Methodenartikel

Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor

DOI:

10.3791/53564

⸱

6 april 2016

 ,  , 
1Biological Sciences, Virginia Tech

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een snel protocol voor proteolytische vertering met een zelfgebouwde flow-through tryptische microreactor gekoppeld aan een elektrospray-ionisatie (ESI) massaspectrometer wordt gepresenteerd. De fabricage van de microreactor, de experimentele opstelling en het proces voor gegevensverzameling worden beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De overgrote meerderheid van massaspectrometrie (MS) -gebaseerde eiwitanalyse werkwijzen omvatten een enzymatische digestie stap voorafgaand aan detectie, typisch met trypsine. Deze stap is noodzakelijk voor het genereren van kleine moleculaire gewicht peptides, doorgaans MW <3000-4000 Da, dat binnen het effectieve scanbereik van massaspectrometrie instrumenten vallen. Gebruikelijke protocollen betrekking O / N enzymatische digestie op 37 ° C. Recente ontwikkelingen hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende strategieën, gewoonlijk met het gebruik van een microreactor met geïmmobiliseerde enzymen of een reeks aanvullende fysische processen die de tijd die voor proteolytische digestie reduceren tot een paar minuten (bijvoorbeeld magnetron of high- druk). In dit werk beschrijven we een eenvoudige en rendabele benadering die in elk laboratorium kan worden toegepast voor het bereiken van snelle enzymatische vertering van een proteïne. Het eiwit (of eiwit mengsel) wordt geadsorbeerd op C18-gebonden omgekeerde fase performance vloeistofchromatografie (HPLC) silicadeeltjes voorgeladen in een capillaire kolom en trypsine in waterige buffer wordt toegediend gedurende de deeltjes gedurende korte tijd. Om on-line MS detectie mogelijk te maken, worden de tryptische peptiden geëlueerd met een oplosmiddel systeem met een verhoogd gehalte aan organisch materiaal direct in het MS ionenbron. Deze aanpak vermijdt het gebruik van dure geïmmobiliseerde enzymdeeltjes en vereist niet geen steun voor voltooiing van het proces. Eiwitvertering en volledige monsteranalyse kan worden uitgevoerd in minder dan 3 min ~ en ~ 30 min, respectievelijk.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De identificatie en karakterisering van gezuiverde eiwitten wordt vaak bereikt door MS technieken. Het eiwit wordt geknipt met een enzym en de peptiden worden verder geanalyseerd door MS via een eenvoudige infusie experimentele opstelling. Proteolytische digestie noodzakelijk voor het genereren van kleine peptidefragmenten die in de nuttige massabereik meeste MS analyzers vallen, en die gemakkelijk worden gefragmenteerd door lage botsenergie fragmentatie te aminozuursequentie informatie te genereren. Voor geïsoleerde eiwitten of eiwitmengsels eenvoudig, er geen verdere behoefte voor chromatografische scheiding van peptiden voorafgaand aan MS detectie. Een mengsel van 25-50 peptiden kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd door het inbrengen van het monster met een spuitpomp direct in het MS ionenbron.

De massaspectrometer kan de analyse uit te voeren en bevestig de sequentie van een eiwit binnen een kort tijdsbestek. Met moderne data-acquisitie methoden, kan dit proces worden bereikt wedurende enkele minuten of zelfs seconden. De beperkende factor bij het voltooien van het hele proces op een korte tijdschaal is de proteolytische vertering stap. Dit wordt typisch uitgevoerd gedurende enkele uren (of O / N) in oplossing bij 37 ° C met behulp van substraat: enzym verhoudingen van (50-100): 1. De enzymatische digestie tijd om minuten of seconden, geïmmobiliseerd enzym microreactoren Gewoonlijk verminderen, in de vorm van microfluïdische reactoren of commercieel verkrijgbaar cartridges, zijn beschreven. 1-6, wordt het enzym geïmmobiliseerd door covalente, niet-covalente / fysische adsorptie, complex formatie of inkapseling, 3,6 verhoogde de efficiëntie van het enzymatisch proces wordt mogelijk gemaakt door het grote oppervlak-tot-volume en enzym tot substraat verhouding. Bijkomende voordelen van geïmmobiliseerde reactoren onder verminderde autolyse en interferentie van het enzym in MS analyse verbeterde enzymstabiliteit en herbruikbaarheid. Een verscheidenheid van benaderingen, zoals glas of polymere microgefabriceerde inrichtingen zijn beschreven,gebruik enzymen geïmmobiliseerd op magnetische beads met antilichaam-antigen interacties 7,8 ingevangen in goud nanodeeltjes netwerken, 9 ingekapseld in titania-alumina sol-gels 10 en nanozeolites, 11 of gevangen met Ni-NTA en His-Tag complexvorming. 6 Alternatief , open buisvormige capillairen met geïmmobiliseerde enzymen zijn ontwikkeld en. 12 Bovendien verbeterde proteolytische splitsing werd aangetoond met gecontroleerde microgolfbestraling 13 of drukondersteunde of drukwisselingen technologie (PCT) om het reactietijden 30-120 min. 14

