Simultane twee-foton In Vivo Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Summary

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Abstract

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.

The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.

The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAV^mCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.

This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Introduction

Twee-foton microscopie een revolutie in de observatie van de hersenactiviteit in levende en gedragen dieren. Sinds de introductie in 1990 al snel aan populariteit gewonnen en wordt nu geïmplementeerd als een van de meest interessante en innovatieve benaderingen in de richting van het onderzoek van een groot aantal aspecten van de hersenactiviteit in vivo ^1,2. Deze toepassingen omvatten metingen van de bloedstroming, neuronale activering (bijvoorbeeld met behulp van calcium niveau-indicatoren of onmiddellijke vroege genen expressie) en de morfologie van neuronale cellen. Steeds laboratoria twee-foton microscopen, waarmee de techni....

Protocol

Alle hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door Lokale Ethische Commissie aan de Nencki Institute of Experimental Biology, Poolse Academie van Wetenschappen.

Opmerking: Sommige van de scènes in de bijbehorende video worden versneld. Snelheid factor wordt aangegeven in deze scènes.

1. chirurgie voorbereiding

1. Steriliseren alle gereedschappen, glazen verpakkingen voor vloeistoffen en wattenstaafjes in de autoclaaf. Gebruik overbodig handschoenen. Reinig de operatietafel, het stereotactische frame en de omgeving met 70% ethanol. Gebruik een steriele chirurgische pad naar een s....

Results

De expressie van GFP in een subset van neuronen in de Thy1-GFP reporter muis maakt in vivo beeldvorming van de corticale dendrieten en lokale axonale projecties RSC. Figuur 1A toont maximale projectie van een stapel van beelden met meerdere GFP-positieve dendrieten toegankelijk. De cel lichaam wordt verduisterd door een slagader. Figuur 1B toont een enkel vlak ingezoomd beeld (digitale zoom 3x) van de dendritische tak aangegeven in 1A. Details v.......

Discussion

In het huidige artikel presenteren we een protocol voor simultane twee-foton in vivo beeldvorming van de synaptische ingangen en postsynaptische targets in RSC door een craniale raam. De implantatieprocedure bestaan ​​uit een aantal belangrijke stappen. Eerst wordt het dier verdoofd en diep in de stereotactische raamwerk aangebrachte vervolgens de schedel over RSC verdund met een boor langs de gemarkeerde cirkellijnen en de cirkelvormige bot wordt verwijderd. Nadat het bloeden is gestopt, wordt de rAAV2 / 1

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drug
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% pre-operative
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	1.5-2% during surgery
Dexametasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0.2 mg/kg intramuscular
Baytril	Bayer	2.50%	5 mg/kg subcutaneously
Tolfedine	Vetoquinol	4%	4 mg/kg subcutaneously
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg subcutaneously
Carprofen	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg subcutaneously
Lidocaine	Jelfa	Lignocainum	topically
Lidocaine	Jelfa	20 mg/g	topically
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Eye ointment	Dedra	Lubrithal	topically
CA glue	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental acrylic	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaxic frame	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Apparatus	HSE-64-0720	3 mm diameter
Dental drill	Sigmed	Keystone KVet
Fixation bar	Custom made	N/A	M2 or M3 screw nuts could be used
Forceps	Renex	PN-7B-SA
Micro scissors	Falcon	BM.183.180
Dissection microscope	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder frame	Custom made	N/A
Two-photon microscope	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.
Reagent
Virus	gift from K. Deisseroth		Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter