Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft hoe je vloeistofbionchips bereidt met epitheelcellen van de kieuwen van regenbooforen voor gebruik in een draagbare elektrische cel-substraat impedantiesensor in het veld. Het protocol voor het uitvoeren van een snelle drinkwatertoxiciteitstest met de sensor wordt ook beschreven.

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft hoe men vloeibare biochips met epitheelcellen van de kieuwen van regenboogforel (RTgill-W1) kan bereiden voor gebruik in een draagbaar watertoxiciteitssensor in het veld. Een monolaag van RTgill-W1 cellen vormt zich op de sensorelektroden die in de biochips zijn ingesloten. De biochips worden vervolgens gebruikt voor testen in een draagbaar elektrisch apparaat voor cel-substraat impedantiemetingen (ECIS) dat is ontworpen voor snelle toxiciteitstesten van drinkwater. Het manuscript beschrijft verder hoe een toxiciteitstest kan worden uitgevoerd met behulp van de bereide biochips. Een controlewatermonster en het te testen watermonster worden gemengd met vooraf gemeten poedermedia en in aparte kanalen van de biochip geïnjecteerd. De impedantiemetingen van de sensorelektroden in elk van de biochipkanalen worden gemeten en vergeleken door een geautomatiseerd statistisch softwareprogramma. Het scherm op het ECIS-instrument geeft binnen een uur na het injecteren van de monsters aan of "Besmetting gedetecteerd" of "Geen besmetting gedetecteerd". Voordelen zijn de gebruiksgemak en de snelle reactie op een breed spectrum van anorganische en organische chemicaliën bij concentraties die relevant zijn voor gezondheidsproblemen bij mensen, evenals de langetermijnstabiliteit van opgeslagen biochips in een klaar te testen staat. Beperkingen zijn de vereiste voor koude opslag van de biochips en de beperkte gevoeligheid voor cholinesteraseremmers als pesticiden. Toepassingen voor deze toxiciteitsdetector zijn voor snel velddraagbaar testen van drinkwatervoorraden door personeel van het Leger voor Preventieve Geneeskunde of voor gebruik in gemeentelijke waterzuiveringsinstallaties.

Inleiding

Het algemene doel is een werkwijze voor het zaaien van cellen, opslag en het testen van vloeibare biochips in het ECIS biosensor ontwikkelen. Het doel voor de ontwikkeling van deze biosensor was even US Army specificaties voor een veld draagbaar apparaat dat mogelijke besmetting van het drinkwater voorziening kan detecteren gebruikt door soldaten. De eisen voor de toxiciteit sensor waren dat het een breed spectrum van toxische industriële verbindingen snel kunnen detecteren (binnen een uur) bij concentraties gezondheid van de mens, dat de inrichting veld draagbaar, en de biologische componenten zou een houdbaarheid hebben van ten minste negen maanden. Koeling, maar niet bevriezen, van bederfelijke componenten aanvaardbaar was.

Historisch gezien gebied draagbare water testtechnologieën met een biologische component daarvan (bijvoorbeeld antilichamen, enzymen of nucleïnezuren) analyt-specifieke ^1-3 geweest. Het nadeel van dit soort biosensoren is dat ze ONLy detecteren een soort chemisch tegelijk. Meerdere sensoren nodig als het vermoeden bestaat dat er meer dan één chemische stof aanwezig is. Als een bepaalde sensor niet in de test repertoire, kan chemische verontreinigingen in het water gemakkelijk onopgemerkt.

Brede toxiciteit sensoren, daarentegen, hebben het potentieel om deze technologie leemte. Deze hebben gewoonlijk een cellulaire component te ^4-8. De voordelen van brede toxiciteit biosensoren zijn dat zij de aanwezigheid van een breed scala aan chemische verontreinigingen, met inbegrip van mengsels en onbekenden, in een relatief korte tijd ^5,9,10 kan detecteren.