Ondanks de vele voordelen van geïmmobiliseerde enzym reactoren, de kosten voor commerciële cartridges is hoog, de beschikbaarheid van microfluïdische inrichtingen voor routinegebruik beperkt en het gebruik van microgolf of PCT technieken leidt tot behoefte aan extra apparatuur. Het doel van dit werk was om een ​​methode te ontwikkelen die circumvents deze nadelen en die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd in elk laboratorium onderzoekers machtigen met een eenvoudige en doeltreffende benadering voor het uitvoeren van enzymatische splitsing van eiwitten ter voorbereiding MS analyse binnen minuten. De benadering is gebaseerd op het gebruik van hydrofobe, C18-deeltjes die vooraf geïnstalleerd op een capillair of microfluïdische apparaat en de adsorptie van het eiwit (ten) van belang op deze deeltjes, gevolgd door enzymatische digestie tijdens de infusie van het enzym via gepakt bed en veroverde eiwit (s). In deze benadering wordt het substraat geïmmobiliseerd door niet-covalente interacties, en het enzym wordt toegediend via geïmmobiliseerde eiwit. De proteolytische digestie efficiëntie verhoogd met het grote deeltjesoppervlak gebieden die het eiwit enzymatische verwerking, verminderde afstanden en diffusie tijden en naar het oppervlak van de deeltjes bloot te leggen, verbeterde massaoverdracht, geen covalente binding die de activiteit van het enzym beïnvloeden, vermogen om snel evaluate combinaties van verschillende enzymen, disposability en multiplexing als het proces wordt uitgevoerd in een microfluïdische formaat. Deze aanpak wordt gedemonstreerd met behulp van een mengsel van standaard eiwitten en trypsine-de meest gebruikte enzym proteolytische digestie voorafgaand aan ESI-MS detectie. De massaspectrometer gebruikt voor detectie in deze studie was een lineair trap quadrupole (LTQ) instrument.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van de capillaire Microreactor

  1. Snijd de 100 urn inwendige diameter (ID) x 360 urn buitendiameter (OD) capillair met een lengte van 7-8 cm, en 20 urn x 90 urn ID OD capillaire 3-5 cm met de glazen capillair hakmes; controleren onder de microscoop dat beide capillaire uiteinden een schone, rechte snede, zonder uitstekende bramen.
  2. Plaats de 20 um ID x 90 micrometer OD capillair in een einde van de 100 um ID x 360 urn OD capillair, een lengte van ~ 6 mm; in geval van nood, acht deze operatie onder een microscoop.
  3. Breng een kleine druppel lijm E6000 rond de kruising van de 90 micrometer OD / 100 um ID capillairen met het uiteinde van een wattenstaafje en laat de lijm cure O / N bij kamertemperatuur.
  4. Snijd de ingevoegde 20 um ID x 90 urn OD capillair met een lengte van ~ 10-15 mm; dit zal de electrospray ionisatie emitter zijn.
  5. Pre-snijd de 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK en 1/16 "OD PTFE tubing in stukken van 4-5 cm lang; zullen de hulzen die in capillaire bonden voor het verschaffen van een lekvrije verbinding.
  6. Sluit het andere uiteinde van de 100 um ID x 360 micrometer OD capillair een PEEK-unie; Gebruik een 1/32 "PEEK huls voor het verschaffen van een lekvrije verbinding.
  7. Invoegen / draai een stuk van ~ 5 cm lang 1/16 "PTFE slang in de andere kant van de unie.
  8. Weeg ~ 4 mg C18 (5 pm) deeltjes in een vooraf schoongemaakte / gedroogde 2 ml glazen flesje; Voeg 0,5 ml isopropanol, sluit de flacon en de verspreiding van de slurry in de ultrasonicator bad.
  9. Terugtrekken met een 250 ul spuit ongeveer 200 ul slurry, steek de naald in de 1/16 "PTFE-buis van de PEEK unie, en afzien langzaam de slurry in de 100 um ID x 360 micrometer OD capillaire; observeren onder de microscoop als capillair gevuld met deeltjes tot een lengte van 2-3 mm verpakking bedraagt, zal de microreactor (figuur 1) de 20 μ.m ID capillaire houdt de deeltjes in de microreactor door een Keystone effect. 15
  10. Spoel de microreactor met ~ 50 pi oplossing van H2O / CH3CN 50:50 v / v, en daarna met ~ 50 pi oplossing van H2O / CH3CN 98: 2 v / v.

