Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

12.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53552

⸱

2 april 2016

 , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Samenvatting

Enhancers controleren de celidentiteit door weefselspecifieke genexpressie te reguleren op een positie- en oriëntatie-onafhankelijke manier. Deze enhancers zijn vaak distaal van het gereguleerd gen gelegen in intergene regio's of zelfs binnen het lichaam van een ander gen. De positie-onafhankelijke aard van enhanceractiviteit maakt het moeilijk om enhancers te matchen met de genen die ze reguleren. Deletie van een enhancerregio levert direct bewijs voor enhanceractiviteit en is de gouden standaard om de rol van een enhancer in endogene gentranscriptie te onthullen. Conventionele op homologe recombinatie gebaseerde deletiemethoden zijn overschaduwd door recente vorderingen in genoombewerkingstechnologie die snelle en precies gelokaliseerde veranderingen in de genomen van talrijke modelorganismen mogelijk maken. CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking kan worden gebruikt om het genoom in veel celtypen en organismen snel en kosteneffectief te manipuleren, vanwege de gemak waarmee Cas9 kan worden gericht op het genoom door een geleide RNA van een op maat gemaakte expressieplasmide. Homozygote deletie van essentiële gen-regulerende elementen kan leiden tot letaliteit of een verandering van het cellulaire fenotype, terwijl mono-alleel deletie van transcriptionele enhancers de studie van cis-regulatie van genexpressie mogelijk maakt zonder dit verstorende probleem. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie in F1 muis embryonale stamcellen (ES) (Mus musculus129 x Mus castaneus). Mono-alleel deletie, screening en expressieanalyse wordt vergemakkelijkt door enkele nucleotidepolymorfismen (SNP) tussen de twee allelen die gemiddeld elke 125 bp in deze cellen voorkomen.

Inleiding

Transcriptionele regulatoire elementen cruciaal zijn voor spatio-temporeel fijnafstelling van genexpressie tijdens de ontwikkeling 1 en wijziging van deze elementen kan leiden tot ziekten door afwijkende genexpressie 2. Veel ziekte-geassocieerde gebieden geïdentificeerd door genoomwijde associatiestudies in niet-coderende gebieden en hebben kenmerken van transcriptie enhancers 3-4. Identificeren enhancers en matchen met de genen die ze reguleren wordt bemoeilijkt doordat zich meestal verscheidene kilobasen verwijderd van de genen die ze reguleren en kan worden geactiveerd in een weefsel-specifieke wijze 5-6. Enhancer voorspellingen zijn vaak gebaseerd op histonmodificatie merken, mediator-cohesin complexen en binding van celtype-specifieke transcriptiefactoren 7-10. Validatie van voorspelde enhancers wordt meestal gedaan door een vector gebaseerde test waarbij de enhancer expressie van een reportergen activeert 11-12. Deze gegevens valuable informatie over de wettelijke mogelijkheden van vermeende enhancersequenties, maar niet hun functie onthullen in hun endogene genomische context of identificeren van de genen die ze reguleren. Genoom bewerking dient als een krachtig middel om de functie van transcriptionele regulatoire elementen in hun endogene context met verlies-van-functie analyse bestuderen.

Recente ontwikkelingen in het genoom van het bewerken, namelijk de CRISPR / Cas9 genoom editing systeem, vergemakkelijken het onderzoek van genoom-functie. De CRISPR / Cas9 is eenvoudig te gebruiken en bruikbaar voor biologische systemen. De Cas9 eiwit is gericht op een specifieke plaats in het genoom van een gids-RNA (gRNA) 13. De SpCas9 / gRNA complex scant het genoom van de beoogde genomische sequentie die moet 5 'een protospacer aangrenzende motief (PAM) sequentie, NGG 14-15. Baseparing van de gRNA om zijn doel, een 20 nucleotide (nt) sequentie die complementair is aan de gRNA, activeert SpCas9 nuclease-activiteit resulteert in een double breuken (DSB) 3 bp stroomopwaarts van de PAM reeks. Specificiteit wordt bereikt door volledige basenparing in het gRNA zaad regio, de 6-12 nt naast de PAM; omgekeerd, niet overeenkomt met 5 'van het zaad worden gewoonlijk getolereerd 16-17. De geïntroduceerde DSB kan worden gerepareerd door de niet-homologe end-joining (NHEJ) DNA repair of homologie gerichte reparatie (HDR) mechanisms.NHEJ DNA herstel veroorzaakt dikwijls insertie / deletie (indels) van enkele bp op de doelplaats die kunnen verstoren het open leeskader (ORF) van een gen. Om grotere deleties in het genoom twee gRNAs, die het gebied van belang flankeren genereren, kan worden gebruikt 18-19. Deze benadering is bijzonder nuttig voor het bestuderen van transcriptionele enhancers geclusterd in locus controle gebieden of super-enhancers die groter zijn dan conventionele versterkers 9,18,20-22 zijn.

