Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Samenvatting

Genoombewerking van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. Hier wordt een robuuste experimentele procedure gepresenteerd om hPSC's genetisch te manipuleren, zoals geïllustreerd door het bewerken van het AAVS1-veilige havenlocus om EGFP tot expressie te brengen en antibioticaresistentie te introduceren.

Samenvatting

Genoom-editing van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) biedt een genetisch gecontroleerd en klinisch relevante platform van waaruit de menselijke ontwikkeling te begrijpen en te onderzoeken de pathofysiologie van de ziekte. Door het gebruik van site-specific nucleasen (SSNs) voor het genoom bewerken, de snelle afleiding van nieuwe HPSC lijnen herbergen specifieke genetische veranderingen in een anders isogene instelling mogelijk wordt. Zinkvinger nucleasen (ZFNs), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom herhalingen (CRISPR) / Cas9 zijn de meest gebruikte SSNs. Al deze nucleasen functioneren door het introduceren van een dubbelstrengs DNA pauze op een bepaalde site, waardoor precieze gen bewerken bevorderen op een genomische locus. SSN-mediteerde genoom bewerken exploiteert twee van endogene DNA-reparatie mechanismen van de cel, niet-homologe eind mee (NHEJ) en homologie gericht reparatie (HDR), ofwel te introduceren insertie / deletie mutaties of alter het genoom via homologe reparatie template op de plaats van de dubbelstrengs breuk. Elektroporatie van hPSCs is een efficiënt middel van het transfecteren SSNs en reparatie sjablonen die transgenen bevatten, zoals TL-reporters en antibioticaresistentie cassettes. Na elektroporatie, is het mogelijk om alleen die hPSCs dat de reparatie construct door de keuze van antibioticumresistentie isoleren. Mechanisch scheiden HPSC kolonies en bevestigt goede integratie op de doelplaats tot genotypering maakt de isolatie van juist gerichte en genetisch homogene cellijnen. De geldigheid van dit protocol wordt hier aangetoond met behulp van alle drie de SSN platforms op te nemen EGFP en een puromycineresistentie construct in de AAVS1 veilige haven locus in menselijke pluripotente stamcellen.

Inleiding

Genoom bewerken technologieën evolueren snel in standaard instrumenten voor moleculaire en celbiologie ^1. Genetische manipulatie van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) is van bijzonder belang hPSCs vormen een zelfvernieuwende bron van genetisch intacte primaire humane cellen. hPSCs kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypes ziektemodel of als een bron voor transplantatie therapieën ^2,3. Hier aangetoond is een protocol dat drie verschillende soorten van de site-specifieke nucleasen (SSNs) in combinatie met endogene DNA repair mechanismen voor gerichte integratie van een reporter construct bij de AAVS1 locus gebruikt. Na transfectie van SSNs in hPSCs, laten we zien hoe isogene celpopulaties te isoleren herbergen de verslaggever.

De mogelijkheid om het genoom te manipuleren, in het bijzonder pluripotente stamcellen genomen, met behulp van SSNs is geen nieuw fenomeen als het nut van zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activatof-achtige effector nucleasen (Talens) voor gen-editing werd enkele jaren geleden ^4-10 aangetoond. Echter, met de komst van S. pyogenes CRISPR / Cas9 technologie ^11-13, gen-editing is breed toegankelijke ¹⁴ geworden. Alle SSNs introduceren van een dubbelstrengs DNA break (DSB) op de opgegeven doellocatie ^1,4,5,11 dat is gerepareerd door endogene cellulaire mechanismen met behulp van niet-homologe eind mee (NHEJ) of homologie gericht reparatie (HDR) ^15. NHEJ is foutgevoelig en kan leesraam mutaties resulteert in verlies van genfunctie te voeren, terwijl de HDR maakt nieuwe elementen worden ingebracht door de co-transfectie van een reparatie sjabloon met de SSN. De fundamentele principes van DNA herstel dat gen bewerking te vergemakkelijken wordt gedacht dat grotendeels hetzelfde voor elke SSN zijn enkele verschillen tussen de platforms worden opgemerkt. De novo ontwerp ZFNs biedt flexibiliteit en nuclease optimalisatie ^16, maar het gebruik van algemeenbeschikbaar montage bibliotheken en screening tools waarmee individuele ZFNs ontwerpen kan tijdrovend zijn. Zodra de gewenste locus voor ZFN-gemedieerde targeting wordt bepaald, kan ZFN paren worden ontworpen met de online tool ZiFit ^17. Na het ontwerp, kan ZFNs modulair worden geassembleerd door verschillende rondes van plasmide klonen ^18. Als alternatief zijn er vele in de handel verkrijgbaar, geprevalideerde ZFNs ^19. VERHAAL nucleasen kan ook worden ontworpen met behulp van online tools en publiekelijk beschikbare componenten ^17,20. Zo kan Talens snel worden samengesteld uit blokken van vijf herhalingen TALE door FLASH samenstel ²¹ of via PCR hiërarchische Golden Gate samenstel ^22. Gemak van SSN ontwerp en de snelheid van de bouw met behulp van CRISPR / Cas9 hebben genoom maakte het bewerken van een breed toegankelijk tool. De korte gids-RNA gemedieerde targeting van CRISPR / Cas9 maakt het ook mogelijk voor het multiplexen van de gids RNA naar verschillende loci te richten met een enkel construct ^14. Het ontwerpvan Cas9 voor gentherapie bewerking vereist slechts de identificatie van een protospacer aangrenzende motief (PAM, een NGG trinucleotide S. pyrogenes Cas9) proximaal aan het doel locus. Door het inbrengen van een oligonucleotide die overeenkomt met de 20 baseparen 5 'van de PAM in de px330 plasmide ^14, kan het construct worden geassembleerd in een kloneringstap. Naast S. pyogenes Cas9, Cas9 van N. meningitidis (NmCas9) dat een 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) herkent is aangetoond om efficiënte gen-editing in hPSCs ^23.

