Weefsel karakterisering na een New Uitsplitsing Methode voor de huid Micro-Enten Generation

Summary

Het protocol beschrijft een nieuwe methode om menselijke weefsels te splitsen en micro-autologe transplantaten die in combinatie met collageen sponzen, tot menselijk biologisch complexen klaar voor gebruik in de behandeling van huidletsels te maken. Verder dit systeem bewaart cellevensvatbaarheid van micro-grafts op verschillende tijdstippen na mechanische disaggregatie.

Abstract

Verschillende nieuwe werkwijzen ontwikkeld op het gebied van biotechnologie autologe cellulaire suspensies tijdens de operatie te verkrijgen, teneinde een stap behandelingen voor acute en chronische huidletsels. Bovendien is de behandeling van chronische maar ook acute wonden gevolg van trauma, diabetes, infecties en andere oorzaken, blijft een uitdaging. In deze studie beschrijven we een nieuwe methode om autologe micro-transplantaten van huidweefsel van een enkele patiënt en hun klinische toepassing. Bovendien werd in vitro biologische karakterisering van cutane weefsel afkomstig van de huid-de epidermized dermis (Ded) en de dermis van meerdere organen en / of multi-weefsel donoren ook uitgevoerd. Alle weefsels werden uitgesplitst naar dit nieuwe protocol, waardoor we levensvatbare micro-implantaten te verkrijgen. In het bijzonder hebben we gemeld dat deze innovatieve protocol kan bio-complexen bestaande uit autologe micro-transplantaten en collageensponzen klaar om te worden aangebracht op de huid laesies. de clinischappelijke toepassing autologe bio-complexen op een been laesie werd gemeld, dat een verbetering van zowel opnieuw epitalization proces en zachtheid van de laesie. Bovendien, onze in vitro model bleek dat de levensvatbaarheid van de cel na mechanische uitsplitsing met dit systeem voor maximaal zeven (7) dagen van de cultuur in stand wordt gehouden in de tijd. We hebben ook opgemerkt door middel van flowcytometrie-analyse, dat de verzameling van cellen verkregen uit uitsplitsing bestaat uit verschillende celtypen, waaronder mesenchymale stamcellen, dat een sleutelrol speelt bij de processen van weefselregeneratie en herstel uitoefenen, voor hun hoge regeneratieve mogelijkheden. Tenslotte hebben we aangetoond dat in vitro procedure handhaaft de steriliteit van micro-implantaten wanneer gekweekt in Agar gerechten. Samengevat concluderen wij dat deze nieuwe regeneratieve benadering veelbelovend hulpmiddel kan zijn voor clinici te verkrijgen in één stap levensvatbare, steriel en klaar voor micro-grafts die alleen of in combinatie kunnen worden toegepast met de meest voorkomende biologische scaffo gebruikenlds.

Introduction

In de afgelopen jaren zijn verscheidene methoden ontwikkeld in de biotechnologie autologe cellulaire suspensies tijdens chirurgie verkrijgen om éénfasige behandelingen voor acute en chronische huidletsels. Bovendien is de behandeling van acute maar vooral chronische wonden gevolg van trauma, diabetes, infecties, en andere oorzaken, blijft een uitdaging. Er is steeds meer bewijs dat chronische wonden een ernstige wereldwijde gezondheidsprobleem geworden, waardoor een enorme financiële last voor de gezondheidszorg systemen wereldwijd ^1.