Monoallelische schrappingen zijn een waardevol model voor het bestuderen van cis -regeling van transcriptie. De waargenomen Change in transcriptieniveau monoallelische na verwijdering van een versterker correleert met de rol van deze versterker in genregulatie zonder verstorende effecten die kunnen optreden wanneer de transcriptie van beide allelen mogelijk beïnvloed beïnvloeden cellulaire fitness. Evaluatie verminderde expressie is echter moeilijk zonder de mogelijkheid om onderscheiden verwijderd uit het wildtype allel. Bovendien genotypering deleties op elk allel zonder de mogelijkheid om de twee allelen te onderscheiden is moeilijk, vooral bij grote deleties van> 10 kb tot 1 Mb 23, waarbij het ​​moeilijk is om de hele wild type gebied te amplificeren door PCR. Het gebruik van F1-ES-cellen gegenereerd door kruising Mus musculus 129 met Mus castaneus kunnen de twee allelen te onderscheiden door allel-specifieke PCR 18,24. De hybride genoom in deze cellen vergemakkelijkt allelspecifieke deletie screening en expressie analyse. Gemiddeld is er een SNP elke 125 bp tussen de twee genomen, Het verstrekken van flexibiliteit in primer ontwerp voor expressie en genotypering analyses. De aanwezigheid van één SNP kan de primer smelttemperatuur (Tm) beïnvloeden en doelwitspecificiteit in real-time kwantitatieve PCR (qPCR) amplificatie waardoor discriminatie van de twee allelen 25. Verder een mismatch in het 3 'uiteinde van de primer grote invloed op het vermogen van DNA-polymerase om zich vanaf de primer voorkomen amplificatie van de ongewenste allel doel 26. Beschreven in het volgende protocol is het gebruik van F1 ES cellen voor allelspecifieke enhancer deleties van meer dan 1 kb en daaropvolgende expressie analyse met behulp van CRISPR / Cas9 genoom bewerkingssysteem (figuur 1).

figure-introduction-1
Figuur 1. Enhancer schrapping gebruik CRISPR / Cas9 studeren cis -REGning van genexpressie. (A) F1 ES-cellen gegenereerd door een kruising tussen Mus musculus 129 en Mus castaneus worden gebruikt om te zorgen voor allelspecifieke verwijdering. (B) Two guide RNA (gRNA) worden gebruikt om een grote Cas9 gemedieerde deletie van de enhancerregio induceren. (C) primersets worden gebruikt om grote mono- en bi-allelische deleties identificeren. De oranje primers de primers in de paarse primers de buitenste primers en de groene primers gRNA de flankerende primers. (D) Veranderingen in genexpressie worden bewaakt in de allelspecifieke qPCR. RFU geeft relatieve fluorescentie-eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. ontwerpen en bouwen van de gRNA