Het concept van het meten van de elektrische impedantie van celmonolagen als mogelijke toxiciteit sensor, die ook bekend staat als elektrische cel-substraat impedantiedetectie (ECIS), werd eerst beschreven door Giaever en Keese ^11. In de afgelopen twee decennia is gebleken een gevoelige indicator van de cel zijn Viabiliteit en cytotoxiciteit. In principe is de cel monolaag die is gehecht aan de elektroden op de biochips blootgesteld aan hoge frequentie en lage spanning en stroomsterkte wisselstroomsignaal. De confluente monolaag van cellen belemmert de elektronenstroom. Wanneer de integriteit van de cel monolaag wordt aangetast (zoals wanneer een toxische chemische stof wordt geïntroduceerd), de ECIS sensor registreert een verandering in de elektrische impedantie ^11-14. Figuur 1 illustreert het principe van ECIS ten opzichte van de cel monolagen worden biochip .

Figuur 1:.. Principe van ECIS Illustratie van een cel monolaag op een biochip met vereenvoudigde ECIS lezer elektrische schema Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvankelijk zoogdierlijke cellijnen werden uitgezaaid in vloeibare biochips en werden gebruikt in de ECIS sensortechnologie hier ¹² beschreven. Deze cellen waren niet praktisch voor gebruik in het veld, echter, omdat ze verplicht frequent media veranderingen, had een beperkte houdbaarheid, en vereist een kunstmatige CO _2-omgeving en een 37 ° C incubatietemperatuur. Er werd ontdekt dat een commercieel verkrijgbare cellijn afgeleid van regenboogforel gill epitheelcellen (RTgill W-1 cellen) kunnen worden getest bij kamertemperatuur bij omgevingstemperatuur CO _2, vormden een confluente monolaag in de biochips, kan worden bewaard bij koeltemperaturen, en had een snelle reactie (1 uur of minder) met een breed spectrum van chemische stoffen bij concentraties voor de volksgezondheid ¹² relevant. Toepassingen van RTgill-W1 cellen in toxicologie en in fundamenteel onderzoek, worden beoordeeld door Lee et al. ¹⁵

Werkwijzen voor het zaaien, opslag en het testen van vloeibare biochips diemonolagen van RTgill-W1 cellen op vloeibare biochips per ECIS biosensor worden beschreven. De vloeibare biochips kan worden opgeslagen voor maximaal 9 maanden in een gekoelde staat en kan worden geleverd in een koude opslag container, voor het testen van het drinkwater supplies.The begeleidende ECIS lezers, of testunits, worden apart verzonden. De biochips hebben twee componenten om hen; een bovenste laag van polycarbonaat met twee aparte vloeistof kanalen, en een lagere elektronische laag die vier elektroden per kanaal voor impedantie sensing bevat. Er zijn 10 werkende elektroden per pad; elke elektrode 250 urn in diameter. De geassembleerde biochips hebben goud elektrode aansluitingen voor het verwerven van impedantie metingen wanneer ingebracht in de ECIS testeenheid. Beide ingesloten vloeibare U-vormige kanalen 2 ml van de RTgill-W1 celsuspensie bevatten. Figuur 2 toont een vloeibare biochip in het ECIS lezer met een vergroting van een confluente cellen op een meetelektrode.

Figuur 2:.. Fluidic Biochip in ECIS Reader vergrote gebied toont een confluente monolaag van RTgill-W1 cellen op een enkele detectie-elektrode Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van testmaterialen

Opmerking: Om de biochips bereiden voor het testen, verscheidene confluente flessen van RTgill-W1 cellen moeten klaar staan. Een goede schatting van het aantal flessen nodig is een samenvloeiing T175 kolf gedurende 16 biochips worden gezaaid.