Om de mate van succes bij de behandeling van huidletsels verhogen, gebrek aan uitgebreide manipulatie (inclusief cellulaire versterking) en het handhaven van steriele omstandigheden essentieel, om een ​​celsuspensie die direct kunnen worden aangebracht op het beschadigde gebied van het creëren patiënten, waardoor een langere verwerking in cleanrooms vermijden, zoals Cell Factories. StArting van kleine huidbiopten, slijpen, centrifugeren en andere scheidingsmethoden (bijvoorbeeld enzymatisch of mechanisch), worden vaak gebruikt om een celsuspensie, die kunnen worden gekweekt in een groeimedium verkrijgen. Al deze werkwijzen vereisen in het algemeen een lange tijd van uitvoering, benadrukt de celstructuren, en leidt tot een vermindering van cellevensvatbaarheid. Een ander belangrijk aspect is een autologe cellulaire suspensie gereed voor gebruik door artsen te verkrijgen, bijvoorbeeld om beschadigingen bij. Bovendien is het bekend dat autoloog weefsel enten overleven de procedures overdracht uiteindelijk overleven in de receptorplaats die de beginselen van inductie en geleiding ^{2, 3.} Moet de ideale implantaat weefsel beschikbaar zijn en lage antigeniteit en donorplaats morbiditeit ^4.

Op basis van deze bewijzen, was de eerste doelstelling van dit onderzoek om lichaamseigen bio-complexen geschikt voor creërenklinische toepassing in het weefselherstel. Hiervoor beschrijven we een nieuwe werkwijze voor autologe micro-grafts vanaf cutane weefsels die zijn opgesplitst dit protocol verkregen. Een case-presentatie wordt hierin ook beschreven als een klinische toepassing van autologe micro-transplantaten verkregen door dit protocol in combinatie met collageen sponzen. Deze aanpak is reeds gemeld efficiënte mechanische disaggregatie van menselijk weefsel ⁵ te zijn en het is klinisch gebruikt voor het enten en regeneratie van huidweefsels ^6,7 en regeneratieve therapieën bindweefsel in orale kaakchirurgie ^8-10 .

Daarnaast is het tweede doel van deze studie was de biologische karakterisering van de cutane weefsels na de opsplitsing van dit protocol. Hiertoe verschillende homologe monsters van huidweefsel afgeleid van de bagageruimte van verschillende meerdere organenen / of multi-weefsel donoren werden verwerkt na de nationale regels inzake de oogst, verwerking en distributie van weefsels voor transplantatie (CNT 2013) in Emilia Romagna Regional Skin Bank.

CASE PRESENTATIE:

Een 35-jarige vrouwelijke patiënt met een complex trauma als gevolg van auto-ongeluk werd toegelaten tot de Intensive Care Unit van Ancona Hospital. De patiënt toonde een besmetting van het been door een open wond en een gecompliceerde breuk gestabiliseerd met externe fixatie. Twee radicale debridement werden uitgevoerd en wanneer de wond werd schoon te maken na de negatieve druk therapie (VAC therapie) en het periost verscheen gezond, we passen het protocol na twee maanden van herstel. Na disaggregatie met dit systeem werden de micro-transplantaten verkregen wordt gebruikt voor bio-complexen met een collageenspons die vervolgens om geïmplanteerd hun doeltreffendheid op de laesie reparatie onderzoeken maken.

Protocol

Ethiek statement: sinds de klinische toepassing van het protocol het gebruik van cutane autoloog weefsel van de patiënt vereist, de karakterisering in vitro werd uitgevoerd voor klinisch gebruik op homologe huidweefsel in Emilia Romagna Regionale Skin Bank volgens de richtlijnen van de nationale regels inzake de oogst, verwerking en distribueren van weefsels voor transplantatie (CNT 2013).

1. Bio-complex Building for Clinical Application

Opmerking: Dit protocol is klinisch gebaseerd op het gebruik van Rigeneracons (weefsel verbreker) en Rigenera Machine (weefsel verbreker systeem) (figuur 1A). Het weefsel verbreker is een biologisch medische disruptor van menselijke weefsels kunnen kleine stukjes weefsel gebruik van een matrix door hexagonale bladen en filtering cellen en componenten van de extracellulaire matrix met een cut-off van ongeveer 50 micron verstoren.

