Dit protocol beschrijft een techniek om veranderingen in de maternale vaatstructuur tijdens zwangerschap bij muizen te beoordelen. Met behulp van stereologische methoden wordt de verandering van de deciduale spiraalvormige slagaders kwantitatief beoordeeld en worden de resultaten kwalitatief bevestigd door middel van immunohistochemie.
Methodenartikel
Beoordeling van de moeder Vasculaire Verbouwing tijdens de zwangerschap in de muis Baarmoeder
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De placenta bemiddelt de uitwisseling van factoren zoals gassen en voedingsstoffen tussen moeder en foetus en heeft specifieke eisen voor de toevoer van bloed uit de moederlijke bloedsomloop. Het maternale uterusvasculair systeem moet zich aanpassen aan deze tijdelijke vraag en het succes van dit arteriële remodelleringsproces heeft gevolgen voor de groei van de foetus. Cellen van het moederlijke immuunsysteem, vooral natuurlijke killer (NK) cellen, spelen een cruciale rol in dit proces. Hier beschrijven we een methode om de mate van remodellering van maternale spirale slagaders tijdens de muizenzwangerschap te beoordelen. Het vervagen van het weefsel met hematoxyline en eosine wordt gescand en de grootte van de vaten wordt geanalyseerd. Als complementaire validatiemethode presenteren we ook een kwalitatieve beoordeling van het succes van het remodelleringsproces door immunohistchemische detectie van gladde spieractine (SMA), dat normaal gesproken verdwijnt uit de arteriële vasculaire media rond het midden van de zwangerschap. Samen maken deze methoden het mogelijk om een belangrijke parameter van het zwangerschapsfenotype te bepalen. Deze resultaten kunnen worden gecombineerd met andere eindpunten van muizenzwangerschap om inzicht te geven in de mechanismen die ten grondslag liggen aan zwangerschapsgerelateerde complicaties.
Inleiding
De uitwisseling van voedingsstoffen, gassen en afvalstoffen tijdens eutherian zwangerschap wordt gemedieerd door de placenta. In het vrouwelijke voortplantingssysteem, het uterine slagaders zijn de hoofdkanalen van bloed naar de baarmoeder. Na implantatie, deze tak in gespecialiseerde schepen genoemd spiraal slagaders die spoel door de decidua basalis naar de foetoplacentaire unit. Diameter en elasticiteit van deze spiraal arteriën, die worden omgeven door leukocyten, met name baarmoeder natural killer (uNK) cellen dicteren volume en de bloed waarover de placenta 1,2. Correct hemodynamische veranderingen als gevolg van hermodellering van de spiraalvormige arteriën cruciaal zijn voor succes zwangerschap.
Terwijl de onderliggende mechanismen in detail verschillen tussen mensen en muizen zwangerschap, het uiteindelijke resultaat van de verbouwing proces in beide soorten is uitgezet, hoog geleiding vaatstelsel dat de gladde spierlaag verliest. Bij muizen, uNK cel-afgeleid interferon (IFN-) γ moeten deze veranderingen op ongeveer halverwege de dracht 3-5 induceren. Muizen die ofwel NK-cellen of componenten van de IFN-γ signaalroute missen niet aan deze wijzigingen ondergaan en dit wordt geassocieerd met een verminderde foetale groei 6,7, benadrukt het belang van een adequate bloedtoevoer naar de foetoplacentaire unit. Tijdens de vroege zwangerschap bij de mens, de interstitiële en endovasculaire invasie van extravilleuze trofoblast en hun interactie met uNK cellen zijn belangrijk voor het induceren van vasculaire veranderingen en bevordering van groei van de foetus 8-10. uNK cellen kunnen menselijk trofoblastinvasie orkestreren tot 11 chemokines en cytokines zoals granulocyte macrofaag - koloniestimulerende factor (GM-CSF) 12. Ondiepe trofoblastinvasie is geassocieerd met een verminderde arteriële hermodellering en zwangerschap complicaties zoals pre-eclampsie 9.