Naast de verschillen in gemak van SSN ontwerp, elk platform heeft specifieke eigenschappen. Bijvoorbeeld ZFNs en Talens gebruik maken van de FokI nuclease domein, dat vier nucleotide 5 'overhang ²⁴ genereert terwijl Cas9 wordt gedacht dat vooral genereren stompe uiteinden DSB. ZFNs Talens en Cas9 verschillen in hun eiwitten stabiliteiten, on-off rate on target DNA en het soort DNA scannen, die cOuld theoretisch resulteren in kleine verschillen in de uitkomst bewerken ^1. Terwijl verdere studies nodig zijn om de gevolgen van deze verschillen begrijpen beschrijven we hier een protocol dat is zeer robuust alle drie platforms en kan worden gebruikt om eenvoudig genereren van genetisch gemodificeerde hPSCs.

Ongeacht SSN keuze, elektroporatie is een deugdelijke procedure om SSNs en homologie reparatie sjablonen transfecteren in hPSCs ^25. Het aantal overlevende kolonies na selectie van antibiotica resistentie afhankelijk locus-specifieke parameters en de bewerking strategie (bijvoorbeeld grootte van transgene insert en selectiemethode). De hier beschreven protocol resulteert gewoonlijk ongeveer 150-400 eencellige afgeleide kolonies.

Gene-bewerking op AAVS1 locus met dit protocol eerder is toegepast om de effectiviteit van SSNs ^4,5 demonstreren. De AAV-CAGGS-EGFP reparatie sjabloon maakt gebruik van een gene trap strategie puromycine resistentie in een locus specifieke wijze. In het kort, de reparatie template bevat splice acceptor plaats stroomopwaarts van de promoter puromycineresistentie cassette. Bij juiste integratie in het eerste intron van het PPP1R12C gen op het AAVS1 locus, wordt de weerstand cassette uiting van promotor de bewerkte gen. De robuustheid van deze specifieke test AAVS1 kunnen wij de efficiëntie van elke SSN platform vergelijken.

Gene bewerken behulp SSNs krachtig gezien de mogelijkheid te verstoren en / of elk gen veranderen theoretisch. Toepassing van deze strategie hPSCs levert veelzijdigheid hPSCs vervolgens kan worden onderscheiden in een groot aantal humane cellen zoals neuronen ²⁶ hepatocyten ²⁷ en ²⁸ cardiomyocyten. Bovendien kan het gebruik van patiënt afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen maakt de reparatie of invoering van bekende ziekteverwekkende mutaties in een patiënt-specifieke genetische achtergrond ²⁹ , Een platform van waaruit ziekte mechanismen en test geneeswijze met de eigen cellen van de patiënt ³⁰ te onderzoeken. Samengevat, gen-editing in hPSCs is een efficiënte en veelzijdige aanpak van het onderzoek naar de fundamentele biologie van de menselijke ontwikkeling en de ziekte ^31.

Protocol

De in dit manuscript beschreven procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de UC Berkeley Stem Cell Research Oversight Committee goedgekeurd.