  1. Verwijderen transcriptie enhancer regio's maken gebruik van twee gRNAs, een 5 'en een 3' van de regio van belang. Gebruik de muis UCSC genoom browser spoor gegenereerd door de Zhang laboratorium unieke gRNA sequenties te identificeren (http://www.genome-engineering.org 15). Volgende Controleer deze gRNAs en hun aangrenzende PAM voor SNPs en indels het gebruik van online tools die door de Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28. Om beide allelen met evenveel efficiëntie te richten, te voorkomen gRNA / PAM sequenties die een SNP of Indel bevatten.
    1. Hoewel de keuze van de gRNA, te controleren op de haalbaarheid van het ontwerpen van allel-specifieke primers voor genotypering van de verwijdering. Zie sectie 5 voor allelspecifieke primer design.
  2. Duw de twee gRNA plasmiden op basis van de in Mali et al. 2013 15 beschreven protocol. Verwerk de geselecteerde unieke 20 bp doelsequentie into de 61mer oligonucleotiden zoals aangegeven in tabel 7 (sequenties worden weergegeven in de 5 'naar 3' oriëntatie, en de vetgedrukte basen zijn de 20 bp doelsequentie die omgekeerde complementen van elkaar).
    1. Meng 10 pl 10 pM gRNA Primer_F en 10 pl 10 pM complementaire Primer_R in een rol.
    2. Hybridiseren de primers door het incuberen van de primer mengsel bij 100 ° C gedurende 5 min en koel daarna 1 ° C / s tot 25 ° C. Voor deze stap gebruikt een PCR machine of Plaats de buis in kokend water en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. Om de gegloeide primer mix, voeg de volgende reactiemengsel en incubeer bij 72 ° C gedurende 30 min elke primer te verlengen: 18,5 pl water, 10 pl 5x HF buffer, 1 pl 10 mM dNTP mix en 0,5 pl high- fidelity DNA polymerase.
    4. Run 10 pl doelfragment op een 2% agarose gel om de bevestiging 100 bp guide fragmenten geproduceerd.
    5. Lineariseren de gRNA vector (een geschenk van GeoRGE Kerk; Addgene plasmide # 41824) 15 met Afl II met de volgende reactie opgezet: 5 pl gRNA vector backbone (2-4 ug), 5 ui 10X buffer, 3 pl AflII (20 eenheden / pl) en 32 pl van water. Incubeer het reactiemengsel gedurende 3 uur bij 37 ° C.
    6. Voer het gedigereerde product op een 1% agarosegel en het DNA te zuiveren band die overeenkomt met het 3,5 kb gelineariseerd gRNA vector onder toepassing van een gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.
    7. Opgericht Gibson samenstel reacties 29-30 via gelineariseerde vector gRNA en target fragment uit stap 1.2.3 als volgt: 1 pl lineaire gRNA vector (50 ng / ul), 1 ui doelfragment, 10 ui 2x Gibson samenstel hoofdmengsel en 8 pl water. Incubeer reacties bij 50 ° C gedurende 60 minuten.
  3. Transformatie van E. coli cellen met gemonteerd gRNA Vector.
    1. Meng 1 pl van het geassembleerde vector gRNA van 1.2.7en 50 pl DH5a (E.coli stam) cellen in een buis. Transformeer de DH5a cellen door hitteschok werkwijze door de cellen bloot te stellen aan 42 ° C gedurende 45 sec.
    2. Snap chill de buizen op ijs gedurende 5 minuten; voeg 400 gl SOC medium en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 45 minuten in een schudincubator.
    3. Spread 100 ul van de DH5a cellen op LB-kanamycine (50 ug / ml) platen voor positieve selectie van getransformeerde cellen en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
  4. Screening Positieve E.coli Kolonies voor gRNA invoegen.
    1. Kies een kanamycineresistente kolonie en resuspendeer in 3 ml LB met 50 ug / ml kanamycine. Herhaal hetzelfde voor 6-8 kolonies en incubeer alle buizen bij 37 ° CO / N in een schudincubator.
    2. Extract plasmiden uit de O / N gegroeide cultuur middels plasmide mini prep kit mbv handleiding van de fabrikant.
    3. Bereid een EcoRI vertering reactiemengsel om te controleren op gRNA reeks insertin het plasmide. Voor elk monster, het reactiemengsel als volgt: 2 pl enzym buffer, 1 ui EcoRI, 15 pl water. Aliquot het reactiemengsel in 1,5 ml buisjes en voeg 2 pl plasmide. Incubeer de buizen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
    4. Voer het gedigereerde product op een 1,5% agarosegel.
      Opmerking: De monsters met insert zal een 475 bp band formaat dat 100 bp hoger dan het klonen zonder inserts te geven.
      Opmerking: Als alternatief kan de positieve klonen worden gescreend door kolonie PCR met SP6 (voorwaarts) en T7 (reverse) primers (Tabel 7) die binden aan de vectorsequentie een 642 bp groot fragment bij aanwezigheid van een gRNA inzetstuk geven. De kolonie PCR benadering is voordelig wanneer er een EcoRI-restrictieplaats binnen het gRNA sequentie.
  5. Bevestig de volgorde van de gRNA Insert door DNA-sequentiebepaling met gebruikmaking van de T7 Primer.

2. Transfectie

Notitie:Elektroporatie is een efficiënte methode transfecteren plasmiden in ES-cellen. De hier beschreven methode maakt gebruik microporator transfectie technologie.