1. Voer de volgende stappen in een klasse II bioveiligheidskast (biohood) met behulp van aseptische techniek. Gebruik 70% ethanol voor het ontsmetten van de biohood en materialen geplaatst in de kap.
   1. Bereid fibronectine substraat voor de vloeibare biochips door ontdooien een 1 mg flesje van fibronectine en verdunnen in 100 ml steriel L-15 medium voor een concentratie van 10 ug / ml. Bevriezen in 40 ml aliquots in steriele 50 ml conische polypropyleen buizen bij -20 ° C. Ontdooien bij kamertemperatuur enkele uren vóór het zaaien biochips. Eenmaal ontdooid, niet opnieuw invriezen.
   2. Bereid celkweekmedia door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamine supcomplement en 5 ml penicilline / streptomycine-oplossing (10.000 eenheden penicilline / ml en 10.000 pg streptomycine / ml) bouillon aan 500 ml L-15 media. Dit wordt 560 ml celkweekmedium bevattende 9% serum werd verkregen. Koel.
      Opmerking: Dit zal de volledige celkweek media gebruikt voor de cultuur kolven en biochips zijn.
2. Gepoederde Media Flesjes
   1. Bereid van tevoren 0,1 dram snap-cap flacons met 60 mg ± 0,5% van de L-15ex poeder met behulp van een geautomatiseerde poeder dispenser. Label de flesjes met de datum van de poeder werd afgegeven en in de koelkast flesjes (in hoeveelheden van 50) in hersluitbare gemetalliseerde plastic zakken; elk drie 1 g silicagel uitdroging packs.
      Opmerking: L-15ex poedervormige media flacons kunnen worden gemaakt en bewaard tot 9 maanden voorafgaand aan het testen.
3. Voeg een oplossing van 100 ml 20% bleekmiddel door verdunning bleekmiddel met gedeïoniseerd (DI) water. Schatten dat 5 ml bleekwater oplossing nodig zullen zijn voor elk biochip.
4. Voeg biochip buis samenstellen door snijden 27 mm gedeelten van autoclaveerbare biocompatibele buis (2 delen per biochip wordt gezaaid) en breng de uiteinden van de buis met polycarbonaat slip luer fittings. Plaats tubing samenstellingen in een autoclaveerbare zak en autoclaaf gedurende 8 minuten bij 134 ° C. Ook autoclaaf biochip pluggen (2 per biochip) in een aparte zak bij dezelfde instellingen.
5. Autoclaaf DI water gedurende 30 min at121 ° C.
   Opmerking: Dit water wordt gebruikt voor het spoelen biochips na zaaien. Schatten dat 10 ml nodig zullen zijn voor elke biochip.
   Opmerking: Het werkelijke volume van elk biochip kanaal 2 ml, maar 5 ml steriel water wordt gespoeld door middel van elk kanaal na verwijdering van bleekwater-oplossing.
6. Voeg spuitinjectie buis samenstellen door snijden 27 mm gedeelten biocompatibele buizen en bevestigen mannelijke luer slip installatiemateriaal aan beide uiteinden van de buis. Plaats de slang assemblages in een papieren warmte-seal sterilisatie zakje en autoclaaf gedurende 8 minuten bij 134 &# 176; C.

2. Fluidic Biochip Seeding Procedure

Opmerking: Voer alle procedures waarin de biochips of de media wordt behandeld in een klasse II bioveiligheidskast met behulp van aseptische techniek.