Dit protocol is gebaseerd op het pionierswerk van Anne Croy die belangrijke omschrevenrol van het immuunsysteem in het bijzonder NK-afgeleide IFN-γ voor succesvolle vasculaire remodeling immunohistochemie en elegant overdrachtsexperimenten 5,13. Hier beschrijven we een snelle en goedkope manier om de verbouwing status van spiraal arteriën beoordelen. Hoewel onze lab beoordeelt deze regelmatig halverwege de dracht (zwangerschap dag (GD) 9.5) 14, de verbouwing proces plaatsvindt tussen gd8.5 en 12,5 15. De komst van geautomatiseerde slide scanners heeft aanzienlijk vergemakkelijkt de beoordeling van het schip en lumen gebieden van secties en we vonden dat dit een meer reproduceerbaar aanpak dan het meten schip diameters zijn. De toevoeging van immunohistochemische detectie van SMA maakt een eenvoudige bevestiging van de resultaten van de stereologische beoordelingsresultaten. Zoals met alle stereologische technieken, is het raadzaam om de beoordeling uit te voeren als een blind experiment door ten minste twee examinatoren. Daartoe kan een randomisatie stap gebeuren, wanneer in serie gesnedenting van de monsters, zodat de onderzoekers de beoordeling van de dia's niet weten uit welke experimentele groep de monsters komen.
De algemene doelstelling van dit protocol is een betrouwbaar hulpmiddel om de herinrichting van spiraal arteriën zorgvuldig te beoordelen in muizen met gedefinieerde moeders en vaders genotypes, in het kader van muismodellen voor zwangerschap-gerelateerde complicaties te bieden. De resultaten benadrukken de afhankelijkheid uNK cellen volgens deze werkwijze, die essentieel is voor normale groei van de foetus.
Protocol
Alle procedures die in dit handschrift zijn in overeenstemming met de Britse ministerie van Binnenlandse Zaken regelgeving en worden goedgekeurd door de Cambridge Ethical Review Panel.
1. Specimen Collection
- Opgezet getimede paringen met 8-12 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muizen met volwassen mannen (tot 2 vrouwtjes per man) in de middag. Controleren op de aanwezigheid van vaginale stekkers als een teken van copulatie vroeg in de ochtend op de volgende dagen. De aanwezigheid van een plug in de ochtend merken gd0.5.
- Op gd9.5, euthanaseren het dier door cervicale dislocatie en open de buikholte. Merk op dat euthanasie door CO 2 kan vasodilatatie veroorzaken.
- Gebruik tandzijde om voorzichtig ligeren de baarmoeder slagaders (figuur 1, gestippelde pijlen). Bind de floss rond de aders aan het uiteinde van elke baarmoeder hoorn, proximaal van de eierstokken, evenals rond de baarmoederhals.
Opmerking: de schepen niet omdat dit kan leiden tot een ingestort slagaders scheuren. - Prepareer de uterus snel met behulp van dissectie schaar uitsnijden van het gehele uterus distaal aan de ligatie drie punten aan het uiteinde van de baarmoederhoorns en cervix.
- Plaats de uterus op een voorbereide polystyreen stuk zodat beide horens uitgelijnd langs dezelfde lange as in tegengestelde richtingen vanaf de cervix. Voorzichtig rekken het en pin op zijn plaats met behulp van 2-3 25 G naalden.
- Dompel de polystyreen in een bereide 50 ml conische buis. Bijvullen tot 50 ml met 10% formaline. Oplossing voor 5-6 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Gooi de formaline-oplossing en vervangen door 50 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 min.
- Uitsnijden beide uterine hoorns proximaal aan de ligatie punt aan elk uiteinde en proximaal aan de cervix in het centrum weggesneden overtollige vet rond de implantatieplaatsen en twee keer wassen in PBS gedurende 5 min om sporen formaline verwijderen.
