten, zonder over de hechtingen. Het is grotendeels aangenomen dat de belangrijkste nadeel van deze techniek is de beperkte toepassing er eenvoudig cortex als het vat of visuele cortex. Implantatie van het craniale raam over andere gebieden vormt veel moeilijkheden vanwege overmatig bloeden en / of ruimtelijke belemmering.

In dit artikel stellen we de inplanting van de craniale raam boven de retrospleniale cortex (RSC) als een andere mogelijke regio van belang voor twee-foton in vivo microscopie ^6. RSC is een belangrijk onderdeel van de hersenen circuit verantwoordelijk voor ruimtelijke geheugenvorming. Anatomisch, RSC is een onderdeel van een neuronaal netwerk tussen corticale, hippocampus en thalamus regio's ^7. Het issterk betrokken bij een reeks van gedrag, zoals ruimtelijke leren en uitsterven, evenals ruimtelijke navigatie ^6.

Om de morfologische veranderingen van de neuronen te visualiseren gebruiken we een transgene muis tot expressie groen fluorescerend eiwit (GFP) onder de thy1 promoter. In deze muizen wordt GFP tot expressie gebracht in ongeveer 10% van de neuronen in de hersenen waardoor duidelijke visualisatie van de corticale axons en dendrieten behulp van twee-foton microscopie ^8. Een andere innovatie die we voorstellen is de injectie van een recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 2/1 (rAAV2 / 1) codeert een rood fluorescerend eiwit (mCherry) onder een neuron-specifieke promoter ⁹ CaMKII in de diepere structuren van de hersenen projecteert RSC zoals de hippocampus. De expressie van rAAV2 / 1 ^mCherry in de hippocampus van Thy1-GFP muis maakt gelijktijdige visualisatie van pre- en postsynaptische elementen van de Hippocampo-Cortical synapsen ^10. De rAAV-gestuurde expressie van mCherry vereist twee tot drie weken voor het eiwit voldoende niveau te bereiken in het axonale terminals. Deze periode is niet ongebruikelijk vereiste tijd voor herstel van craniotomie.

Protocol

Alle hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door Lokale Ethische Commissie aan de Nencki Institute of Experimental Biology, Poolse Academie van Wetenschappen.

Opmerking: Sommige van de scènes in de bijbehorende video worden versneld. Snelheid factor wordt aangegeven in deze scènes.

1. chirurgie voorbereiding

1. Steriliseren alle gereedschappen, glazen verpakkingen voor vloeistoffen en wattenstaafjes in de autoclaaf. Gebruik overbodig handschoenen. Reinig de operatietafel, het stereotactische frame en de omgeving met 70% ethanol. Gebruik een steriele chirurgische pad naar een steriele ruimte te creëren voor de gesteriliseerde apparatuur. Snijd gelfoam in kleine stukjes en week ze in een steriele zoutoplossing.
   Let op: Volgens de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren, ethanol is noch een sterilisatiemiddel, noch een hoog niveau ontsmettingsmiddel. Het mag alleen worden gebruikt als een reiniging / ontvetting agent op eerder gesteriliseerde oppervlakken.
2. Zet het dier the inductie kamer en stelt de isofluraan niveau 5% en zuurstoftoevoer tot 2 l / min. Deze procedure duurt ongeveer 3 minuten.
3. Neem het dier uit de inductie kamer. Gebruik tail of teen knijpt om te verzekeren dat het dier volledig verdoofd.
4. Met een nauwkeurige trimmer scheren het haar van de rug van de kop (tussen de oren) tot aan de ogen.
5. Plaats het dier in de stereotaxische frame en stabiliseert de kop met oor bars.
6. Stel anesthesie niveaus 1,5-2% isofluraan en 0,3 l / min zuurstof.
7. Breng de oogzalf.
8. Injecteer het dier subcutaan Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) en Baytril (5 mg / kg) ter voorkoming van ontsteking, pijn en infectie, respectievelijk.
9. Injecteer het dier intramusculair met dexamethason (0,2 mg / kg) aan hersenen zwelling te voorkomen.
   Opmerking: Het is mogelijk dexamethason subcutaan injecteren of intraperitoneaal spierschade voorkomen.
10. Reinig de huid met behulp van sterile wattenstaafjes met Betadine, gevolgd door 70% ethanol.
11. Verander de handschoenen en spuit ze met 70% ethanol.
    Opmerking: Tijdens het gebruik van wegwerphandschoenen hoeft het steriele veld niet aan. Raak het dier alleen met de toppen van steriele chirurgische instrumenten en steriele wattenstaafjes.

