Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Enhancers controleren de celidentiteit door weefselspecifieke genexpressie te reguleren op een positie- en oriëntatie-onafhankelijke manier. Deze enhancers zijn vaak distaal van het gereguleerd gen gelegen in intergene regio's of zelfs binnen het lichaam van een ander gen. De positie-onafhankelijke aard van enhanceractiviteit maakt het moeilijk om enhancers te matchen met de genen die ze reguleren. Deletie van een enhancerregio levert direct bewijs voor enhanceractiviteit en is de gouden standaard om de rol van een enhancer in endogene gentranscriptie te onthullen. Conventionele op homologe recombinatie gebaseerde deletiemethoden zijn overschaduwd door recente vorderingen in genoombewerkingstechnologie die snelle en precies gelokaliseerde veranderingen in de genomen van talrijke modelorganismen mogelijk maken. CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking kan worden gebruikt om het genoom in veel celtypen en organismen snel en kosteneffectief te manipuleren, vanwege de gemak waarmee Cas9 kan worden gericht op het genoom door een geleide RNA van een op maat gemaakte expressieplasmide. Homozygote deletie van essentiële gen-regulerende elementen kan leiden tot letaliteit of een verandering van het cellulaire fenotype, terwijl mono-alleel deletie van transcriptionele enhancers de studie van cis-regulatie van genexpressie mogelijk maakt zonder dit verstorende probleem. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie in F1 muis embryonale stamcellen (ES) (Mus musculus129 x Mus castaneus). Mono-alleel deletie, screening en expressieanalyse wordt vergemakkelijkt door enkele nucleotidepolymorfismen (SNP) tussen de twee allelen die gemiddeld elke 125 bp in deze cellen voorkomen.
Inleiding
Transcriptionele regulatoire elementen cruciaal zijn voor spatio-temporeel fijnafstelling van genexpressie tijdens de ontwikkeling 1 en wijziging van deze elementen kan leiden tot ziekten door afwijkende genexpressie 2. Veel ziekte-geassocieerde gebieden geïdentificeerd door genoomwijde associatiestudies in niet-coderende gebieden en hebben kenmerken van transcriptie enhancers 3-4. Identificeren enhancers en matchen met de genen die ze reguleren wordt bemoeilijkt doordat zich meestal verscheidene kilobasen verwijderd van de genen die ze reguleren en kan worden geactiveerd in een weefsel-specifieke wijze 5-6. Enhancer voorsp....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. ontwerpen en bouwen van de gRNA
- Verwijderen transcriptie enhancer regio's maken gebruik van twee gRNAs, een 5 'en een 3' van de regio van belang. Gebruik de muis UCSC genoom browser spoor gegenereerd door de Zhang laboratorium unieke gRNA sequenties te identificeren (http://www.genome-engineering.org 15). Volgende Controleer deze gRNAs en hun aangrenzende PAM voor SNPs en indels het gebruik van online tools die door de Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28. Om beide allelen met evenveel efficiëntie te richten, te voorkomen gRNA / PAM sequenties die een SNP of Indel bevatten.
- ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hier beschreven protocol gebruikt F1 ES-cellen cis -regeling van genexpressie bestuderen monoallelische enhancer verwijderde cellen gegenereerd met CRISPR / Cas9 genoom bewerking (figuur 1). De gRNA en allelspecifieke primer ontwerp voor genotypering en genexpressie zijn de belangrijkste factoren in deze aanpak. Elk allel-specifieke primer set moet worden gevalideerd door qPCR om allel specificiteit te bevestigen. Allelspecifieke primers die alleen hun genomi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
CRISPR / Cas9 gemedieerde genoom editing-technologie biedt een eenvoudige, snelle en goedkope methode voor het genoom modificatie. De methode die hier beschreven voor het genereren en te analyseren monoallelische enhancer schrapping voor functionele enhancer karakterisering maakt gebruik van SNPs in de F1 muizencellen. De voordelen van deze benadering zijn: 1) monoallelische enhancer deleties niet verstorende effecten die plaatsvinden wanneer een kritische enhancer geschrapt beide allelen, dwz een grote verlagi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben het beleid Jupiter's op belangenverstrengeling te lezen en hebben geen conflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen alle leden van het Mitchell-lab bedanken voor hun nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research, de Canada Foundation for Innovation en het Ontario Ministry of Research and Innovation (operationele en infrastructurele subsidies in handen van JAM).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Neon Transfection System 100 µL Kit | Life Technologies | MPK10096 | Microporator transfection technology |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | genomic DNA extraction reagent |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| High-Speed Plasmid Mini Kit | Geneaid | PD300 | |
| Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free | Geneaid | PME25 | |
| SYBR select mix for CFX | Life Technologies | 4472942 | qPCR reagent |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 170-8891 | Reverse transcription reagent |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS without Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0.5 M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1 M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES cell qualified | FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Non-essential aminoacid | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| Sealing tape | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | alcohol-free cell freezing container |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
Referenties
- Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
- Kleinjan, D. A., Lettice, L. A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