- Bewaar de monsters in 70% ethanol bij 4 ° C (gedurende maximaal twee weken) tot verwerking.
LET OP: Ethanol is licht ontvlambaar. - Gebruik een geautomatiseerd systeem met de in tabel 1 parameters. Hoornen insluiten individueel in paraffine, zodat zij langs het vlak kan worden gesneden loodrecht op de lengteas van de baarmoeder. Dit zorgt ervoor dat de maximale oppervlakte van elke implantatieplaats worden blootgesteld voor analyse in het midden van het blok (figuur 2A).
OPTIONEEL: Dit is een geschikt moment voor randomisatie van de blokken indien gewenst. - Met behulp van een microtoom gesneden seriële secties van 7 urn dikte van de blokken. Vlek een sectie op elk 49 micrometer interval met hematoxyline en eosine (H & E, zie paragraaf 2.1). Bewaar de overige secties bij kamertemperatuur SMA kleuring en andere verdere toepassingen.
| Oplossing | Tijd | Temperatuur |
| 70% Ethanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% ethanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% ethanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% ethanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% ethanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% ethanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% ethanol | 1 hr | 40 ° C |
| 1 hr | 40 ° C | |
| Xyleen | 1 hr | 40 ° C |
| Xyleen | 1 hr | 40 ° C |
| Paraffine | 1 hr | 63 ° C |
| Paraffine | 1 hr | 63 ° C |
| Paraffine | 1 hr | 63 ° C |
| Paraffine | 1 hr | 63 ° C |
Tabel 1:. Instellingen voor automatische Weefselbewerkingswerkwijze Overzicht van de instelling voor de verwerking van baarmoederweefsel
2. Stereological Assessment
- H & E kleuring
- Deparaffinize secties door onderdompeling objectglaasjes aangebracht in een dia rek in een 100% xyleen bad gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: Xyleen is brandbaar en een vermoedelijk kankerverwekkende stof die giftig is door het contact en inademing. Deze werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een zuurkast, gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). - Dompel objectglaasjes in bad met schoon xyleen gedurende een verdere 10 min.
- Opeenvolgend onderdompelen objectglaasjes in baden met 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en gezuiverd water gedurende 5 minuten elk.
- Dompel de glaasjes in 50% Gill nr 3 hematoxyline-oplossing, verdund met gezuiverd water, gedurende 5 min.
LET OP: Hematoxylin is schadelijk bij inslikken en contact met de ogen. Draag geschikte PPE bij het hanteren. - Was de dia's in een kleuring bak onder stromend water gedurende 10 minuten.
- Dompel slides in 1% zuur / alcohol-oplossing (1% 10 M zoutzuur in 70% ethanol) gedurende 10 secen wassen in een kleuring bak onder stromend water.
- Dompel dia's in eosine oplossing voor 30 sec en wassen in een kleuring bak onder stromend water gedurende 10 minuten.
- Binnen een zuurkast, sequentieel onderdompelen dia's in baden met 70% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol gedurende 5 minuten elk.
- Dompel de glaasjes in xyleen bevattend bad gedurende 10 min.
- Mount coverslips met behulp van een xyleen gebaseerde montage medium. Droog horizontaal en grondig in een zuurkast vóór het visualiseren van de dia onder een microscoop.
- Deparaffinize secties door onderdompeling objectglaasjes aangebracht in een dia rek in een 100% xyleen bad gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Stereologische Beoordeling van de grootte van het vaartuig en remodeling Status
- Voor elke implantatie, bepalen welke onderdelen dicht bij de midsagittale punt zijn. De chorion hechting tussen de foetus en de ontwikkeling van de placenta dient als een goede indicator van de midsagittale punt.
- Selecteer 3 secties 49 um intervallen nabij het sagittale voor de analyse. Scannen geselecteerde dia's. Om te voorkomen incLuding aders, waarvan is aangetoond dat meer perifeer zich in de implantatieplaatsen 16, beperken de analyse van de centrale 2/4 van elke implantatie (figuur 2A).