2. Cranial Window Surgery

1. Til de huid met een tang via micro schaar incisie de huid horizontaal langs de basis van de kop en vervolgens schuin naar voren punt tussen de ogen. Verwijder de huid flap.
2. Toepassen lidocaïne zalf met een steriel wattenstaafje over de periosteum overmatig bloeden en pijn te voorkomen.
3. Gebruik steriele wattenstaafjes of een scalpel aan het beenvlies te verwijderen. Droog de schedel met steriele wattenstaafjes.
4. Met behulp van een steriele naald toepassen dichte cyanoacrylaat lijm op de huid randen te immobiliseren en te voorkomen dat het contact met tandheelkundig cement. Wacht tot de lijm te drogen.
5. Leg een steriele 3 mm dekglaasje op tHij schedel naar voren om de lambdoïde hechtdraad. Centreer het dekglaasje bij RSC coördinaten: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Mark de dekglaasje randen door krabben de schedel oppervlak met een steriele naald. Zet het dekglaasje terug in de steriele container met 70% ethanol.
6. Gebruik een high-speed tandheelkundige boor met kleine diameter braam een ​​cirkel met een diameter van 3 mm te schetsen. Maak de boorlocatie van het bot stof met een steriele zoutoplossing gedompeld swabs. Gebruik de Gelfoam en swabs om de occasionele bloeden te stoppen en het reinigen van de bot.
7. Tussen het boren te controleren op het bot dikte met fijne tang door zachtjes aanraken van de bot cirkel en het controleren van de mobiliteit. Houd in gedachten dat het bot dikker is op gebied van de hechtdraad's. Stop met het boren wanneer het bot cirkel mobiel is en slechts een gelijkmatige, dunne laag van het bot is links op de omtrek. Maak de operationele gebied van alle resterende bot stof met een zoutoplossing gedompeld swabs.
8. Laat de steriele zoutoplossing op het boren gebied, die het geboorde circle. Wrik voorzichtig het bot cirkel met fijn pincet en dan zachtjes maar stevig op het bot te verwijderen door naar boven te tillen. Wees voorzichtig het bot cirkel niet te scheef terwijl het opheffen van om mogelijke schade aan de dura te voorkomen.
9. Voorzichtig toe te passen de gelfoam gedrenkt in steriele zoutoplossing op de dura te helpen stoppen met het bloeden. Wacht tot alle bloeden volledig is gestopt. Haal de gelfoam niet om het stollingsproces verstoren.
   Opmerking: De hechtdraad gebied is zeer gevasculariseerde, zodat de bloeding op dit punt kunnen blijken diepgaand te zijn. Het is essentieel om te wachten op het wachten tot het bloeden stilstaan. Het is nuttig om de zoutoplossing gedrenkte Gelfoam gekoeld door het op ijs te houden.