1. Bereid stamcellen voor Editing

1. Groei en cultuur humane pluripotente stamcellen (hPSCs) op een 6-wells plaat met 2,4 x 10 ⁶ cellen / plaat van mitomycine C geïnactiveerde muis embryonale fibroblasten (MEF) feeders gekweekt op gelatine ^32. Handhaven hPSCs in 3 ml van menselijke embryonale stamcellen media per putje (hESC media) en te groeien in een 37 ° C incubator met 3% O _2/5% CO _2.
   Opmerking: voor het succes van dit protocol is het niet nodig om hPSCs in een zuurstofarme incubator handhaven; het is echter belangrijk op te merken dat hPSCs prolifereren sneller een hoge O ₂ milieu, zodat tijden en celaantallen bij te stellen. Ook moet worden opgemerkt dat hPSCs gehandhaafd lage zuurstof lagere spontane differentiatie ^33.
   1. To maken 500 ml hESC media combineren 380 ml DMEM / F12, 75 ml foetaal runderserum (FBS), 25 ml KnockOut Serum Vervangende (KSR). Voeg Glutamine (1 mM eindconcentratie), 5 ml 100x niet-essentiële aminozuren, 100 eenheden / ml penicilline-streptomycine (P / S), basische fibroblastgroeifactor (bFGF) (4 ng / ml eindconcentratie) en 2- mercaptoethanol (5,5 uM uiteindelijke concentratie).
2. Wijzig media door het verwijderen van gehele volume van media (3 ml) met een glazen pipet en vacuüm. Vervangen door 3 ml warm hESC media met behulp van een serologische pipet. Herhaal de media veranderen elke dag tot hPSCs zijn ongeveer 50% confluent (dag -1).
3. Een dag voor targeting (dag -1), veranderen hESC media, het verwijderen van de oude media en het toevoegen van warme hESC media aangevuld met 10 uM Y-27632.
4. Ook op dag -1, voor te bereiden 1-2 6-well of 10 cm platen van resistente MEF feeder cellen van DR4 muizen (2,4 x 10 ⁶ cellen / plaat) ^34.
   Opmerking: In het algemeen, 6 well platen zijn advertentievantageous meer dan 10 cm platen, omdat ze geschikt voor meer media. 6 well platen ook voor zorgen dat verschillende klonen uit verschillende bronnen onafhankelijk. Toch zal een 10 cm plaat gemakkelijker picking toestaan, afhankelijk van de microscoop voor deze werkwijze.

2. bewerken pluripotente stamcellen

1. Bereid transfectie oplossingen pipetteren 5 ug elk van ZFN 1 en 2, TALEN 1 en 2, of 15 ug van het CRISPR / Cas9 px330 coderend plasmide (Figuur 1) in een 1,5 ml buis. Pipetteer 30 ug van het herstel plasmide in deze buis ook. Tenslotte pipet 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in de buis om het volume te brengen tot 300 pi.
   Opmerking: Bereid plasmiden als Midiprep (elke kit geschikt) een minimumconcentratie van 300 ng / ul teneinde het totale volume van de transfectie-oplossing onder 300 gl houden. Het is niet nodig fenol / chloroform extractie uit te voeren, om het plasmide te lineariseren, of een endoto gebruikenXin gratis plasmide prep kit.
2. Verwijder de media uit hPSCs met behulp van een glazen pipet en vacuüm. Pipet 2 ml warm 1x PBS in elk putje om de cellen te wassen.
3. Verwijder de PBS onmiddellijk met een glazen pipet en vacuüm. Voeg 0,5 ml 0,25% trypsine-EDTA-oplossing direct op de cellen in elk putje. Plaats in de incubator (37 ° C / 5% CO _2/3% O ₂₎ gedurende ongeveer 10 min. of totdat voedingslaag begint op te heffen van de plaat.
4. Voeg 2 ml warm esWash medium (470 ml DMEM / F12, 25 ml FBS, 100 eenheden / ml P / S) aan elk putje om de reactie te stoppen trypsine.
5. Zorg ervoor dat feeder cellen komen af ​​als een blad. Pipetteer de inhoud van elk putje in een 50 ml conische buis, combineert alle putjes. Fijnstampen cellen met behulp van een 10 ml serologische pipet. Het is niet nodig te breken van de feeder layer; hPSCs gaat uit van de feeder-laag door zachte trituratie komen. Er moet ongeveer 15 ml van de celsuspensie.
6. Voeg 25 ml van esWash media om de buis naar de volu brengenme tot 40 ml totaal. Sta grote feeder brokken te vestigen op de bodem van de buis voor 1-2 min. Verwijder de bovenstaande vloeistof (~ 38 ml) van de buis met behulp van een serologische pipet en storting in een nieuwe 50 ml conische buis.
7. Spin down gedurende 5 minuten bij 190 x g. Verwijder het supernatans van de buis met behulp van een glazen pipet en vacuüm. Zorg ervoor dat de cel pellet niet storen. Resuspendeer de cellen in 500 pl 1x PBS. Combineer met plasmide transfectieoplossing eerder voorbereid. Tel de cellen bij deze stap. Gebruik 5-10.000.000 cellen per elektroporatie.
8. Pipetteer de gehele 800 ul suspensie in een 4 mm elektroporatiecuvet, plaats op ijs gedurende 3-5 min. Electroporate cellen met behulp van de exponentiële programma op de elektroporatie systeem met de volgende parameters: 250 V, 500 uF, de weerstand ∞ en 4 mm cuvette formaat. Na elektroporatie, plaats cuvet weer op ijs gedurende 3 min.
   Opmerking: Let op de tijd constante van de elektroporatie van de elektroporatie systeem. De tijdconstanteafhankelijk van het aantal cellen en DNA zuiverheid. Succesvolle transfecties hebben meestal een tijd constant tussen 10-14 msec bij gebruik van de genoemde voorwaarden en een gen Pulser II. Lagere elektroporatie efficiëntie kan optreden wanneer de tijd constanten varieert van deze waarden.
9. Resuspendeer geëlektroporeerde cellen in 18 ml warm hESC media aangevuld met 10 uM Y-27632. Plaat 3 ml van deze enkele celsuspensie in elk putje van een plaat met 6 putjes met DR4 voedingscellen. Terug naar incubator (37 ° C / 5% CO _2/3% O _2).