- Om lumen grootte beoordelen, trekken rond de binnenkant van de vaten en noteer het gebied van deze vorm. Voor de totale grootte van het vaartuig, trekken rond de buitenwand van het schip, met inbegrip van endotheelcellen, pericyten en intramurale leukocyten.
Opmerking: De verhouding van de totale grootte van het vaartuig om lumen is een proxy voor de verbouwing status van een schip. Aangezien de vaten spoel door het vlak dat het gedeelte is gesneden langs kunnen er meerdere dwarsdoorsneden van dezelfde slagader in een dia. Dat meting van dezelfde slagader meerdere keren. - De gemeten waarden van de 5 vaten in elke implantatieplaats de grootste en roundest lumen. Meet elke implantatie in drievoud (drie secties afstand 49 micrometer van elkaar). Het gemiddelde van deze 15 metingen VERTEGEnts de gemiddelde diameter van de grootste vaten.
- Om oververtegenwoordiging van grotere schepen in sommige monsters te voorkomen, meet hetzelfde aantal schepen in elke implantatie.
3. Kwalitatieve Assessment behulp Immunohistochemie
- Deparaffinisatie en Rehydratie
- Deparaffinize secties door onderdompeling objectglaasjes aangebracht in een hittebestendige dia rek in een 100% xyleen bad gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Dompel objectglaasjes in bad met schoon xyleen gedurende een verdere 10 min.
- Opeenvolgend onderdompelen objectglaasjes in baden met 100% ethanol, 95% ethanol en 70% gezuiverd water en gedurende 5 minuten elk.
- Antigen Retrieval
- Bereid een 10 mM natriumcitraatbuffer in gezuiverd water en op pH 6 onder toepassing van 10 M zoutzuur.
- Vul een hittebestendige container die 600 ml met 400 ml natriumcitraatbuffer en plaats kan houden in een binnenlandse snelkookpan met voldoende water de helft van de houder dompelen. Losjes bevestig het deksel van de pan en verhit tot koken.
- Plaats schuif rek in de natriumcitraatbuffer en stevig vast het deksel van de pan. Eenmaal op druk, laat koken gedurende 3 min.
- Drukloos de snelkookpan en de binnenste container te verwijderen. Laat afkoelen slides in natriumcitraatbuffer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Was glijdt in een bad met zuiver water gedurende 5 min.
- Omcirkel de secties met behulp van een hydrofobe barrière pen.
- Was objectglaasjes door onderdompeling in PBS gedurende 5 min.
- Het blokkeren Endogene peroxidase en niet-specifieke binding
- Incubeer secties met 3% waterstofperoxide verdund in gezuiverd water in een vochtige kamer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: Waterstofperoxide is zeer irriterend voor de ogen, de huid en bij inname. Draag de juiste beschermingsmiddelen. - Tik overtollige waterstofperoxide-oplossing en wassen slides tweemaal door onderdompeling in Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 2 min elk.
- Incubeer secties met muizenimmunoglobuline blokkeerreagens van de muis op muis kit bereid volgens de instructies van de fabrikant.
- Was glijdt tweemaal in TBS gedurende 2 minuten elk.
- Incubeer secties met 3% waterstofperoxide verdund in gezuiverd water in een vochtige kamer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Immunodetectie van gladde spieren actine
- Bereid antilichaam verdunningsoplossing (verschaft in kit) en incubeer met secties voor 5 min bij kamertemperatuur, of volgens de instructies van de fabrikant.
- Verdun 1: 100 muizen anti-humaan gladde spier actine (DAKO M0851) in antilichaamverdunningsmiddel oplossing. Verdun muis IgG2a isotype controle antilichaam verdunningsmiddel oplossing zodat de uiteindelijke immunoglobuline concentratie equivalent in beide oplossingen.