1. Vierentwintig uur voor de geplande zaaien, verwijder de biochips van de fabrikant verpakking in de biohood en plaats in gesteriliseerde plastic instrument gevallen.
2. Steriliseer het biochips met een 20% bleekmiddeloplossing als volgt
   Opmerking: Historisch gezien heeft deze procedure bleken schimmelgroei in de biochips voorkomen tijdens langdurige opslag in het geval dat het plasma sterilisatie van de biochips gedaan door de fabrikant was niet effectief.
   1. Met behulp van een steriele 20 ml spuit met een injectiespuit injectie buis constructie bevestigd en werken in de biohood injecteren 2 ml van de 20% bleekwater oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips te zitten gedurende 1 uur met de bleekwater oplossing.
   2. Na één uur vacuüm aspRazend het bleekmiddel oplossing van beide kanalen met een steriele mannelijke slip luer montage aan de afzuiging slang. Gebruik een van de biochip slang assemblages als een drain bij het spoelen van de biochips.
   3. Met behulp van een steriele 20 ml spuit bevestigd aan een steriele injectiespuit inspuitsamenstel Spoel elk kanaal van de chip met 5 ml steriel water, zodat het overtollige water afvoer in een container in de biohood. Dan vacuüm aspireren uit het water als zojuist beschreven voor het bleekmiddel en plaats de biochips terug in de plastic instrument gevallen en laat in de biohood tot ingezaaid met cellen van de volgende dag.
3. Zestig min vóór het zaaien biochips Injecteer 2 ml van 10 ug / ml fibronectine oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips in de biohood gedurende 60 min, en vervolgens vacuüm aspireren van de fibronectine (zoals beschreven in stap 2.2.3) voor het zaaien de biochip met cellen. Plaats twee gedeelten van de biochip steriele buis samenstellen (zieparagraaf 1.4) op de havens van de biochips.
4. Trypsinize een confluente RTgill-W1 T175 kolf voor elke 16 biochips middels procedures in de American Type Culture Collection (ATCC) productbeschrijving plaat ^16.
   1. Aspireren van de media uit de samenvloeiing fles (s) van de cellen.
   2. Spoel de cel laag met 15 ml PBS en vervolgens te zuigen uit.
   3. Voeg 6 ml trypsine / EDTA de cellaag in elke T175 kolf en laat cellen trypsinize gedurende ~ 5 min.
   4. Voeg 15 ml volledige L-15 media voor celkweek aan elke kolf trypsine te stoppen.
   5. Combineer de celsuspensies in een steriele houder.
      Noot: Tankgrootte varieert 150-500 ml, afhankelijk van het aantal biochips worden gezaaid. Schatten dat 5 ml celsuspensie nodig zal zijn per biochip.
5. Verwijderen ~ 1 ml van de celsuspensie en plaats in een microcentrifugebuis voor het tellen. Met een helderveld microscoop met 10x DOELSTEve en een hemocytometer, behoren een 10 pl aliquot van de cellen en bereken het volume van volledige L-15 celkweekmedium nodig om een celsuspensie van 2,5 x 10 ⁵ cellen / ml bereiken.
   Opmerking: Bij gebruik van de celsuspensie aan kolven zaad aan de kweek voortgezet, zou dit het punt dat te doen. Pas de celsuspensie concentratie met behulp van volledige L-15 celkweek media.
6. Met behulp van een steriele 20 ml syringeattached een steriele injectiespuit injectie buis constructie (zie paragraaf 1.6), injecteer 2,5 ml van de celsuspensie in de buitenste poort van elk kanaal van de biochip (dwz de poorten die de slang bevestigd hebben), waardoor een deel van de extra celsuspensie uit de buis te stromen in een afvalcontainer in de biohood.
   Opmerking: Dit zal ervoor zorgen dat het hele kanaal en de bijgevoegde slang vol van de celsuspensie zal zijn.
   1. Maak een gesloten lus voor elk biochip kanaal door het invoegen van het vrije uiteinde van de slang met de Luer fitting in de buitenste poorten voor elk kanaal.
   2. Veeg overtollig papier uit de gesloten lussen met een papieren doek bevochtigd met 70% ethanol en zet de biochips terug in de plastic box aan een 20 ° C incubator. Geef elke biochip een uniek identificatienummer.
7. Op dag 4 en 7, verwijder de biochips uit de 20 ° C incubator vervult de media in alle biochips met temperatuur geëquilibreerd volledige L-15 celkweekmedium. Volg dezelfde procedure als in stap 2.6 met uitzondering van het gebruik slechts L-15 celkweek media in plaats (geen celsuspensie). Plaats de biochips terug in de 20 ° C incubator na 4 dagen voeden.
   1. Na de dag 7 voeden, te verwijderen en gooi de slangen van de chips en steek de geautoclaveerd aftappluggen in de biochips.
   2. Plaats de biochips in een doos in een 6 ° C incubator tot gebruik voor het testen.
      Opmerking: De chips kunnen worden bewaard bij koeltemperaturen tot 9 maanden en nog steeds levensvatbaar voor het testen in de ECIS lezers.