  1. Groeien F1 ES-cellen in een 10 cm gelatine gecoate schaal met 10 ml ES-celmedium (tabel 1) bij 37 ° C / 5% CO2. Wanneer de cellen te bereiken 85% samenvloeiing verwijder de media en voeg 2 ml trypsine. Incubeer bij 37 ° C in de CO2 incubator gedurende 5 min.
    Opmerking: F1 ES-cellen werden uit Barbara Panning 24 verkregen en zijn beschikbaar op aanvraag.
  2. Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 10 ml van spin medium (tabel 2). Pipet herhaald om de cellen volledig los te maken.
  3. Verzamel alle cellen in een 15 ml buis en draaien op 300 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in 3 ml PBS en tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.
  4. Pellet 1 x 10 6 ES-cellen in een 1,5 ml buis door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in 100 ul R (resuspensie) buffer zoals geleverd door de fabrikant kit.
  5. Voeg 5 ug elk van pCas9_GFP (een geschenk van Kiran Musunuru; Addgene plasmide # 44719) 31, 5 'en 3' gRNA plasmiden voor verwijdering van het doelgebied en meng voorzichtig met een pipet om de introductie van luchtbellen te vermijden.
  6. Gebruik de elektronische pipet tip om 100 ul van de elektroporatie mix te zuigen, let daarbij goed op een luchtbel in de punt te voorkomen.
  7. Programmeer de volts, breedte en peulvruchten voor elektroporatie. Voor F1 ES-cellen, gebruik 1400 V, 10 msec voor 3 pulsen.
  8. Terwijl de elektroporatie wordt uitgevoerd in acht van de tip om naar te kijken voor eventuele vonken in de oplossing. Een vonk geeft de aanwezigheid van een luchtbel en zal interfereren met de transfectie.
  9. Werp de getransfecteerde ES-cellen in een 10 cm gelatine gecoate schaal met 10 ml ES-celmedium (Tabel 1) en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2.

3. FACS sorteren getransfecteerde cellen

  1. Na 48 uur, maak de cellen door toevoeging van 2 ml trypsine en incubeer bij 37 ° C in de CO2 incubator gedurende 5 min.
  2. Neutraliseren van de plaat door het toevoegen van 10 ml van de collectie buffer (tabel 3). Verzamel de cellen in een 15 ml buis en draaien op 300 xg gedurende 5 minuten.
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml sorteren buffer (tabel 4). Tel de cellen en verdund basis van de sortering platform. Verdun de cellen tot 0,5-1 x 10 6 cellen / ml voor het sorteren in 15 ml buizen en voor het sorteren van afzonderlijke cellen rechtstreeks in 96-well platen, verdunnen de cellen tot 2,5 x 10 6 cellen / ml.
  4. Sort Cas9-GFP + ES-cellen met een FACS flowcytometer 32. Verzamel cellen los in buizen met 2 ml recovery medium (Tabel 5) en plaat zoals beschreven in 3.5 voor kolonie plukken of sorteren afzonderlijke cellen direct in gelatine gecoate 96-well platen bevattende 100 pi ES celmedium / putje ( tabel 1).
  5. Zaad 1-1,5 x 10 4 GFP + ES-cellen in een 10 cm gelatine gecoate schaal met 10 ml ES-celmedium (tabel 1). Plating bij deze lage dichtheid zal vergemakkelijken plukken individuele ES-cel kolonies.