3. Virusinjectie

1. Bevestig de infuuspomp aan de stereotactische toren en sluit de controller.
2. Steek de 35G naald in de spuit. Spoel de injectiespuit 10 maal met ethanol te steriliseren en 10 maal met steriele zoutoplossing om sporen te verwijderen ethanol. Verwijder luchtbellen uit de spuit. Breng de spuit in de pomp.
   Opmerking: Overweeg het gebruik van andere desinfectiemiddelen.
3. Ontdooi een enkele dosis van rAAV2 / 1 ^mCherry bereiding (10 ¹² pfu wordt aanbevolen) en houd het op ijs. Vul de spuit met de virusoplossing.
4. Centreer de naald op de bregma en vervolgens voorzichtig te voegen in de hippocampus met de volgende coördinaten: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Deze coördinaten worden in de buurt van de rand van de craniotomie. Wacht 5 minuten om het weefsel te stabiliseren.
5. Injecteer 0,7 ul van de rAAV2 / 1 ^mCherry oplossing met een snelheid van 50 nl / min. Wacht 10 min voor het virus volledig te adsorberen. Verwijder voorzichtig de naald. Blot met gelfoam als bloeden optreedt. Herhaal dit met de contralaterale website.

4. Cranial Window Implantatie

1. Leg de steriele, gedroogd dekglaasje op de top van de dura in de geboorde cirkellijst. Houd de dekglaasje met de krachteeps om voorzichtig plat de dura en breng coverglass 'randen dichter bij de schedel oppervlak.
   Opmerking: Het is mogelijk dat de dekglaasje verstoort het stolsel en het bloeden hervat. Als dat het geval is, tilt u de dekglaasje, plaats hem in alcohol, droog en terug te keren naar stap 2.9.
2. Met behulp van een steriele naald gelden de dichte cyanoacrylaat lijm op de dekglaasje randen om ze te hechten aan de schedel. Wacht tot de lijm te drogen.
3. Plaats een fixatiesteunen (M2 bout of een custom made ontwerp) in het voorste deel van de schedel. Breng de cyanoacrylaat lijm over de randen van de bar. Wacht tot de lijm te drogen.
   1. Plaats de fixatie bar in een positie die horizontaal positioneren van de craniale venster bij beeldvormend sessie mogelijk. Plaats deze zo ver mogelijk van het venster. Als het te dicht bij het raam is geplaatst, kan de bar en de schroef te verbinden met de op maat gemaakte houder zich voordoen als een obstakel voor het doel tijdens het beeldvormingsproces.
4. Bereid de tandheelkundige acryl en toe te passen op de schedel oppervlak rond het glas. Het is nuttig om een ​​krater-achtige vorm rond het venster vormen. Het zal een holte voor het water later aangevraagd voor beeldvorming, met als doel water te creëren.
5. Maak een pet met de tandheelkundige acryl, die de rest van de operationele omgeving, de huid randen, fixatie bar, de versterking van de krater rond de craniale venster. Wacht tot het tandheelkundig cement uitharden.
6. Verwijder het dier uit de stereotaxische frame en zet het in het herstel kamer.
7. Wacht totdat het dier herstellen van de operatie met inachtneming van de fysiologische functies.
8. Toepassen postoperatieve analgesie (carprofen, 10 mg / kg) en behandeling met antibiotica (Baytril, 5 mg / kg) gedurende 48 uur.