3. ECIS Testen met biochips

1. Bereid analyse chemicaliën als het gebruiken. (Zie Brennan, et al., 2012 ⁷ voor de bereiding van de test chemische stoffen).
2. Verwijder ECIS reader en test leveringen uit de draagtas. Verwijderen van een biochip bereid uit de 6 ° C incubator. Plaats de biochip op een papieren handdoek. Schakel de ECIS lezer.
3. Met behulp van 10 ml spuiten, afzien van 10 ml van de controle water in een gemerkte 0,5 ounce doorzichtige plastic controle pot en 10 ml van het monster in een gemerkte 0,5 ounce doorzichtige plastic-test pot.
   Opmerking: 1) Zorg ervoor dat u bellen te verwijderen voor een nauwkeurige meting. 2) De spuiten en potten hebben een kleurcode; blauw voor de controle en rood voor de test.
4. Verwijder de twee gepoederde media flacons uit de folie zakken. Open een van de gepoederde media flacons (gebruik multifunctionele tool indien nodig) en giet gehele inhoud van een flesje in de pot met controle water, laten vallen van de gehele flacon inoplossing ook. Herhaal deze procedure met de test pot. Dop en schud de potten zodat het poeder wordt opgelost.
5. Vul elk van de gekleurde 10 ml spuiten met 9 ml van ofwel controle (blauw spuit) of toets (rode spuit) oplossingen van respectievelijke flesjes. Verwijder luchtbellen uit spuiten.
6. Haal de stekkers uit de biochip havens en bevestig de afvoer.
7. Plaats de biochip in de verwijderbare plastic bak in de ECIS lezer en sluit het deksel.
8. Hechten injectiespuiten aan de buitenste biochip havens en bevestig de zuiger.
9. Vanuit het hoofdscherm, selecteer "NEXT" om pre-test te starten.
   Opmerking: Reader software impedanties controleren. Als impedanties zich binnen het bereik van de gebruiker (meestal tussen 1000 en 3000 ohm) het scherm registreert ingesteld "Cartridge Geslaagd", zoals aangegeven in figuur 3, en instrueer de gebruiker in staat om "Next" te selecteren en de software zal overgaan tot stap 3.10). Als de impedantie niet binnenhet ingestelde bereik als gevolg van een defecte biochip of gebrekkige aansluiting van de biochip om de lezer (meestal te wijten aan een foutieve uitlijning van de elektroden), dan zal het scherm registreren "Cartridge mislukt 'en zal de gebruiker de optie om ofwel" Afbreken "of "Controleer" de test.
   1. Selecteer "Afbreken" om terug te gaan naar stap 3.9). Selecteer "Controleer" om door te gaan naar stap 3.10) na ontvangst van een "Cartridge Passed 'boodschap en het selecteren van" Next ".
      Opmerking: Het beste is om de biochip nemen en visueel inspecteren op gebreken of lekt als een "Cartridge Failed" bericht wordt ontvangen alvorens met een nieuwe biochip.

Figuur 3:. ECIS Reader Screenshot van een Biochip met Acceptabel impedantie Readings Het screenshot toont eerste impedantie metingen in ohm van elk van de 4 control elektroden (CE) en 4 proefmonster elektroden (SE) binnen de vloeibare biochip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

10. Wanneer u wordt gevraagd door de lezer, voer monster informatie met behulp van een zachte toetsenbord en selecteer vervolgens "Accepteren" als u klaar bent.
    Let op: De ECIS reader software zal automatisch elke dataset met de datum, tijd en andere informatie door de gebruiker ingevoerde stempel; zoals de biochip nummer en het soort chemisch en concentratie. Twee min van impedantie gegevens worden verzameld uit de ingevoegde biochip en een timer op het scherm zal count-down tijd.
11. Na twee min als daarom wordt gevraagd door de instructies op het scherm die knipperen binnen een rode doos, klik op "NEXT". Wanneer u wordt gevraagd door een knipperende groene vak 'injecteren samples nu ", injecteer de controle en test media uit de bijgevoegde spuiten gelijktijdig in de biochip channels. Laat de spuiten op zijn plaats op de biochips als u klaar bent.
    Opmerking: impedantie waarden zullen eenmaal per minuut worden verzameld voor 60 min. Als de ECIS lezer software bepaalt dat de behandeling kanaal is statistisch significant verschillend van de controle-kanaal op elk punt tussen de 10 en 60 minuten na de start van de test, dan is de weergave op het scherm geeft aan dat het monster "Verontreinigde". Als de behandeling is niet anders dan de controle-kanaal, dan is het scherm toont "No Contamination gedetecteerd" aan het einde van de test run.
12. Record testresultaten besmet of niet verontreinigd voor elk monster.
13. Aan het einde van de test uit te voeren, te verwijderen en gooi de biochip. Spoel en air-droog de spuiten, testen flesjes en verwijderbaar plastic bakje waarin de biochip tijdens de tests gehuisvest.
    Opmerking: De ECIS lezer heeft 4 GB aan opslag aan boord van de operationele software, controle modellen en de testbestanden gegenereerd op basis van een test. Hierdoor kunnen meerdere Thousand testbestanden worden opgeslagen op de lezer. Bestanden kunnen worden opgehaald met een USB sprongaandrijving en overgebracht naar een computer voor verdere analyse voor onderzoeksdoeleinden indien gewenst.