3. Selectie van positieve kolonies

1. Dag 2, verwijder alle media met behulp van een glazen pipet en vacuüm. Vervangen door 3 ml warm hESC media aangevuld met 10 uM Y-27632. Dag 3, verwijder alle media met behulp van een glazen pipet en vacuüm. Vervangen door 3 ml warm hESC media zonder inbegrip van Y-27632. Dag 4, verwijder alle media met behulp van een glazen pipet en vacuüm. Vervangen door 3 ml warm hESC media aangevuld met antibiotica voor selectiop. Terug naar incubator (37 ° C / 5% CO _2/3% O _2).
   Opmerking: Het type antibioticum is afhankelijk van de resistentie cassette in de reparatie template. Bij het werken met WIBR # 3 hPSCs (NIH registry 0.079), 0,5 ug / ml puromycine, 70 ug / ml G418 (geneticine), en 35 ug / ml hygromycine zijn met succes gebruikt. Concentraties keuze moet empirisch worden bepaald door vaststelling van de minimale concentratie antibioticum nodig met wildtype cellen binnen ongeveer een week doden.
2. Dagen 5-12, veranderen de media dagelijks, het vervangen van oude media telkens met warme hESC media aangevuld met antibiotica.
   Opmerking: Verwacht een grote hoeveelheid celdood. Individuele kolonies zullen duidelijk rond dag 8-10 worden. Regelmatige hESC media zonder antibiotica kan gebruikt worden na 12-14 dagen van voortdurende selectie. Als celdichtheid hoog of celdood langzaam moet verzuring van het medium worden vermeden en kan het nodig zijn de media volu vergrotenme (tot 4-5 ml) gedurende de eerste paar dagen van selectie.