2. Voorbereiding van de Sample Solutions

Opmerking: Bewerkingen die gepaard gaan hanteren van organische oplosmiddelen en zuren en oplossing voorbereiding moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. Draag een veiligheidsbril, handschoenen en beschermende kleding.

  1. Spoelen met CH3OH en drogen enkele glazen flacons (4 ml) en polypropyleen buizen (15 ml).
  2. Bereid 10 ml van een oplossing van H2O / CH3CN (98: 2 v / v) in een 15 ml polypropyleen buis door mengen van 9,8 ml H2O met 200 pl CH3CN; meng door sonicatie.
  3. Bereid 10 ml van een oplossing van H2O / CH3CN (50:50 v / v) in een 15 ml polypropyleen buis door 5 ml H 2 </ sub> O met 5 ml CH3CN; meng door sonicatie.
  4. Bereid 4 ml van een aangezuurde waterige oplossing (/ v TFA 0,01% v) door toevoeging van 4 pl TFA (10%) aan 4 ml H2O / CH3CN (98: 2 v / v) in een 4 ml glazen flesje; meng door sonicatie.
  5. Bereid 4 ml van een aangezuurde organische oplossing (/ v TFA 0,01% v) door toevoeging van 4 pl TFA (10%) aan 4 ml H2O / CH3CN (50:50 v / v) in een 4 ml glazen flesje; meng door sonicatie.
  6. Weeg 16 mg NH 4 HCO 3 een analytische microbalans in een 4 ml glazen flesje; Voeg 4 ml H2O / CH3CN: oplossing (98 2 v / v) en dispergeren door sonicatie; Dit resulteert in een 50 mM oplossing van NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) in waterige buffer.
  7. Weeg 5 mg van een standaard eiwit (bijvoorbeeld runderserumalbumine, hemoglobine α / β, cytochroom C, koolzuuranhydrase, α-2-HS-glycoproteine, etc.) met een analytische microbalans in een 4 ml glazen flesje; voeg 4 ml DI water en verspreiden door sonicatie; Dit resulteert meestal in een high-level uM concentratie oplossing.
  8. Bereid 1 ml eiwitoplossing (1-2 uM) door verdunning van het hoge niveau uM concentratie oplossing met een geschikt volume NH 4 HCO 3 (50 mM) waterige buffer; meng door sonicatie.
  9. Bereid de trypsine-oplossing (5 uM) door oplossen van 20 g sequencing-grade trypsine in 170 gl NH 4 HCO 3 (50 mM) waterige buffer; verspreiden door sonicatie.

3. Experimentele Setup

Noot: De LTQ-MS systeem is uitgerust met een aangepaste ESI bron die een zelfgebouwde XYZ-fase die maakt koppeling van de massaspectrometer verschillende voorbeeldinvoer benaderingen omvat.