Resultaten

De ECIS technologie beschreven in dit document onderging testen op de US Environmental Protection Agency (USEPA) gesponsorde Technology Testing and Evaluation Program (TTEP). Dertien chemicaliën werden geselecteerd voor het testen als vertegenwoordigers van een breed spectrum van industriële toxische verbindingen die kunnen worden genomen verontreinigingen van drinkwater. Tijdens het testen, 9 van de 13 werden gedetecteerd door ECIS binnen een uur bij concentraties die voor de gezondheid relevant zijn ^8. Tabel 1 toont de resultaten van deze verontreiniging testen. Figuur 4 representeert wat een "Verontreinigde" resultaat zou zien op de lezer scherm ECIS. Voor het grootste deel, cellulaire impedanties afgenomen voor verontreinigde monsters in vergelijking met controles. Soms kunnen bepaalde verbindingen een verhoging van de impedantie veroorzaken.

Ook samengevat in Tabel 1 is het schone water testen. Veertig schoon watermonsters werden uitgevoerd en er geen besmetting werd ontdekt in een van de monsters (zie figuur 5) voor een representatief screenshot van "No Contamination gedetecteerd".

Figuur 4: ECIS Reader Screenshot van een 'Besmette' Water Sample Een voorbeeld van een genormaliseerde impedantie graphics en resultaten van een watermonster die besmet was.. Blauwe lijnen geven genormaliseerde impedantie van elk van de stuurelektrodes; rode lijnen geven de genormaliseerde impedantie van elk van de test sample elektroden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: ECIS Reader Screenshot van een "No Contamination gedetecteerd" Water Sample Een voorbeeld van een genormaliseerde impedantie graphics en resultaten van een watermonster die niet besmet was.. Blauwe lijnen geven genormaliseerde impedantie van elk van de stuurelektrodes; rode lijnen geven de genormaliseerde impedantie van elk van de test sample elektroden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Categorie	verontreinigende	Geteste concentratie (mg / l) 1			Gedetecteerd ≤1 uur n = 4/4 chips
bestrijdingsmiddelen	aldicarb	0.17			Nee
	Arsen ic (natrium arseniet)	4.5			Ja
	Azide (natriumazide)	46.7			Ja
	fenamifos	0.56			Nee
	methamidofos	1.4			Nee
	methyl parathion	33.6			Ja
	Paraquat (dichloride)	4.6			Nee
	Pentachlorophenate (natrium)	71.9			Ja
Industrial Chemicals	ammonia	924			Ja
	Koper (koper II sulfaat)	103			Ja
	Cyanide (natrium)	Ja
	Kwik (chloride)	24.7			Ja
	Tolueen	444			Ja
Schoon Water 2	geen	NA			Nee
1 geteste concentraties zijn dezelfde als in het manuscript van Widder, et al. (2014).
2 40 schoon water monsters werden uitgevoerd met geen verontreiniging.

3 "> 14

Tabel 1: Verontreinigingen in watermonsters gedetecteerd door ECIS.

Discussie

De ECIS technologie goed gepresteerd in een laboratorium setting en was in staat om potentiële water verontreinigingen detecteren bij concentraties die voor de menselijke gezondheid van belang zijn. De draagbaarheid en de verpakking van de technologie maakt het bevorderlijk is voor gebruik in het veld.