5. Imaging

1. Start de Ti: Sapphire laser, de macht van de microscoop. Het systeem dat in dit experiment is uitgerust met een twee-foton laser OPO systeem en dubbele GaAsP PMT.
2. Zet het dier in de inductie kamer en induceren anesthesie.
3. Verwijder het dier uit de inductie kamer en plaats in de gas anesthesie masker onder de microscoop. Verlaag de zuurstoftoevoer naar 0,3 l / min en de isofluraan concentratie 1,5-2%.
4. Bevestig het dier aan de aangepaste microscoop frame met een M2 schroef (of een ander aangepast systeem). Niveau van de craniale venster.
   Opmerking: Het is mogelijk om het hoofd fixatie de microscoop fabrikant systeem, hoewel het specifieke custom lijst geeft betere resultaten (verhoogde schuimkraag stabiliteit constante positionering in meerdere sessies chronisch experiment).
5. Met de groothoek microscoop instellingen en lage vergroting doelstelling center het uitzicht op een van de zijden van de retrospleniale cortex en focussen op het dekglaasje oppervlak.
6. Breng een druppel water in de krater-achtige acryl ook. Overschakelen naar een lange afstand water immersie objectief. Verplaats het doel de richting van de craniale venster totdat het water meniscus connects het monster en objectief.
7. Schakel over naar twee-foton instellingen en beginnen met het scannen van het monster boven naar beneden met de laagste zoom. De oversteek van de dura mater wordt zichtbaar als een schittering van hoge niet-specifieke signaal.
8. Pas de microscoop acquisitie instellingen in beide kanalen (GFP en mCherry) volgens de signaalsterkte van fluorescerende cellen om het gehele dynamische bereik dekken.
9. Na het vinden van een geschikte neuron (met de dendritische boom gescheiden van andere cellen) uitvoeren van een eerste scan met alleen de GFP filterset met de laagste zoom en z-afstand van 5 micron.
10. Zorg voor een maximale projectie van de gescande stack en print het voor annotaties (met behulp van omgekeerde kleuren).
11. Stel zoom in op een waarde die het mogelijk maakt om het beeld van de gewenste morfologische details. Het imago van de gehele dendritische boom in het GFP en mCherry kanalen met een maximale projectie als gids.

Resultaten

De expressie van GFP in een subset van neuronen in de Thy1-GFP reporter muis maakt in vivo beeldvorming van de corticale dendrieten en lokale axonale projecties RSC. Figuur 1A toont maximale projectie van een stapel van beelden met meerdere GFP-positieve dendrieten toegankelijk. De cel lichaam wordt verduisterd door een slagader. Figuur 1B toont een enkel vlak ingezoomd beeld (digitale zoom 3x) van de dendritische tak aangegeven in 1A. Details v...

Discussie

In het huidige artikel presenteren we een protocol voor simultane twee-foton in vivo beeldvorming van de synaptische ingangen en postsynaptische targets in RSC door een craniale raam. De implantatieprocedure bestaan ​​uit een aantal belangrijke stappen. Eerst wordt het dier verdoofd en diep in de stereotactische raamwerk aangebrachte vervolgens de schedel over RSC verdund met een boor langs de gemarkeerde cirkellijnen en de cirkelvormige bot wordt verwijderd. Nadat het bloeden is gestopt, wordt de rAAV2 / 1

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Drug
Isofluraan	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% pre-operatief
Isofluraan	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% tijdens operatie
Dexametason	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2 mg/kg intramusculair
Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg subcutaan
Tolfedine	Vetoquinol	4%	4 mg/kg subcutaan
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg subcutaan
Carprofen	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg subcutaan
Lidocaïne	Jelfa	Lignocainum	topisch
Lidocaïne	Jelfa	20 mg/g	topisch
Chirurgie
Gelfoam	Ethicon	Spongostan tandheelkundig; REF MS0005
Oogzalf	Dedra	Lubrithal	topisch
CA-lijm	Pelikan Daniel	20G Huste
Tandheelkundig acryl	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotactisch frame	Stoelting	51500D
Gereedschap
Dekglas	Harvard Apparatus	HSE-64-0720	3 mm diameter
Tandboor	Sigmed	Keystone KVet
Fixatiestange	Op maat gemaakt	N/A	M2 of M3 schroefmoeren kunnen worden gebruikt
Pincet	Renex	PN-7B-SA
Microschaar	Falcon	BM.183.180
Dissectiemicroscoop	KOZO	XTL6445T
Beeldvorming
Houderframe	Op maat gemaakt	N/A
Twee-foton microscoop	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Lasereenheid: Coherent Chameleon 690-1040nm met Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectieven: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 en LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detectie: Zeiss bandpassfilters BP 500-550 (GFP) en BP 570-610 (mCherry) gescheiden door een beam splitter op 560nm en gekoppeld aan twee GaAsP fotodetectoren.
Reagens
Virus	cadeau van K. Deisseroth		Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) dat fluorescent eiwit mCherry tot expressie brengt onder controle van CaMK-promotor