4. Het kweken Klonen voor genotypering, Expression Analyse en vriescel Stocks

  1. Op dag 4-5 na sortering scoren elk putje rechtstreekse gesorteerd 96-well platen voor de aanwezigheid van ES-cel kolonies.
    1. Distantiëren ES cel kolonies door het verwijderen van de media en het toevoegen van 30 pl trypsine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 170 ul van ES-cel medium (tabel 1) en pipet op en neer volledige dissociatie van de kolonie in enkele cellen. Groeien de cellen bij 37 ° C / 5% CO2 totdat de meeste putten dan 70% confluent (gewoonlijk 2-3 dagen).
  2. Als alternatief pick individuele ES-cel kolonies van 10 cm gerechten meteen omgekeerde microscoop. Na opzuigen van de kolonie in de pipetpunt follow stap 4.1.1 plaatsen van elke kolonie in een putje van een 96-well plaat, voorbehandeld met gelatine en bevattende 30 pl trypsine.
    Opmerking: Kolonies kunnen in trypsine zitten bij kamertemperatuur terwijl een hele rij van kolonies is geplukt.
  3. Zodra alle kolonies werden opgepikt en gedissocieerd in media groeien de cellen bij 37 ° C in de CO2 incubator tot de meeste putten zijn dan 70% samenvloeiing (gewoonlijk 2 dagen).
  4. Wanneer de 96-well platen klaar voor splitsing, verwijder de kaart, voeg 30 ul trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 180 ul van ES-cel medium (tabel 1) aan elk putje en pipet op en neer volledige dissociatie in enkele cellen.
  5. Uit de resulterende 210 pi, 70 pi zaad in drie gelatine gecoate 96-well platen elk 130 pi ES celmedium / putje (tabel 1). Gebruik deze platen voor genotyping, expressie analyse en vriescel bestanden voor elke kloon zoals hieronder beschreven.
  6. Wanneer de genotypering plaat 70-85% samenvloeiing bereikt, de behandeling van de plaat zoals beschreven in hoofdstuk 6 "Genotypering het verwijderen".
  7. Wanneer de expressie analyse plaat 70-85% samenvloeiing bereikt, verwijder de media, sluit de plaat met afdichtband en bewaar bij -80 ° C tot het klonen zijn genotype.
    Opmerking: De expressie analyse plaat nuttig om veranderingen in genexpressie analyse in de vroege passages van de klonen. Genexpressie analyse van de 96-well plaat is mogelijk, maar als de celaantallen zijn vanaf een RNA-micro-extractie kit wordt aanbevolen.
  8. Bereiding van Freeze 96-well plaat Stock:
    1. Wanneer de plaat voor bevroren cellen aandelen (stock-1) 70-85% confluentie bereikt, zuig de media, voeg 30 ul trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
    2. Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 100 ul van ES-cel medium (tabel 1) to elk putje en pipet op en neer voor volledige dissociatie in enkele cellen.
    3. Overdracht 15 ul van gesuspendeerde cellen uit elk putje twee gelatine beklede 96 putjes, die elk 185 pi ES celmedium (Tabel 1) en laat groeien bij 37 ° C / 5% CO2.
      Let op: Dit is voor voorraad-2 en -3 platen die extra back-up klonen in het geval de heropleving van de cellen uit voorraad-1 zijn niet succesvol is.
  9. Ondertussen, aan de 100 ul van de resterende cellen in de 96-well plaat (stock-1), voeg 100 pl 2x vriesmedium (Tabel 6). Sluit de plaat met een tape en snel omkeren de plaat 4-5 keer voor een goede menging. Bewaar de plaat bij -80 ° C tot klonen genotype.
  10. Wanneer de stock-2 en stock-3 platen klaar voor invriezen aspiraat media, voeg 30 ul trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 70 pl ES celmedium (Tstaat 1) aan elk putje en pipet op en neer volledige dissociatie in enkele cellen.
  11. Voeg 100 ul van 2x bevriezing media, sluit de plaat met afdichtband en snel de plaat omkeren 4-5 keer voor een goede menging. Bewaar de plaat bij -80 ° C totdat deze platen nodig.

5. allelspecifieke primer ontwerp

  1. Ontwerp 4 primersets (figuur 1C) het klonen van de gewenste deletie scherm: binnen primers, buitenste primers en gRNA flankerende primers (zowel 5 'en 3' gRNA doelplaatsen) zoals hieronder beschreven.
    1. Het verkrijgen van de SNP spoor overeenkomt met de 129 en Cast genotypes bij http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. Het opgegeven nummer toont base substituties tussen 129 en Cast op de coördinaten in de MM9 muis genoom montage.
      Opmerking: De link naar de bovenstaande site zal leiden naar de UCSC genoom browser en voeg een custom track met de SNPs tussen de 129 en Cast gegouw.
    2. Voer de coördinaten van het gebied moet worden verwijderd. Opnieuw in een gebied van ongeveer 500 bp in het midden van de gewenste deletie bevattende> 3 SNPs.
    3. Ga naar Beeld> DNA in de optiebalk en klik krijg DNA aan de doelsequentie te downloaden in alle hoofdletters formaat.
    4. Maak twee FASTA sequenties; een voor 129 en één voor Cast door base substitutie op de SNP positie. Markeren de SNPs door een kleine letter.
    5. Ga naar Primer3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) en plak de SNP vervangen 129 volgorde. Gebruik de standaardinstellingen om primers te ontwerpen.
    6. Om het ontwerp van de binnenkant allelspecifieke primers Primer_List selecteren in de taak daling menu en klik Pick primers. Kies een voorwaartse of reverse primer die een SNP heeft ofwel in het 3 'uiteinde of binnen 4 basen van het 3'en valt binnen het gebied wordt verwijderd.
      Let op: primers die een SNP op het 3'-uiteinde scherm hebben verhoogd allel specificiteit in qPCR.
    7. Om de tweede primer terugkeer naar de hoofdpagina te selecteren, selecteert Detection in de taak daling menu en plak de eerste primer sequentie in het juiste vak aan de onderkant van de pagina. In het tabblad Algemene instellingen wijzigt u de instelling voor het product grootte bereik 80-200 bp en klik Pick primers. Koos voor een primer set van de genoemde primer paren; zullen de 129 binnen allelspecifieke primers.
    8. Herhaal de stappen 5.1.5 tot 5.1.7 te primers te ontwerpen voor de Cast allel.
    9. Keer terug naar de UCSC genoom browser en voer de coördinaten van het gebied moet worden verwijderd. Ga naar Beeld> DNA in de optiebalk, onder Sequence Retrieval Regio opties toe te voegen 1.000 bp upstream en downstream klik krijg DNA met de doelsequentie te downloaden.
    10. Markeer de gRNA doelsequentie tussen haakjes. Bewaar deze hele reeks voordat u verder gaat.
    11. Het ontwerpen van de buitenste primers verwijder de sequentie tussen de twee gRNA doelsequenties. Herhaal stap 5.1.4-5.1.8 naar buiten allelspecifieke primer ontwerps maar verander de grootte van het product 400-800 bp.
    12. Splits de sequentie verkregen in stap 5.1.10 in twee sequenties met elk 500 bp 5 'en 3' van het gRNA doelsequentie. Herhaal de stappen 5.1.5 tot 5.1.7 ontwerpen van non-allel specifieke primers voor gRNA flankerende regio's, maar verander de grootte van het product 400-800 bp.
      Opmerking: Voor niet-allelspecifieke primers, hetzij 129 of Cast sequentie kan worden gebruikt en primers worden gekozen die geen SNP bevatten. Het is raadzaam om een ​​product grootte van 400-800 bp die voor het ontwerpen en buiten gRNA flankerende primers. Dit maakt amplificatie zelfs als kleine indels aanwezig zijn.
  2. Test de binnenkant primers voor allel specificiteit door qPCR behulp van pure 129 en Cast stam genomische DNA bij 2 ng / ul. Volg stap 6,2-6,4 voor het opzetten van de qPCR reactie.
    Opmerking: Als het 129 genotype in het doelgebied is hetzelfde als C57BL / 6J, DNA van C57BL / 6J kan worden gebruikt in plaats van 129 DNA. Allelspecifieke primers ten minste 5 cycli weergevenverschil tussen de Ct (cyclus drempelwaarde) waarde op de juiste versus onjuiste genotype. De buitenste primers kunnen worden getest om te garanderen dat ze versterken de deletie behulp Cas9 / gRNA getransfecteerde ES-cellen, en F1 genomisch DNA als respectievelijk positieve en negatieve controles. Het allel-specifieke primers van buiten kan worden getest nadat de mono-klonen geïdentificeerd.