- Tik overtollige antilichaam verdunningsoplossing en dekking secties met ofwel verdund antilichaam of isotype controle-oplossingen. Incubeer in een vochtige kamer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was glijdt tweemaal in TBS2 min elk.
- Verdun gebiotinyleerd anti-muis secundair antilichaam en incubeer secties gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, of volgens de instructies van de fabrikant.
- Was eenmaal per dia met TBS en PBS gedurende 2 min, respectievelijk.
- Bereid 3,3'-diaminobenzidine (DAB) oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Bedek secties met DAB-oplossing en incubeer gedurende maximaal 4 minuten, waardoor secties controleren om overtollige kleur ontwikkeling te voorkomen.
LET OP: DAB is brandbaar en een vermoedelijk kankerverwekkende stof die giftig is door het contact en inademing. Draag geschikte PPE bij het hanteren. - Dompel dia's in gezuiverd water eenmaal gewenste intensiteit van kleuring wordt bereikt.
- Tegenkleuring met 50% Gill No. 3 hematoxyline gedurende 20 seconden en was in een kleuring bak onder stromend water tot het water helder.
- Uitdroging en Montage
- Binnen een zuurkast, sequentieel onderdompelen dia's in baden met 70% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol gedurende 5 minuten elk.
- Dompel de glaasjes in xyleen bevattend bad gedurende 10 min.
- Mount coverslips met behulp van een xyleen gebaseerde montage medium. Droog horizontaal en grondig in een zuurkast voor het visualiseren van de dia's onder een microscoop
Resultaten
RAG2 - / - IL2rg - / - muizen missen alle rijpe lymfocyten, waaronder NK-cellen 17 en de baarmoeder slagaders niet aan de vasculaire veranderingen waargenomen in congenic wildtype C57BL / 6 (WT) muizen medio draagtijd 5,14 ondergaan. Als gevolg van deze verminderde remodeling RAG2 - / - IL2rg - / - muizen een significant kleinere luminale oppervlakken, indicatief algemeen kleinere vaten die kunnen worden gevisualiseerd op H & E-gekleurde coupes en gekwantificeerd stereologically (figuur 2). Verder is de relatieve wanddikte (vat lumenverhouding) hoger in de spiraalvormige arteriën in deze muizen, wat suggereert verminderde toevoer van bloed en hogere bloedsnelheid.
Deze kwantitatieve beoordeling werd bevestigd met behulp van immunohistochemische detectie van SMA. Kenmerkend voor WT-muizen de meeste SMA verliezen binnen de media vasculairevan de spiraal arteriën medio zwangerschap. Wanneer deze NK-cel gestuurd proces niet plaats, SMA blijft in de media van de vaten en kunnen gemakkelijk worden immunohistochemisch gedetecteerd als ringen rond de bloedvaten (Figuur 3).
Figuur 1: Muis baarmoeder bij gd9.5, schematisch overzicht tekening die de relatieve posities van de baarmoeder hoorns, de baarmoederhals (blauw) en de belangrijkste baarmoeder slagaders (rood).. Aangegeven zijn de lange as van de baarmoederhoorns (pijlen) en het ligatiemengsel punten (onderbroken pijlen). De secties voor immunohistochemie worden gesneden langs het vlak van uitzicht.
Figuur 2:. Stereologische evaluatie van de arteriële verbouwing halverwege de zwangerschap (A) Voorbeeld assessment van luminale en de totale vaartuig gebieden op H & E gekleurde coupes van WT vrouwen in de centrale 2/4 van de decidua basalis (afgebakend door de verticale zwarte stippellijnen) op gd9.5. In de vaten bij een hogere vergroting, de rode stippellijn bakent totale schip, geel gestreepte lijn afbakent lumen gebied. Bar = 500 pm (links), 50 pm (rechts). De lange as van de uterus is een horizontale lijn in deze oriëntatie. (B) Kwantificering van luminale ruimtes (linker paneel) en de verhouding van luminale gebied om de totale oppervlakte vat (rechts paneel) van WT (C57BL / 6) en RAG2 - / - Il2rg - / - muizen (op C57BL / 6 achtergrond). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde van 15 metingen (5 metingen per afdeling, 3 secties per implantatie). Staven vertegenwoordigen gemiddelde van n = 11-13 implantatieplaatsen van 4 zwangerschappen per groep; p-waarde uit een tweezijdige, ongepaarde Mann-Whitney-test. WT: wildtype.