Kritische stappen in het protocol voor het succes van de technologie zijn als volgt: 1) Handhaaf aseptische omstandigheden tijdens de cultuur, het zaaien, en het voeden van de biochips, 2) Houd de gezaaide biochips in gekoelde omstandigheden tot klaar om te testen, omdat de RTgill-W1 cellen zal niet lang als ze worden blootgesteld aan temperaturen boven 25 ° C te overleven, 3) weeg nauwkeurig de L-15ex in het poedervormige media flesjes en nauwkeurig de watermonsters te voorkomen die valse positieven, die kunnen worden veroorzaakt door een verschuiving in de osmolaliteit van media in plaats van monster toxiciteit, 4) Volg gebruiker aanwijzingen op het scherm ECIS voor het uitvoeren van de tests. De software in de lezer de gebruiker als een bi waarschuwenochip onaanvaardbaar te testen (op basis van initiële impedantie metingen) wanneer de biochip eerst in de lezer is geplaatst. Als de impedantie niveaus onaanvaardbaar testen, zal de software niet kan de gebruiker doorgaan met testen totdat een nieuwe biochip wordt gebruikt. Redenen voor onaanvaardbare impedantie metingen worden meestal veroorzaakt door een kleine speling van de biochip elektroden met ECIS lezer pennen of vloeistoflekkage langs een van de randen lijmen van de biochip.

Er zijn een aantal beperkingen aan deze technologie omdat de ECIS sensor is alleen getest met het drinken van water en niet met oppervlaktewater. De RTgill-W1 cellen die op de biochip kan niet tolereren bevriezing of temperaturen ver boven 25 ° C gedurende langere tijd (tijdsbestek kan variëren van uren tot dagen, afhankelijk van de temperatuur. De biochips functioneren het beste in een temperatuurbereik van de koelkast naar kamertemperatuur ^7. Ze zijn direct klaar voor gebruik, maar direct na het zijn removed van koude opslag. Draagbare koude opslag containers worden momenteel gebruikt door personeel van het Leger in het veld voor temperatuurgevoelige benodigdheden. Dezelfde containers kunnen worden gebruikt voor geënte biochip transport.

Een andere beperking van deze technologie is dat, hoewel het een breedbandig toxiciteit sensor, het niet goed reageren of helemaal naar cholinesterase remmende verbindingen, zoals sommige pesticiden. Deze mogelijkheid leemte wordt het ECIS sensor ontworpen voor gebruik in combinatie met een commercieel beschikbare snelle pesticide testbepaling bij het testen van watermonsters om de gebruiker een breder toxiciteit verschaffen. De kit is een snelle enzymatische test ontworpen om organofosfaat en carbamaat pesticiden binnen 30 min detecteren.

De ECIS sensor vormt een aanvulling op het keek uit-PM (Water Quality Analysis System - Preventieve Geneeskunde) veld water testsysteem, momenteel gebruikt door militairen preventieve geneeskunde personeel op te sporen, Arsenic, lood, of cyanide in drinkwater monster. Hoewel het ECIS sensor identificeert wat de verontreiniging is, zal aangeven of bepaalde metalen of organische verbindingen aanwezig zijn, wat aangeeft dat het water niet geschikt voor menselijke consumptie zijn. De ECIS testresultaten beschikbaar zijn binnen een uur. De monsters water kan vervolgens worden verstuurd voor verdere analyse voor de identificatie van de verontreiniging als er een positief testresultaat.