  1. Koppel de capillaire microreactor van het PEEK Unie en aan te sluiten op de PEEK-stuk.
  2. Plaats een ~ 2 cm lang Pt draad in de zijarm van de PEEK-stuk; Gebruik een 1/32 "PEEK sleeve voor het verstrekken van eenlekvrije verbinding en voor de isolatie van de draad Pt.
  3. Sluit een 50 um ID x 360 micrometer OD (~ 0,5 m lang) sample overdracht capillair naar de andere kant van de PEEK-stuk; Gebruik een 1/32 "PEEK huls voor het verschaffen van een lekvrije verbinding.
  4. Zet de PEEK-stuk van de XYZ-podium en de positie van de ESI emitter ~ 2 mm afstand van de massaspectrometer inlaat capillair.
  5. Sluit de Pt draad aan op de ESI voedingsbron van de massaspectrometer.
  6. Sluit het andere uiteinde van de monsteroverdrachtsstrook capillair aan de roestvrij stalen eenheid; Gebruik een 1/16 "PEEK huls voor het verschaffen van een lekvrije verbinding.
  7. Sluit een 4-5 cm lange 1/16 "PTFE slang aan het andere uiteinde van de roestvrijstalen eenheid en plaats de 250 ul spuitnaald in de PTFE-buis, zet de pomp en stellen de stroomsnelheid op de gewenste waarde (bijvoorbeeld 2 pl / min).
  8. Input tandem MS data-acquisitie parameters in het softwarepakket dat de MS instrument een bestuurtd opslaan als een methode bestand klaar de opstelling voor het uitvoeren van de analyse; voor de LTQ-MS-systeem, gebruikt u de volgende gegevens afhankelijke analyse parameters: dynamische uitsluiting ingeschakeld voor 180 sec met uitsluiting massa breedte ± 1,5 m / z; een MS scan gevolgd door een zoom en MS 2 scans op de top 5 meest intense pieken, zoom scan breedte ± 5 m / z; botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) parameters ingesteld op isolatie breedte 3 m / z, genormaliseerd botsingsenergie 35%, activering Q 0,25, en activering tijd 30 ms.

4. microfluïdische Setup

  1. Bereid een microfluïdische apparaat uit glas of polymere substraten, 16-18 de indeling van de inrichting wordt in figuur 2A, bestaande uit een microreactor (1) (0,13 mm breedte x 2 mm lengte x 50 pm diep) is verbonden met een inlaat (2 ), uitlaat (3) en een zijpoort (4); de onderling verbonden kanalen voor fluïde manipulaties zijn ~110 micrometer breed en ~ 50 micrometer diep; een meerkanaals structuur (5), bestaande uit ~ 1,5-2 urn diep x 10 micrometer x 100 micrometer breed lange microkanalen geplaatst 25 urn uit elkaar, zal fungeren als een filter voor het vasthouden van de deeltjes in de microreactor.
  2. Inschakelen fluïdum leverende verbindingen met de chip door lijmen gespecialiseerde aan op de inlaatpoorten, of door het ontwerpen van een polymeer stand het beslag past voor vloeistofafgifte (figuur 2B). 16
  3. Maak een suspensie van deeltjes C18 (5 pm) zoals beschreven in stap 1.8; leveren de slurry aan de microreactor met een spuit met 1/16 "PTFE slang verbonden met de chip zijpoort (4), sluit de poort na deeltjesbelading met epoxylijm en genezing van 1 uur in een oven bij 90 ° C 16.
  4. Plaats een capillair (20 um ID x 90 micrometer OD x 10 mm lengte) in de uitlaatpoort, afdichting met E6000 lijm, en genees O / N; dit zal de ESI zender geworden ( 6).
  5. Sluit een 50 um ID x 360 micrometer OD (~ 0,5 m lang) sample overdracht capillair aan de chip inlaatpoort (2); Sluit het andere uiteinde van de capillair een 250 ul en de naald pomp zoals beschreven in 3,6-3,7.
  6. Plaats een lichtgewicht PEEK-stuk-connector op het monster overdracht lijn vlak voor de inlaat (2) en plaats een Pt draad op de zijarm van het stuk, zoals beschreven in 3.2; Dit zal de ESI elektrode.
  7. Beveilig de microfluïdische apparaat op de XYZ podium met de ESI emitter geplaatst ~ 2 mm afstand van de massaspectrometer inlaat capillaire; bereiden MS als beschreven onder 3.8.

5. Sample laden, proteolytische digestie en Elution voor MS Analysis

Opmerking: Alle oplossing / monsteroverdrachtsstrook stappen worden uitgevoerd met behulp van een spuitpomp en moeten een paar extra minuten in beslag, ter compensatie van de dode volumes verbonden aan de transportlijnen en naar de microreactor; de nodige tijd hangt af van de stroomsnelheden betrokken.