Figuur 3:. Immunohistochemische detectie van gladde spier actine in de decidua basalis vertegenwoordiger SMA kleuring op WT (boven) en RAG2 - / - IL2rg - / - muizen (op C57BL / 6 achtergrond, bodem) en gd9.5. Bar = 100 urn. WT: wildtype.
Discussie
De hier gepresenteerde protocol is ontworpen om een reproduceerbare methode om de vasculaire veranderingen die nodig zijn voor succesvolle zwangerschap te beoordelen. Kritiek voor het succes van deze evaluatie de kwaliteit van de weefselsecties. Zowel nauwkeurig bepalen van de zwangerschapsduur van de implantatieplaatsen als betrouwbaar ligeren van de baarmoeder slagaders zijn cruciale stappen. Veranderingen in parameters zoals de tijd van fixatie, tissue-processing protocol, etc. kunnen ook het resultaat beïnvloeden. Voor een onbevooroordeelde stereologische beoordeling is het belangrijk om hetzelfde aantal vaartuigen in elke implantatieplaats te meten. Het wordt aanbevolen om 5 schepen per implantatie en elke implantatie in drievoud te meten. Het gemiddelde van deze 15 metingen is de gemiddelde grootte van de 5 grootste vaten.
Naar aanleiding van de gegevens van alymphoid RAG2 - / - IL2rg - / - muizen hier, vonden we dit protocol nuttig voor een aantal modellen van onvoldoende maternale immuunsysteem, waaronder een van geremde NK-cellen 14. Defecten in arteriële hermodellering zijn ook aangetoond in modellen van verminderde trofoblastinvasie 18 en de hier beschreven technieken kan nuttig zijn om de vasculatuur beoordeeld in deze gevallen. We gevalideerd en het protocol voor het onderzoeken van deciduale vasculaire remodellering halverwege de zwangerschap in muizen, maar het is ook denkbaar om dit protocol passen om te werken in andere modelsystemen (bijvoorbeeld ratten) of in andere organen. Hoewel we vinden dat de NK-afhankelijke remodeling robuust kan worden beoordeeld op gd9.5 kan worden aangepast voor andere tijdstippen zoals gd12.5, wanneer de maternale vasculatuur volledig vernieuwd. Op dit tijdstip, endovasculaire trofoblastinvasie dieper 16 en dit tijdstip kan geschikter voor onderzoeken van de rol van trofoblast voor vasculaire veranderingen. Als aanvullende kwantitatieve uitlezingen gewenst,onderzoekers kan ook verhoging van het aantal secties gekleurd voor SMA en beoordeelt het percentage gedeeltelijk gerenoveerd schepen binnen elke implantatie.
Een beperking van dit protocol is het beschrijvend karakter van histologische onderzoeken. Functionele assays worden echter slechts langzaam beschikbaar komen (bijvoorbeeld Doppler 19). Deze technieken vereisen technische expertise en veel hogere kosten van aanschaf en het onderhoud materiaal, maar hebben het voordeel dat een longitudinale in vivo uitlezing voor het effect van de veranderingen die histologisch kunnen worden waargenomen. Een mogelijk nadeel van alle stereologische examens is de subjectiviteit van de onderzoekers. Daartoe waarbij twee onafhankelijke onderzoekers dat alle monsters zelfstandig verwerken kan helpen om dit probleem te vermijden. Terwijl de hier geschetste protocol geeft inzicht in hoeveel bloed het fetomaternal interface kan bereiken, kan het voordelig zijn te combineren met de compl wordenementary benadering van de beoordeling van de totale hoeveelheid bloed op elk moment in de vasculatuur door plastische werpt 16.