1. Verzamel skinsamples van de patiënt door een biopsy punch (Figuur 1B) en splitsen het toevoegen van 1 ml zoutoplossing voor elk stuk op autologe micro-transplantaten ^6,7,9 te verkrijgen (of zie stap 2.1).
2. Plaats 1 ml micro-grafts collageensponzen (figuur 1C) toform bio-complexen gebruikt voor klinische toepassing.
3. Cultuur nog 1 ml van micro-grafts collageensponzen in aanwezigheid van 6 ml DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 ° C in een _5% CO2 bevochtigde atmosfeer.
4. Na 3 dagen kweken, bevestig de bio-complexen met 0,3% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Giet de paraffine met een specifieke dispenser direct op het monster. Verkrijgen plakjes met een microtoom met een dikte van 5 urn en zet direct in een glazen dia.
5. Dompel paraffine plakjes 5 urn in een glas voor histologische analyse, die 15 - 20 ml xyleen (in de handel verkrijgbaar - een mengsel van m-xyleen (40-65%), p-xyleen (20%), o-xyleen (20% ) en ethyl benzeen (6-20%) en sporen tolueen, trimethylbenzeen, fenol, thiofeen, pyridine en waterstofsulfide) gedurende 3 min elk.
6. Dompel de plakjes afnemende graden (100% tot 70%) van ethanol (100% ethanol gedurende 1 uur, 95% ethanol gedurende 1 uur, 80% ethanol gedurende 1 uur, 70% ethanol gedurende 1 uur) en daarna gedeïoniseerd water voor de-paraffinizing en hydrateren de secties.
7. Vlekken op de secties met 1-2 ml van 1 g / L Ematoxylin voor 1-2 min en vervolgens spoelen met water om eventuele Ematoxylin overschot te verwijderen.
8. Vlekken op de afdelingen 4-5 min met Eosine Y alcoholische oplossing met 1% concentratie gemengd met ethanol 70% en verdund in water.
9. Gebruik 1-2 ml Eosine Y voor elke dia sectie en onder stromend water uit de kraan.
10. Dompelen secties in toenemende graden van ethanol (zie stap 1,6) en tenslotte, na een passage in xyleen gedurende 1 uur, met een dekglaasje gebaseerde montage op middellange en waarnemen onder een lichtmicroscoop bij 100x vergroting (figuur 1D).