  1. Spoel de microreactor en voor te bereiden voor analyse door infusie van een waterige oplossing van NH 4 HCO 3 (50 mM) in H2O / CH3CN (98: / v 2 v) en 2 pl / min gedurende 5 min; Gebruik een 250 ul injectiespuit.
  2. Laad het eiwitmonster (1 uM) aan de microreactor door het inbrengen van de monsteroplossing in 2 pl / min gedurende 5 min; Gebruik een 250 ul injectiespuit.
  3. Infuseren de trypsine-oplossing (5 uM) via geadsorbeerde eiwit op de microreactor bij 2 pl / min gedurende 1-3 min.
  4. Quench de proteolytische vertering door spoelen van de microreactor met een aangezuurde waterige oplossing van TFA (0,01% v / v) in H2O / CH3CN (98: 2 v / v) en 2 pl / min gedurende 5 min; Gebruik een 250 ul injectiespuit.
  5. Start elueren van het eiwit verteren van de microreactor door het inbrengen van een aangezuurde organische oplossing van TFA (0,01%v / v) in H2O / CH3CN (50:50 v / v) en 300 nl / min.
  6. Schakel de MS data-acquisitie-proces en de ESI spanning (~ 2000 V); verwerven MS-gegevens met behulp van de data-acquisitie parameters verschaft in stap 3.8; let op de elutie van de tryptische peptiden.