4. Picking Geselecteerde Koloniën (Dag 12-14)

1. Observeren kolonies op dag 12-14. Let op de kolonies die klaar om te halen op een dissectie microscoop en ervoor zorgen dat ze niet cellen die beginnen om onderscheid te bevatten zijn. De geschatte grootte moet 800-1200 uM. Als kolonies bereiken deze omvang voor de dag 12, wordt aanbevolen dat zij dan moeten worden opgehaald.
   Opmerking: Voor elk richten experiment, pak zoveel kolonies die nodig is voor de gewenste genotype wordt geïsoleerd. Als voorbeeld heeft AAVS1 bewerken met AAV-CAGGS-EGFP reparatie template getoond consequent robuuste integratie en vereist slechts 12-24 kolonies worden opgepikt ongeveer 5-10 heterozygoot gerichte klonen te verkrijgen. Andere targeting experimenten mogelijk meer kolonies moeten worden opgehaald (tabel 1). De frequentie van gebeurtenissen correct moet afhankelijk van factoren zoals de efficiëntie van de SSN een DSB, de grootte van de insert, en de selectie strategie te introduceren. Bij de gene trap benadering voor AAVS1 locus hier gepresenteerd wordt de selectiemerker alleen tot uiting bij correct geïntegreerd op de doelplaats, het verminderen van het aantal koloniën vereist een doelgerichte kloon te verkrijgen.
2. Een dag voor het plukken, bereiden 12-well platen van MEF (2,4 x 10 ⁶ cellen / plaat, zal men ook worden gebruikt voor elke kolonie geplukt).
3. Op de dag van plukken, verwijder alle media uit de 12 en MEF platen met behulp van een glazen pipet en vacuüm en vervangen door 1 ml hESC media. Ook op de dag van plukken, veranderen hESC media op de 6 well platen die zullen worden opgehaald.
4. Trek glazen pipetten voor de mechanische dissociatie van individuele kolonies van de feeder-laag. Laat de pipetten over een in-kap Bunsenbrander en verzacht bij de uitbreiding punt tot glas is kneedbaar. Snel te verwijderen uit vlam en trek de pipet elkaar creëren van een hoekpunt. Breek depunt ongeveer 2 cm vanaf de gebogen as, waardoor een smal kanaal. Pools het einde van het kanaal door blootstelling aan vlammen van 1-2 sec.
   Opmerking: Eventueel kies kolonies een p20 pipetpunt echter kan dit de clonaliteit van de kweek te verlagen, aangezien de afgeronde punten grotere hoeveelheden cellen losmaken van elke kolonie in de media, potentieel vervuilende daaropvolgende plukken.
5. Assembleren picking-apparaat door middel van een filter P1000 pipetpunt en het aanbrengen van een zuigkracht gloeilamp aan het smalle uiteinde. Steek de getrokken glazen pipet in het brede einde.
6. Plaats een 6-wells plaat hPSCs te worden opgehaald op het podium van een dissectie microscoop gemonteerd in een weefselkweek kap. Comprimeren de lamp van de picking apparaat en voorzichtig accijnzen en snijd een individuele kolonie in 10-20 gelijke stukjes, zorg ervoor dat u stukken vrij te geven in de media. Neem HPSC uitgesneden stukken van de kolonie in de pipet door het vrijgeven van de lamp. Probeer zo weinig media nemen mogelijk tijdens de overdracht.
7. Transfer individuele kolonie een enkel putje van een 12-wells plaat MEF, opnieuw comprimeren van de lamp direct in de put, het vrijgeven van de nu gebroken kolonie. Label elk putje om unieke identificatie van de single-cell afgeleide klonen mogelijk te maken. Herhaal voor zoveel als nodig kolonies, het veranderen van de glazen pipet elke keer.
   Opmerking: Het plukken kolonies kan enige tijd om te leren nemen. Het wordt aanbevolen dat de experimentator praktijk op sommige controle cellen voordat u gerichte kolonies te isoleren.
8. Return 12 well platen in de incubator (37 ° C / 3% O _2/5% CO ₂₎ voorzichtig schommelen van de plaat eerste accumulatie van cellen voorkomen in het midden van elk putje.
9. De volgende dag en iedere volgende dag, verwijder de volledige omvang van de media met behulp van een glazen pipet en vacuüm en vervangen door 1,5 ml warm hESC media totdat cellen zijn ongeveer 50% confluent (dit duurt meestal 10-12 dagen).
10. Na 10-12 dagen, kies 1-2 kolonies van elk putje en over te dragen aan de nieuwe 12-well MEF platen opnieuwvervening stappen 4,1-4,8 om een ​​replica plaat te genereren.
11. Extraheer DNA (zie hierna) uit de overblijvende kolonies in elk putje van de oorspronkelijke MEF platen.
    1. Verwijder de media uit alle putjes met behulp van een glazen pipet en vacuüm. Pipetteer 1 ml 1x PBS op elk putje om de cellen te wassen. Verwijder PBS met glazen pipet en vacuüm. Pipetteer 250 ul van cellysis buffer (eindconcentraties in H ₂ O: 10 mM Tris HCI, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl, 0,08 mg / ml Proteïnase-K) aan elk putje. Plaats in incubator (37 ° C / 3% O _2/5% CO ₂₎ O / N.
    2. De volgende dag, pipet inhoud van elk putje in afzonderlijke 1,5 ml buizen. Pipetteer 250 ul isopropanol aan elke buis om het DNA neer te slaan. Schud de buis krachtig. Een witte neerslag moet zichtbaar zijn.
    3. Spin elke buis naar beneden voor 3 min bij 13.000 rpm in een tafelblad centrifuge. Na de draai naar beneden, gooi supernatant door decanteren in vloeibaar afval. Een kleine DNA pellet dient vast onderaan blijvende buis. Pipetteer 250 ul 70% ethanol in elke buis om de DNA pellet te wassen. Schud krachtig. Spin elke buis naar beneden voor 3 min bij 13.000 rpm in een tafelblad centrifuge.
    4. Na het stoppen met draaien, gooi supernatant door decanteren in vloeibaar afval. Een kleine DNA pellet dient vast aan de bodem van de buis blijven. Pipetteer de rest van de supernatant zodat er geen vloeistof in de buis. Verlaat tube open voor drogen op stationaire 5-10 min. Na drogen resuspendeer DNA in 250 pl TE-buffer. Plaats bij 37 ° C gedurende 6 uur om DNA te lossen.
12. Genotype elk monster met behulp van een pre-geoptimaliseerde PCR of Southern blot strategie.
    Opmerking:.. Voor AAVS1 richten op het gebruik van de AAV-CAGGS-EGFP reparatie template, kan de zuidelijke vlek strategie worden gevonden in Hockemeyer et al, kan 2009 ⁴ Een uitgebreide zuidelijke blotting protocol worden gevonden in het zuiden van 2006 ³⁵ Voor multiplex PCR genotypering van. hetzelfde experiment, kunnen primers en omstandighedengevonden in tabel 2 ^36.
13. Gooi putten die niet goed gericht zijn en blijven veranderen hESC media op goed gerichte cellen elke dag. Bevries de cellen af ​​wanneer ze ongeveer 50% confluent, zie hieronder voor het invriezen protocol.
    1. Een dag voor het invriezen, veranderen hESC media, het verwijderen van de oude media en het toevoegen van warme hESC media aangevuld met 10 uM Y-27632.
    2. Op de dag van bevriezing te bereiden 0,5 ml van oplossing A en oplossing B per putje van een 12-well plaat die wordt vastgelegd in twee 15 ml conische buizen wordt bevroren. Plaats oplossingen op ijs. Oplossing A: 50% hESC media en 50% FBS; Oplossing B: 80% FBS en 20% dimethylsulfoxide (DMSO).
    3. Distantiëren HPSC kolonies in enkele cellen voor het invriezen. Volg de stappen 2,2-2,8 om dit te doen, dus schalen volumes. Volledig hersuspenderen celpellet in 0,5 ml oplossing A
    4. Voeg 0,5 ml oplossing B aan celsuspensie, pipet op en neer naar cel suspensie homogeen te maken. Take het totale volume van de celsuspensie (~ 1 ml) en storting in een 2 ml cryotube. Schroefdop stevig vast.
    5. Cryotube plaats in een -80 ° C vriezer O / N. De dag na het bevriezen, verwijder bevroren cellen van -80 ° C vriezer en onmiddellijk te plaatsen in vloeibare stikstof tank voor langdurige opslag.