De sterkte van dit protocol is dat het twee onafhankelijke benaderingen. Vasculaire veranderingen wordt eerst kwantitatief beoordeeld door stereologie en het resultaat wordt vervolgens kwalitatief gevalideerd middels immunohistochemie. De betrouwbaarheid van de resultaten kan verder worden versterkt door randomizing de monsters. De voorbereid protocol monsters kan gemakkelijk worden ook onderzocht andere parameters van de zwangerschap als decidualisatie, ontwikkeling van de mesometrial lymfoïde aggregaat zwangerschap (MLAp) of immunodetectie van cellen van belang, om een zwangerschap fenotype streng beoordeeld op midgestation.
Arteriële remodeling is een cruciale stap voor de ongecompliceerde zwangerschappen bij vrouwen en het falen van deze veranderingen ten grondslag ligt aan de grote verloskundige syndromen (GOS), namelijk pre-eclampsie, foetale groei beperking endoodgeboorte. Wij presenteren hier technieken om een zwangerschap fenotype in muismodellen die enkele kenmerken van de pathofysiologie van GOS nabootsen zorgvuldig te beoordelen.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen alle leden van het Colucci-lab bedanken voor de nuttige discussies. Dit werk werd gefinancierd door The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research en The British Heart Foundation.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 muizen (8-12 weken oud) | Charles River | ||
| Tandzijde | |||
| Polystyreen | Wordt gebruikt om weefsel op zijn plaats te houden | ||
| Rechte dissectieschaar | EMS | 72940 | |
| 25 G naalden | BD | 300600 | Wordt gebruikt om weefsel op zijn plaats te houden |
| 50 ml conische buizen | Falcon | 352070 | |
| Formaline oplossing, neutraal gebufferd, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffine | Sigma | 327204-1KG | |
| XYleen | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Geautomatiseerde weefselprocessor | Sakura | 6032 | |
| Microtoom | Leica | RM2245 | |
| Dia's rek | Sigma | Z710989 | |
| Coplin pot | Sigma | S5891 | |
| Gezuiverd water | |||
| Hematoxyline oplossing, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosine Y oplossing | Sigma | HT110116-500ML | |
| Afzuigkap | |||
| XYleen-gebaseerde montage media | VWR | 361254D | |
| Diascanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Diascanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Natriumcitraat tribasisch dihydraat | Sigma | 32320 | Maak 10 mM oplossing en pas pH aan tot 6 |
| Snelkookpan | Wordt gebruikt voor antigeen herstel | ||
| Verwarmingsplaat | Wordt gebruikt voor antigeen herstel | ||
| Hydrofobe barrièrepen | Vector | H-4000 | |
| Waterstofperoxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris gebufferde zoutoplossing | Sigma | T6664-10PAK | |
| Muis op muis kit | Vector | BMK-2202 | Vermindert achtergrond significant |
| Muis anti-menselijke gladde spier actine | DAKO | M0851 | Reageert kruisgewijs met muis |
| IgG2a isotype controle | DAKO | X0943 | |
| Bevochtigde kamer | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine oplossing | Sigma | D4293-5SET | |
| Zoutzuur | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
Referenties
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies. Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy. Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy. Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).
- Ashkar, A. A., et al. Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy. J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).
- Barber, E. M., Pollard, J. W. The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).
- Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. How does variability of immune system genes affect placentation. Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. Deep placentation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).
- Colucci, F., Kieckbusch, J. Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus. Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Xiong, S., et al. Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation. J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).
- Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).
- Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling. Nat Commun. 5, (2014).
- Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth. Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).
- Adamson, S. L., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).
- Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation. J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).
- Hu, D., Cross, J. C. Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta. Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).
- Zhang, J. H., Croy, B. A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).
Herprints en machtigingen