6. genotypering de verwijdering

  1. Extract genomisch DNA van de genotypering 96-wells plaat met de plaat uit stap 4.6, dat is gegenereerd na expansie kolonie.
    1. Bereid de genomische DNA-extractie mix: 89 pl water, 10 ui 10X buffer en 1 ui extractie reagens (geleverd door de fabrikant). Voeg 100 pl genomisch DNA extractie mengsel aan elk putje en sluit de plaat met een afdichtband.
    2. Incubeer de plaat bij 75 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door 95 ° C gedurende 5 minuten.
    3. Laat de plaat afkoelen door incubatie op ijs gedurende enkele minuten eend dan centrifuge kort om eventuele condens naar de bodem van de put. Dit dient als het matrijs-DNA plaat voor verwijdering screening.
  2. Stel de qPCR reacties in tweevoud voor elke kloon als volgt: 5 pi 2x SYBR qPCR mix, forward en reverse primer (3 uM) per 1 pl en 1 pl water. Gebruik een multichannel pipet 2 pl matrijs-DNA, gevolgd door 8 pi reactiemengsel en aan elke van de 384-wells plaat.
  3. Seal de plaat met afdichtband en draaien op 600 g gedurende 2 minuten om de inhoud te mengen. Plaats de 384-wells plaat array in de real-time fietser.
  4. Programmeer de real time cycler voor een 2-staps PCR gevolgd door smelt curve analyse met detectie als volgt: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 min, 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 62 ° C gedurende 30 sec met plaat lezen en 95 ° C gedurende 10 s, 65 ° C tot 95 ° C met een toename van 5 ° C gedurende 5 sec + plaat lezen.
    Opmerking: In aanvulling op het ontwerp primer, de qPCR mix en cyclusparameters dragen bij aan specificiteit primer. De bovenbeschreven parameters en reagentia in de genoemde materialen vaker op allelspecifieke amplificatie.
  5. Het analyseren van qPCR resultaten
    1. Controleer elke allel voor versterking met binnenkant allelspecifieke primers. Geen versterking van één allel of hoge Ct waarde verschillen (> 5 cycli) tussen allelen suggereren deze klonen dragen een heterozygote deletie van het allel met de hoge / afwezige Ct waarde. Geen versterking van beide allelen suggereert dat ze dragen een homozygote deletie.
    2. Controleer elke allel voor versterking met externe allel-specifieke primers. Als het doel deletie groter is dan 1 kb amplificatie met buitenste primers alleen optreedt als een deletie aanwezig is. Een CT-waarde van 22-28 bevestigt de verwijdering. Voor doelgroep schrappingen kleiner dan 1 kb, bevestigen de amplicon grootte door elektroforese.
      Let op: Als de buitentemperatuur primers tonen slechts een matige allel-specificiteit (zie FiguAd 2), kunnen amplicons verkrijgbaar zowel allelische primersets in monoallelische klonen door naast zit amplificatie van de buiten gelegen primers. In dit geval moet een Ct-waarde tussen de twee allelen van ten minste vijf cycli de juiste allel (lagere Ct-waarde) geschrapt gebaseerd op de resultaten van binnenuit primers resultaten te bevestigen. Als de on target versus off doel allel Ct verschil is minder dan vijf cycli het ontwerpen van nieuwe allelspecifieke buiten primers.
    3. In monoallelische deletieklonen controleert de integriteit van de niet-gedeleteerde allel met de tweede test gRNA flankerende primers.
      Opmerking: INDELs van> 25 bp grootte rond de gRNA doelplaats kunnen worden geïdentificeerd door het observeren van een verandering in de smelt curve in het qPCR van 400-800 bp amplicons. Als alternatief kan de amplicons van het gRNA flankerende primers worden gesequenced om kleine indels van <25 bp gedetecteerd.
      1. Voer qPCR met 2 sets van gRNA flankerende primers ie, 5 'en 3' GRNA gebruikt zijn CRISPR deletie. Geen amplificatie met deze primersets geeft INDELs groter dan de qPCR amplicon bij het gRNA doelplaats op de niet-gedeleteerde allel van mono-deletieklonen zijn. Ontdoen klonen die deze grote indels verdere analyse de resultaten moeilijk te interpreteren zonder de omvang van de deletie.
  6. Zuiver de amplicons verkregen van buiten qPCR primer onder toepassing van een PCR kit ruimen volgende instructies van de fabrikant.
  7. Bevestigt de sequentie van het verwijderde allel door DNA sequentiebepaling van de gezuiverde PCR-product van de vorige stap. Gebruik de qPCR amplificatieprimers voor vooruit en achteruit sequencing.
    Opmerking: In dit stadium SNPs binnen het amplicon fungeren als een secundaire bevestiging van het genotype van de verwijderde allel.