6. Data Processing

  1. Verwerk de tandem MS-gegevens met een zoekmachine verenigbaar is met de rauwe MS dataformaat.
    1. Verwerk de LTQ-MS Raw-bestanden met behulp van een organisme specifieke minimaal redundant eiwit databank; uploaden van de ruwe data in de zoekmachine, stelt de toleranties massa ouder en fragment ion tot en met 2 en 1 Da respectievelijk, en gebruik alleen volledig tryptische fragmenten met maximaal twee gemiste splitsingen voor de zoektocht; laten geen posttranslationele modificaties; Stel de hoge en middelhoge vertrouwen valse discovery tarieven (FDR) tot 1% en 3%, respectievelijk, en houden geen rekening met posttranslationele modificaties.
  2. Filter de gegevens alleen met veel vertrouwen te selecterenpeptide past bij de eiwitten in de databank; evalueren van de eiwit- en peptide-level resultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een representatief resultaat van een proteolytische digestie proces gelijktijdig uitgevoerd op een mengsel van eiwitten, met de hierboven beschreven microreactoren (figuren 1 of 2), is opgenomen in tabel 1. De tabel omvat de unieke peptidesequenties die een bepaald eiwit te identificeren, het kruis correlatie score (Xcorr) (dat wil zeggen, een score die de kwaliteit van de experimentele-to-theoretische match voor de overeenkomstige tandem massas...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in dit werk beschreven microreactor biedt een eenvoudig te implementeren experimentele opstelling voor het uitvoeren van enzymatische vertering van eiwitten MS analyse en identificatie in minder dan 30 minuten mogelijk. De duidelijke voordelen van dit systeem, in vergelijking met conventionele methoden, onder meer eenvoud, snelheid, laag reagensverbruik en lage kosten. In het bijzonder is er geen dure geïmmobiliseerd trypsine kralen en patronen. De bereiding van de capillaire microreactor is eenvoudig (figuur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NSF/DBI-1255991-subsidie aan IML.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ion trap ESI-MSThermo ElectronLTQDe LTQ massaspectrometer wordt gebruikt voor het verkrijgen van tandem MS-gegevens
XYZ stageNewportMeerdere onderdelenDe zelfgebouwde XYZ stage wordt gebruikt om de commerciële LTQ nano-ESI bron aan te passen om invoer van verschillende sample-leveringssystemen te ontvangen
Stereo microscoopEdmund opticsG81-278De microscoop wordt gebruikt om het microreactor-vulproces te observeren
Analytische weegschaal/MetlerVWR46600-204De weegschaal wordt gebruikt om de eiwitsamples te wegen
Ultrasoon bad/BransonVWR33995-540Het sonische bad wordt gebruikt voor het mengen/homogeniseren van de samples en het verspreiden van de C18 deeltjesslurry
Spuitpomp 22Harvard Apparatus552222De micropomp wordt gebruikt voor het laden, spoelen en elueren van de sample en het enzym op en van de gevulde capillaire microreactor
Milli-Q ultrapuur watersysteemEMD MilliporeZD5311595 Het MilliQ watersysteem wordt gebruikt om gezuiverde DI water te bereiden
Pipettor/Eppendorf (1.000 µl)VWR53513-410De pipettor wordt gebruikt om kleine volumes van sampleoplossingen te meten
Pipettor/Eppendorf (100 µl)VWR53513-406De pipettor wordt gebruikt om kleine volumes van sampleoplossingen te meten
Pipettor/Eppendorf (10 µl)VWR53513-402De pipettor wordt gebruikt om kleine volumes van sampleoplossingen te meten
Gesmolten silica capillair (100 µm ID x 360 µm OD)Polymicro TechnologiesTSP100375Deze capillair wordt gebruikt voor de fabricage van de microreactor
Gesmolten silica capillair (20 µm ID x 100 µm OD)Polymicro TechnologiesTSP020090Deze capillair wordt gebruikt voor de fabricage van de ESI emitter
Gesmolten silica capillair (50 µm ID x 360 µm OD)Polymicro TechnologiesTSP050375Deze capillair wordt gebruikt om de samples en het eluent van de spuitpomp naar de capillaire microreactor over te brengen
Glas capillair splijtwerktuigSupelco23740-UDit is een gereedschap voor het snijden van gesmolten silica capillairen op de gewenste lengte
LijmEclectic ProductsE6000 CraftDeze lijm wordt gebruikt voor het bevestigen van de ESI emitter in de capillaire microreactor of de microfluïdische chip
Epoxy lijmEpo-Tek353NDTDeze lijm wordt gebruikt om het microfluïdische inlaatgat te verzegelen waardoor de C18 deeltjes worden geladen
Omgekeerde fase C18 deeltjes (5 µm)Agilent TechnologiesZorbax 300SB-C18Dit zijn C18 deeltjes waarop de eiwitten worden geadsorbeerd; de deeltjes zijn geëxtraheerd uit een 4 mm x 20 cm C18 LC kolom van Agilent
Spuit/glas (250 µl)Hamilton81130-1725RNDe glazen spuiten worden gebruikt om de C18 deeltjesslurry in de capillaire microreactor te laden en om de sample en eluenten naar de microreactor te brengen
Interne reducerende PEEK Unie (1/16” tot 1/32”)ValcoZRU1.5FPKDeze unie wordt gebruikt om de 250 µl spuit aan de microreactor te verbinden voor het laden van de 5 µm deeltjesslurry
Roestvrij stalen unie (1/16”)ValcoZU1XCDe roestvrij stalen unie wordt gebruikt om de glasnaald van de spuit aan de infusie capillair te verbinden
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”)ValcoMT.5XCPKDe Peek tee wordt gebruikt om de sampletransfer capillair aan de capillaire microreactor te verbinden; op zijn zijarm maakt het de invoer van de Pt draad mogelijk
Tee connector (lichtgewicht)ValcoC-NTXFPKDeze Tee connector wordt gebruikt om ESI-spanning op de microfluïdische chip toe te passen via de sampletransfer lijn
Pt draad (0.404 mm)VWR66260-126De Pt draad zorgt voor elektrische verbinding voor ESI generatie en is verbonden met de ESI voeding van de massaspectrometer
PTFE buis (1/16” OD)ValcoTTF115-10FTDe Teflon buis wordt gebruikt om een luchtdichte verbinding tussen de spuitnaald en de roestvrij stalen unie mogelijk te maken 
PEEK buis (0.015” ID x 1/16” OD)Upchurch Scientific1565De Peek buis wordt gebruikt als hoes om een luchtdichte verbinding tussen de roestvrij stalen unie en de 50 µm ID transfer capillair mogelijk te maken
PEEK buis (0.015” ID x 1/32” OD)ValcoTPK.515-25De Peek buis wordt gebruikt als hoes om een lek-vrije verbinding tussen de gesmolten silica capillairen en de Peek Tee mogelijk te maken
Polimeer buis snijderValcoJR-797Deze snijder wordt gebruikt om de 1/16” en 1/32’ Peek polimeer buis die als hoes voor lek-vrije verbindingen wordt gebruikt in stukken van ~4-5 cm lengte voor te snijden
Bernstein vial (2 ml)Agilent HP-5183-2069De vialen worden gebruikt om sampleoplossingen en de C18 deeltjesslurry te bereiden 
Bernstein vial (4 ml)VWR66011-948De vialen worden gebruikt om sampleoplossingen te bereiden
Polypropyleen buis (15 ml)Fisher12-565-286DDe vialen worden gebruikt om bufferoplossingen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  2. Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
  3. Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
  4. Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
  5. Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
  6. Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
  7. Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
  8. Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
  9. Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
  10. Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
  11. Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
  12. Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
  13. Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
  14. Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
  15. Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
  16. Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
  17. Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
  18. Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
  19. Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
  20. Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
  21. Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
  22. Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
  23. Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Enzymatic DigestionFlow through MicroreactorProtein DigestionTrypsin SolutionC18 ParticlesMass SpectrometryCapillary ColumnElectrospray IonizationPeptide ElutionSample Analysis

Gerelateerde artikelen