Resultaten

Hier laten we zien een protocol dat compatibel is met drie verschillende SSN platformen om genetisch gemanipuleerde HPSC lijnen creëren. We gerichte WIBR # 3 van menselijke embryonale stamcellen in het AAVS1 locus met eerder gepubliceerde ZFNs ^{4, 5} en Talens CRISPR / Cas9s ³⁷ met behulp van een reparatie sjabloon dat een EGFP reporter en een puromycineresistentie cassette ⁴ introduceert.

We gekweekt onze hPSCs op MEFs een celcultuur workflow waardoor het onderhoud en de uitbreiding van ongedifferentieerde hPSCs (figuur 2), die ook kosteneffectief en schaalbaar. Als cellen langer dan noodzakelijk gekweekt bestaat het risico van verhoogde differentiatie, waardoor het aantal pluripotente cellen die worden getransfecteerd en dus het aantal correct gerichte HPSC kolonies verkregen.

We electroporated 5,0 x 10 ⁶ cellen per SSN platform en vergulde de cellen van elk gericht op een enkele plaat met 6 putjes van DR4 MEF. Na selectie elk platform geleid EGFP-positieve kolonies (figuur 3) en een combinatie van niet-gerichte, homozygoot en heterozygoot gerichte gerichte klonen (Figuur 4A, B; Tabel 3). Onder de hier gepresenteerde omstandigheden, vinden we dat de AAVS1 Talens resulteerde in de EGFP-positieve klonen. De reparatie template gebruikt voor dit experiment bestaat uit een splice acceptor plaats stroomopwaarts van het EGFP reporter en puromycine resistentie cassette. Met behulp van deze "gen-trap" strategie (figuur 1), dient het construct te voegen in het eerste intron van het AAVS1 locus via de endogene promoter om expressie van het puromycine-resistentie cassette rijden. Het ontbreken van een promotor die de expressie van het puromycine resistentiegen onder de reparatie template dient expressie voorkomen in de Bij random integratie.

Daarom verwachten we dat alle puromycine-resistente klonen zou worden gericht op de AAVS1 website. Opgemerkt wordt dat een subset van klonen dragen afwijkende integraties in de AAVS1 locus die detecteerbaar is door Southern blot met een intern probe, maar niet door de meeste PCR strategie (figuur 1; figuur 4C) ^4. Deze integratie gebeurtenissen zijn waarschijnlijk het gevolg van heterologe richten gebeurtenissen die leiden tot meerdere integraties van de donorplasmide ^4. We kozen 24 kolonies van elke SSN experiment en vond dat alle platformen had zeer hoge efficiëntie en doelgerichtheid toonde slechts minimale verschillen. Zoals ondervraagd door PCR, CRISPR / Cas9 leverde de meest juiste wijze doelgericht klonen terwijl TALEN platform had de homozygoot beoogde klonen (Tabel 3).

/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figuur 1. Schematische voorstelling van gen bewerkt AAVS1 locus met de AAV-CAGGS-EGFP reparatie template. Modified van Hockemeyer et al., 2009. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Kolonies van WIBR # 3 cellen. Vertegenwoordiger heldere gebied beelden van kolonies van WIBR # 3 van menselijke embryonale stamcellen voor targeting. Let op het gebrek aan differentiatie en de duidelijke scheiding van de feeder laag in een ideale kolonie (links) in tegenstelling tot een niet-ideale één (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. EGFP-positieve WIBR # 3 cellen. Vertegenwoordiger beelden van WIBR # 3 cellen gerichte met een-EGFP uitdrukken reparatie template op de AAVS1 locus. Beelden van representatieve kolonies bewerkt met ZFNs, Talens en CRISPR / Cas9 worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Genotypering strategieën om de juiste targeting bevestigen. (A) Representatieve PCR genotypering resultaten tonen ongerichte, heterozygote en homozygote gerichte klonen over de drie SSN platforms. WT CTL = wild-type controle. (B) Reprewoordiger Southern blot resultaten die een heterozygoot gerichte kloon en een homozygote gerichte kloon gedetecteerd met externe probe een 3 '. Fragment maten: WT-6,5 kb, Bewerkt-6,9 kb. (C) Representatieve Southern blot resultaten tonen een goed aangepast kloon en een heterozygoot kloon met een niet-willekeurige dubbele-integratie. Fragment maten:. Goed bewerkt-6,9 kb, afwijkende aanvullende integratie-5 kb Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Studie	Gene Gerichte	Platform	Reparatie sjabloontype	# Klonen opgepikt	Targeting efficiëntie
Sexton et al., 2014	TPP1	ZFN	GFP-Puro	ongemelde	ongemelde
Sexton et al., 2014	TERT	ZFN	Hygromycine	ongemelde	ongemelde
Hockemeyer et al., 2009	POU5F1	ZFN	GFP-Puro	31	39,0%
Hockemeyer et al., 2009	PITX3	ZFN	GFP-Puro	74	14,9%
Hockemeyer et al., 2011	POU5F1	TALEN	GFP-Puro	68	91,0%
Hockemeyer et al., 2011	PITX3	TALEN	GFP-Puro	96	13,0%
Merkle et al., 2015	VASA	Cas9	Reporter-Geneticine	139	94,0%
Merkle et al. </ em>, 2015	CRH	Cas9	Reporter-Geneticine	30	93,0%
Merkle et al., 2015	HCRT	Cas9	Reporter-Geneticine	154	92,0%
Merkle et al., 2015	HMX2	Cas9	Reporter-Geneticine	11	45,0%
Forster et al., 2014	LRG5-Nterm	ZFN	GFP-Puro	ongemelde	30,0%
Forster et al., 2014	LRG5-Cterm	ZFN	GFP-Puro	ongemelde	14,0%
Soldner et al., 2011	SNCA	ZFN	Puro	96	1,0%