7. Expressie analyseren met allelspecifieke primers

  1. Ontdooi de 96-well cel stock platen opgeslagen bij -80 ° C (stock-1 uit stap 4.9) door het op een warm bad kraal. Wanneer meer dan de helft van de putjes in de plaat worden ontdooid, rotatie bij 300 xg gedurende 5 minuten.
  2. Verwijder voorzichtig de tape en zo snel mogelijk de cellen van de deletie positieve putjes in met gelatine beklede, 12 putjes bevattende 1 ml ES-celmedium (Tabel 1) en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2.
  3. Wanneer de plaat bereikt 70-85% confluentie passage van de cellen en ze splitsen in drie putjes van een met gelatine bekleed, 6-well plaat, die elk 2 ml ES celmedium (tabel 1). Met twee putten 2 flesjes ingevroren cellen bestanden bereiden voor langdurige opslag in vloeibare stikstof (in stap 8 beschreven) en de derde put voor RNA-extractie.
  4. Extract RNA met een RNA extractie kit.
  5. Converteren 100-500 ng RNA in cDNA door reverse transcriptie (RT) het RNA met behulp van de cDNA-synthese kit volgens het protocol van de fabrikant. Onder andere een RT nNegatief reactie voor elk RNA-monster de hoeveelheid verontreinigend DNA in het RNA-monsters te volgen.
  6. Verdun het cDNA voor qPCR in een verhouding van tussen 1: 2 en 1: 4; afhankelijk van het expressieniveau van het doelwitgen in ES-cellen.
  7. Stel de qPCR hierboven inbegrip F1 genomisch DNA standaard curve (5 voudige verdunningen 250-0,08 ng / ul) voor absolute kwantificering van transcriptniveaus beschreven. Vergelijk de expressie van elk allel van het gen van interesse in elk bevestigd verwijderd kloon aan een besturingskaart gen, bijvoorbeeld GAPDH (primers in tabel 7 vermeld).
    Noot: Controle gen primers hoeven niet allelspecifieke zijn. Allelspecifieke primer ontwerp is hetzelfde voor RT-qPCR primers zoals beschreven voor genotypering primers uitgezonderd het doelgebied voor amplificatie. De gensequentie toe te passen; bij gebruik van primers voor één exon of intron-exon grens (primaire transcript controleren) F1 genomisch DNA kan worden gebruiktde standaardcurve. Voor meer informatie over RT-qPCR verwijzen wij u naar Forlenza et al. 2012 33.