Zoals hierboven beschreven, wordt de lezer ECIS ontworpen als onderdeel van een systeem dat een aparte enzymatische ACE kit bevat om een ​​breed spectrum van verontreinigingsdetectie dekken. Beide lezers worden verpakt in een stevige koffer voor veld vervoer voor gebruik in het veld door soldaten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fetal bovine serum	Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com	16000-085	Opslaan bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur voor gebruik. Ingrediënt voor compleet L-15 celkweekmedium (10%).
Fibronectine, bovijn plasma	EMD Millipore Corp.   www.emdmillipore.com	341631-1 mg	Opslaan bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur voor gebruik. Meng met L-15 medium voor een concentratie van 10 μg/ml en bevries bij -20 °C in aliquots. Gebruik als substraat voor biochips.
L-15 medium zonder L-glutamine	Lonza  www.lonzabioscience.com	12-700F	Basaal medium voor celkweek en het voeden van biochips. Bewaren bij 6 °C.
L-15ex poeder medium met fenolrood	US Biological           www.usbio.net	L1501	Medium wordt afgewogen in 60 mg aliquots in 0,1 dram flacons en bewaard bij 6 °C in foliezakken met drogpotten. Negen maanden houdbaarheid. Gemengd met 10 ml watermonster voor testen in biochips.
PBS, zonder Ca2+ of Mg2+	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-516F	Bewaren bij kamertemperatuur. Gebruikt voor het spoelen van medium bij het trypsiniseren van celkweekkolven.
Trypsine, EDTA	Lonza  www.lonzabioscience.com	CC-5012	Opslaan bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur en gebruik voor het trypsiniseren van celkweekkolven.
T175 kweekkolven	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-30	Gebruikt voor het kweken van RTgill-W1 cellen.
Bleekwater	Chlorox                                                www.chlorox.com		Verdund tot 20% met millique of gedistilleerd water voor het schoonmaken van ECIS chips. Elke huishoudelijke bleekvloeistof is acceptabel.
70% ethyl alcohol			Voor het desinfecteren van biohood oppervlakken en alle materialen die in de biohood worden geplaatst.
Forelkieuwcellen (RTgill-W1)	American Type Tissue Culture Collection                www.atcc.org	CRL-2523	Cellen gekweekt en gebruikt voor biosensor (het zaaien van biochips).
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM	Lonza  www.lonzabioscience.com	35050-061	Opslaan bij kamertemperatuur.  Ingrediënt voor compleet L-15 celkweekmedium (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10K	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-602E	Opslaan bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur voor gebruik. Ingrediënt voor compleet L-15 celkweekmedium (1%).
Pharmed BPT slangen	U.S. Plastic Corp.         www.usplastic.com	57317	In 27 mm secties gesneden en geautoclaveerd. Gebruikt voor het zaaien van biochips met cellen en als een gesloten lus tussen mediaverversingen.
Polycarbonaat luer fittingen voor Pharmed slangenassemblages	Value Plastics	MTLS210-9	Bevestigd aan elk uiteinde van de gesneden Pharmed slang voor inbrenging in bichips.
20 ml spuiten, met slip-tip	VWR Scientific       us.vwr.com	BD302831	Gebruikt voor het injecteren van celsuspensie voor het zaaien van ECIS chips, evenals voor het voeden van chips.
0,1 dram snap-cap polypropyleen microvialen	Bottles Jars and Tubes, Inc.   www.bottlesjarsandtubes.com	30600	Gebruikt om 60 mg aliquots van L-15ex poeder medium op te slaan.
60 mil Lexan vloeibare ECIS biochips	Nanohmics, Inc.     www.nanohmics.com		Op maat gemaakt door Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cellen worden in de biochips geïnjecteerd en gezaaide chips worden in de ECIS-lezer geplaatst voor testen.
Autoclaveerbare kunststof instrumentenbox 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"	Medi-Dose EPS     medidose.com	IB701	Gebruikt voor het opslaan van het volgende; geautoclaveerde pluggen, gereinigde biochips, gezaaide biochips.
Papieren hitte-seal sterilisatiezakjes, 7 ½” x 13”	CardinalHealth          www.cardinalhealth.com	90713	Gebruikt voor het autoclaveren van slangen en fittingen en pluggen.
Quantos geautomatiseerde poederdispenser	Mettler Toledo       www.mt.com	QB5	Automatische distributie van 60 mg aliquots van poedervormig L-15ex in 0,1 dram vials.
ECIS lezer	Nanohmics, Inc.     www.nanohmics.com		Op maat gemaakt door Nanohmics, Inc. De gezaaide biochip wordt in de lezer geplaatst voor het uitvoeren van watertoxiciteitstesten.
3 x 5 gemetalliseerde 2,5 mil polypropyleen hersluitbare zakjes	Uline                       www.uline.com	S-16893	Verpakking