Tabel 1. Beschrijving van andere genen gerichte gebruik van deze methode, met Correkomstige targeting efficiëntie uit eerder gepubliceerde studies. ^4,5,38-41

Meetkundige plaats	Sequentie	Aantekeningen
AAVS1-F primer	CTCTAACGCTGCCGTCTCTC	PCR-omstandigheden: Tm = 57 ° C, 35 cycli
AAVS1-WT-R primer	GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG	WT band: 1273 bp
AAVS1-Gerichte-R primer	CGTCACCGCATGTTAGAAGA	Gerichte band: 992 bp
T2-Cas9-gids	GGGCCACTAGGGACAGGAT	Uit Mali et al., 2013
AAVS1-ZFN-Right	TAGGGACAGGAT	Van Hockemeyer et al., 2009
AAVS1-ZFN-Links	TGGGGTGTCACC	Van Hockemeyer et al., 2009
AAVS1-TALEN-Right	TCCTAACCACTGTCTTT	Van Hockemeyer et al., 2011
AAVS1-TALEN-links	CCCCTCCACCCCACAGT	Van Hockemeyer et al., 2011

Tabel 2. Lijst van primers en SSN targeting sequenties.

Targeting Construct	Aantal EGFP + Colonies	Gerichte geplukt klonen (PCR gecontroleerd)	Vorige Gemeld Correct Targeting Efficiency (door Southern blot)
ZFN	150	86,9% (73,9% Het / 13,0% homo)	56% (50% Het / 6% homo)
TALEN	412	91,3% (47,8% Het / 39,1% homo)	47% (37,5% Het / 9,3% homo)
CRISPR-Cas9	235	95,7% (69,5% Het / 26,3% homo)	ongemelde

Tabel 3. Vergelijkende cijfers van EGFP-positieve en gerichte TALEN, ZFN en CRISPR / Cas9 menselijke stamcellen kolonies. PCR geverifieerd integraties aan de AAVS1 locus voor dit experiment zijn in vergelijking met Southern blot geverifieerd juiste enkele integraties in eerdere experimenten ^4,5.

Discussie

De hier gepresenteerde methode voor het isoleren van homogene populaties van gen aangepast humane pluripotente stamcellen is een krachtige aanpak voor het genereren HPSC isogene lijnen die alleen verschillen in de gerichte locus. Deze cellen vormen een ideaal systeem voor het sonderen van de mechanismen van menselijke cellulaire differentiatie en ontwikkeling en voor het begrip van de pathofysiologie van monogene aandoeningen in een gecontroleerde genetische omgeving. Zoals hier getoond, is het mogelijk om drie onafhankelijke SSN ontwerpstrategieën (ZFNs Talens en CRISPR / Cas9) gebruikt gerichte integratie op AAVS1 locus. Elk van deze methoden heeft zijn eigen voordelen en nadelen. Een potentieel voordeel van ZFNs en, tot op zekere hoogte Talens hun ontwerpflexibiliteit, die iteratieve techniek mogelijk maakt om de DNA bindende domeinen van individuele nucleasen ⁴² verbeteren. Deze nuclease optimalisatie kan de specificiteit van ZFNs en Talens dan wat haalbaar is met de CRI is te verhogenSPR / Cas9 systeem. Dergelijke selectiviteit kan belangrijk zijn voor klinische toepassingen die een hoge mate van doelwit specificiteit. Het belangrijkste voordeel van de CRISPR / Cas9 systeem is het gebruiksgemak. Hoewel TALEN en ZFN bouwpakketten beschikbaar zijn voor het publiek (dat wil zeggen, door middel van Addgene ²¹⁾ gemaakt, CRISPR / Cas9 gebaseerde SSNs zijn aanzienlijk makkelijker te bouwen, als de enige noodzakelijke aanpassing is een 20 basenparen oligonucleotide (bij gebruik van de px330 plasmide ontwerp ^14). Deze eenvoud blijkt voordelig voor onderzoekslaboratoria op zoek naar genoom bewerken in hun studies omvatten te zijn.