8. Freeze Stock Voorbereiding voor langdurige opslag van ES-cellen

  1. Voeg 300 ul trypsine aan elk 6 putjes (uit stap 7.3) en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Voeg 2 ml van spin medium (tabel 2) trypsine en pipet op en neer te neutraliseren meermaals dissocieert in enkele cellen.
  2. Breng de cellen in een 15 ml buis en draaien op 300 xg gedurende 5 minuten.
  3. Zuig het supernatant en voeg 500 ul van ES-cel medium (tabel 1). Pipet op en neer om de cellen te mengen.
  4. Breng de inhoud naar een 1,5 ml cryovial buis en voeg 500 pl 2x ES-cel freezing medium (tabel 3). Meng goed door het buisje en plaats de buis in een alcohol-vrij cel bevriezing container. Plaats deze cel containers bevriezen bij -80 ° C gedurende ten minste 12 uur voor transferrineg in vloeibare stikstof opslagtank.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier beschreven protocol gebruikt F1 ES-cellen cis -regeling van genexpressie bestuderen monoallelische enhancer verwijderde cellen gegenereerd met CRISPR / Cas9 genoom bewerking (figuur 1). De gRNA en allelspecifieke primer ontwerp voor genotypering en genexpressie zijn de belangrijkste factoren in deze aanpak. Elk allel-specifieke primer set moet worden gevalideerd door qPCR om allel specificiteit te bevestigen. Allelspecifieke primers die alleen hun genomi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CRISPR / Cas9 gemedieerde genoom editing-technologie biedt een eenvoudige, snelle en goedkope methode voor het genoom modificatie. De methode die hier beschreven voor het genereren en te analyseren monoallelische enhancer schrapping voor functionele enhancer karakterisering maakt gebruik van SNPs in de F1 muizencellen. De voordelen van deze benadering zijn: 1) monoallelische enhancer deleties niet verstorende effecten die plaatsvinden wanneer een kritische enhancer geschrapt beide allelen, dwz een grote verlagi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben het beleid Jupiter's op belangenverstrengeling te lezen en hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen alle leden van het Mitchell-lab bedanken voor hun nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research, de Canada Foundation for Innovation en het Ontario Ministry of Research and Innovation (operationele en infrastructurele subsidies in handen van JAM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530Shigh fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly
Gibson Assembly Master MixNEBE2611L
gRNA_Cloning VectorAddgene41824A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid
pCas9_GFPAddgene44719Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid
AflIINEBR0520S
EcoRINEBR3101S
Neon Transfection System 100 µL KitLife TechnologiesMPK10096Microporator transfection technology
prepGEMZyGEMPT10500genomic DNA extraction reagent
Nucleo Spin Gel & PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.5
High-Speed Plasmid Mini KitGeneaidPD300
Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free GeneaidPME25
SYBR select mix for CFXLife Technologies4472942qPCR reagent
iScript cDNA synthesis kitBio-rad170-8891Reverse transcription reagent
0.25% Trypsin with EDTALife Technologies25200072
PBS without Ca/Mg2+SigmaD8537
0.5 M EDTABioshopEDT111.500
HBSSLife Technologies14175095
1 M HEPESLife Technologies13630080
BSA fraction V (7.5%)Life Technologies15260037
Max Efficiency DH5α competent cellsInvitrogen18258012
FBSES cell qualifiedFBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency
DMSOSigmaD2650
GlutamaxInvitrogen35050
DMEMLife Technologies11960069
Pencillin/StreptomycinInvitrogen15140
Sodium pyruvateInvitrogen11360
Non-essential aminoacidInvitrogen11140
β-mercaptoethanolSigmaM7522
96-well plateSarstedt83.3924
Sealing tapeSarstedt95.1994
CoolCell LXBiocisionBCS-405alcohol-free cell freezing container
CHIR99021Biovision1748-5Inhibitor for F1 ES cell culture
PD0325901Invivogeninh-pd32Inhibitor for F1 ES cell culture
LIFChemiconESG1107Inhibitor for F1 ES cell culture

Referenties

  1. Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
  2. Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
  3. Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).
  4. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  5. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  6. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).
  7. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  8. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  9. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  10. Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).
  11. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  12. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).
  13. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  17. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  18. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).
  19. Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).
  20. Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).
  21. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  22. Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9 (12), e114485(2014).
  23. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  24. Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).
  25. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  26. Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).
  27. Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
  28. Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).
  29. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  30. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  31. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  32. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  33. Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
  34. Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).
  35. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

CRISPR Cas9 gemedieerde deletiemonoallellische deletieallelspecifieke primersenkelnucleotidepolymorfismenguide RNA ontwerpelectroporatie transfectieflowcytometrie sorteringextractie van genomisch DNAqPCR deletiescreening
Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.