2. Collection, Uitsplitsing en in vitro analyse van de weefsels

1. Met een dermatoom, neem onafhankelijk huidweefsel, papillaire dermis-de epidermized (DED) of reticulaire dermis (lederhuid) respectievelijk 0,6 mm, 1 mm of 2 mm in dikte van de bagageruimte van 4 verschillende meerdere organen en / of multi- weefsel donoren in een range 40-55 jaar, naar aanleiding van de nationale regels inzake de oogst, verwerking en distributie van weefsels voor transplantatie (CNT 2013).
   1. Voorzichtig spoelen alle monsters in 0,9% NaCl-oplossing ze in een schotel op een orbitale schudder gedurende 5 min.
   2. Met behulp van de 5-mm biopsie punch, steekproeven die uniform zijn in diameter van het huidweefsel, Ded en Dermis en wegen alle weefselmonsters voor de opsplitsing.
   3. Invoegen acht, drie of vier gelijkmatige monsters van huidweefsel, Ded respectievelijk Dermis in het weefsel verstorende voegen 1,5 ml zoutoplossing voor de disaggregatie.
   4. uitvoeren van verschillendetijden van uitsplitsing voor weefselmonsters zoals aangegeven in tabel 1.
   5. Gebruik een correspondent aantal punch biopten afkomstig uit intacte weefselmonsters als controles.
   6. Na mechanische disaggregatie, zuigen de zoutoplossing die micro-grafts en apart plaats elk monster in een enkel putje van een 12-wells plaat. Voer dezelfde protocol voor intact controle punch biopsieën.
   7. 1 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica aan elk monster toegevoegd.
   8. Evalueer de levensvatbaarheid cel onmiddellijk. Aan elk putje met een micro-graft (respectievelijk verkregen door de gelijktijdige onderverdeling van acht, drie of vier gelijkmatige monsters van huidweefsel, Ded of Dermis) voeg 1 ml medium bevattende 0,5 mg / ml MTT (3- [4,5- dimethylthiazol-2-yl] -2,5- difenyltetrazoliumbromide) oplossing en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C in een atmosfeer van _5% CO2 / lucht. Voer dezelfde protocol voor intact controlepunch biopsieën.
   9. Na incubatie, verwijder alle medium dat MTT en toe te voegen aan elk monster 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) gedurende 10 min.
   10. Transfer elk monster en DMSO in een cuvet en afgelezen bij optische dichtheid (OD) bij 570 nm met een spectrofotometer. Bereken cellevensvatbaarheid als de verhouding van de absorptie bij 570 nm en het gewicht in grammen (g) weefsel gebruikt voor disaggregatie. Voer dezelfde protocol voor intact controle punch biopsieën.
2. Na mechanische disaggregatie, zuigen de zoutoplossing die micro-graft afgeleid van huidweefsel, Ded en Dermis monsters van een enkele donor.
   1. Plaats elk monster afzonderlijk in een enkel putje van een 12-well plaat of in een kolf voor cellevensvatbaarheid testen en morfologische analyse resp.
   2. Cultuur micro-grafts toevoegen van 1 ml (12-well plaat) of 5 ml (kolf) RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica bij 37 ° C in een atmosfeer van _5% CO2 / air 24 uur en 7 dagen.
   3. Evalueer de levensvatbaarheid van de cellen na 24 uur of 7 dagen (herhaal stappen 2.1.8-2.1.10).
   4. Uitvoeren morfologische analyse evalueren van de aanwezigheid van de celsuspensie met lichtmicroscopie na 24 h en 7 dagen kweken in kolf.
   5. Analyseer de monsters Dermis positiviteit voor de mesenchymale en hematopoietische cel markers, zoals CD146, CD34 en CD45 antigenen door FACS analyse ^6.
   6. Onder laminaire stroming kap zaad elk micro-graft (verkregen door de gelijktijdige onderverdeling van acht, drie of vier gelijkmatige monsters van huidweefsel, respectievelijk Ded of dermis) en een correspondent kleine fragment van elk weefselmonster niet volledig uitgesplitste (> 50 micron na het uiteenvallen proces) op Columbia agar plaat die 5% schapen bloed bouillon 100 pl.
   7. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende drie dagen en microbiologische analyses uitgevoerd op Columbia agar plaat om de steriliteit te beoordelen ¹¹.

Results

In dit vooronderzoek als eerste doel het vermogen van menselijke autologe micro-transplantaten in combinatie met een biologische drager, zoals collageen, bio-complexen gebruiksklaar produceren onderzoeken. Deze bio-complexen werden geïmplanteerd in een patiënt met een been letsel veroorzaakt door een auto-ongeluk (figuur 2A) en een volledige re-epithelialisatie geassocieerd met weefselherstel na 30 dagen (Figuur 2B) wa...

Discussion

Deze preliminaire studie toonde aan dat micro-transplantaten verkregen door dit protocol kan worden gecombineerd met collageen sponzen, zoals reeds gemeld in andere klinische toepassingen, om de werkzaamheid van micro-grafts implantaten ^{9, 10} optimaliseren. Vooral dit onderzoek meldde de capaciteit van bio -complexen, gevormd door micro-implantaten en collageensponzen, de wondgenezing van een been letsel adjuvans na 30 dagen klinische toepassing. Verder in vitro resultaten tonen de effectiviteit van ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI medium	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antibiotics	Biological Industries PBI	03-038-1
Antibodies for FACS Analysis	eBiosciences	code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		collageenspons gebruikt voor bio-complexen
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene	Carlo Erba