Er zijn alternatieve transfectie technieken, waaronder nucleofectie ^43, to-gen aangepast HPSC lijnen te creëren; Maar elektroporatie is altijd constante en kosteneffectief ^4,5,25 zijn. Nucleofectie kan worden gebruikt om direct te transfecteren Cas9-guide ribonucleoproteïne RNA-complexen in de kern, waardoor de efficiëntie van een SSNd fidelity ^44. Groeiende hPSCs op MEF is een robuuste en goedkope methode om hPSCs in een pluripotente toestand te houden zonder al te veel differentiatie. Bovendien maakt de gemakkelijke isolatie van genetisch identieke kolonies. Als alternatief is het mogelijk om de cultuur hPSCs zonder MEFs, maar deze kweekomstandigheden kunnen duurder dan feeder gebaseerd culturen. Bovendien, het gehele proces is schaalbaar, waardoor de isolatie van zeldzame gebeurtenissen bewerken of het genereren van vele verschillende cellijnen parallel bewerken experimenten.

De hier beschreven protocol is robuust; maar er zijn een aantal belangrijke stappen die de efficiëntie waarmee juist bewerkte klonen worden verkregen beïnvloeden. De meest kritische component voor deze methode is met een hoge kwaliteit MEF en resistente DR4 MEF. Het voortbestaan ​​van enkele hPSCs is vaag, en lage kwaliteit MEF zal de isolatie van ongedifferentieerde HPSC lijnen belemmeren. Ten tweede, het gebruik van Y-27632 ooksleutel tot enkele cel overleving mogelijk te maken zonder het opwekken van een selectieve druk op cellen met een abnormaal karyotype ^45. Ten derde, het plukken goed gespreid koloniën zorgt genetische homogeniteit van de afgeleide cellijnen. Tenslotte is het belangrijk glazen pipetten bereiden zodat de opening klein genoeg is om de kolonie te breken in vele kleinere stukken, zodat meerdere kolonies groeien in de nieuwe put. Dit maakt het plukken van goed gespreid subklonen voor een replica plaat te hebben in de cultuur, het verlaten van de oorspronkelijke plaat van geïsoleerde kolonies voor genotypering. Een uitdagende rol in dit protocol is de handleiding te trekken van het glas pipetten; dit moet van tevoren worden beoefend. Opgemerkt zij dat er verschillende technieken van kloon picking die geen glazen pipet vereisen. Onderzoekers worden aangemoedigd om degene die het beste werkt voor hen te vinden.

Er zijn beperkingen aan dit protocol kunnen worden overwonnen door eenvoudige aanpassingen. Een experiment bedoeld om olleen verstoren de locus van belang zonder reparatie of degene wiens reparatie template niet een selectie cassette bevatten, moet een andere methode voor het verrijken van cellen die werden bewerkt gebruiken. Merk op dat het aantal kolonies die moeten worden opgehaald om een ​​positieve kloon te sterk toe in afwezigheid van selectie. Een strategie om de efficiëntie te verbeteren is co-transfecteren van een niet-integrerende plasmide dat een fluorescerend eiwit tot expressie brengt. Nadat men de cellen herstellen gedurende twee dagen, gerichte cellen worden gesorteerd op de positieve fluorescentie met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering en opnieuw geplaat ^29. Deze werkwijze verrijkt op cellen die zijn getransfecteerd met de plasmiden door elektroporatie en zodoende de kans op een gelijktijdige bewerking gebeurtenis in de cel.

De hier beschreven technieken kunnen worden uitgebreid naar meerdere guide RNAs om gelijktijdig richten verschillende loci ^14,46,47. Veel protocollen zijn opgericht om hPSCs differentiërenin verschillende celtypen, waardoor verschillende genetische manipulaties in celtypen van belang ^30. Kortom, hebben we de mogelijkheid van efficiënte genoom bewerking in hPSCs ongeacht SSN keuze gebleken. We stellen voor dat deze techniek kan worden aangepast om isogene HPSC lijnen die zijn gen-bewerkt op elk genoomplaats maken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM/F12	Life Technologies	11320082
Fetal Bovine Serum (HI)	Life Technologies	10082-147
Knockout Serum	Life Technologies	10828-028
Fibroblast Growth Factor - basic	Life Technologies	PHG0261
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122
Glutamine	Life Technologies	25030-081
MEM NEAA	Life Technologies	11140-050
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Y-27632	Calbiochem	688000
6-well plates	Corning	3506
12-well plates	Corning	3512
4 mm Electroporation cuvettes	Bio-rad	165-2081
X-cel gene pulser II	Bio-rad	165-2661
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4	Life Technologies	70011-044
Puromycin	Life Technologies	A11138-02
Pasteur pipettes, plugged	VWR	14672-412
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	S5941
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Proteinase-K	Life Technologies	AM2544
Ethanol	VWR	TX89125-172SFU
Isopropyl Alcohol	VWR	MK303216
TE Buffer	Life Technologies	12090-015
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
1.8 ml Cryotubes	ThermoScientific	377267