Hier presenteren we een protocol specifieke siRNA-gemedieerde mRNA afbraak gevolgd door immunofluorescentie analyse meiotische spileenheid en organisatie evalueren muizen oöcyten. Dit protocol is geschikt voor in vitro depletie van transcripties en functionele beoordeling van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren in oöcyten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fouten in chromosoomsegregatie tijdens meiotische deling in gameten kunnen leiden tot aneuploïdie die vervolgens bij bevruchting aan het embryo wordt overgedragen. De resulterende aneuploïdie in zich ontwikkelende embryo's wordt herkend als een belangrijke oorzaak van zwangerschapsverlies en aangeboren geboorteafwijkingen zoals het syndroom van Down. Nauwkeurige chromosoomsegregatie is kritisch afhankelijk van de vorming van het microtubulusspilapparaat, toch blijft dit proces slecht begrepen in zoogdier-eicellen. Intrigerend is dat meiotische spilvorming verschilt van mitose en wordt gereguleerd, althans gedeeltelijk, door unieke microtubulus-organiserende centra (MTOC's). Beoordeling van MTOC-geassocieerde eiwitten kan waardevolle inzichten verschaffen in de regulatorische mechanismen die meiotische spilvorming en organisatie beheersen. Hier beschrijven we methoden om muis-eicellen te isoleren en MTOC-geassocieerde eiwitten te depleteren met behulp van een siRNA-gemedieerde aanpak om functie te testen. Daarnaast beschrijven we omstandigheden voor eicellenfixatie en immunofluorescentie-analyse om meiotische spilvorming en organisatie te evalueren.
Inleiding
Meiose is een unieke divisie proces dat plaatsvindt in gameten (eicellen en zaadcellen) en omvat twee opeenvolgende divisies zonder tussenliggende DNA-synthese van homologe chromosomen en zusterchromatiden scheiden tijdens de meiose I en meiose II, respectievelijk 1. Fouten in chromosoom segregatie tijdens de meiose verdeeldheid in eicellen kan leiden tot aneuploïdie, die wordt overgenomen door het embryo tijdens de bevruchting. Met name de incidentie van aneuploïdie in ontwikkelende embryo's stijgt met voortschrijdende leeftijd van de moeder en is een hoofdoorzaak van aangeboren afwijkingen en miskramen 1,2, dus het benadrukken een grote behoefte om de moleculaire basis van aneuploïdie in meiotische deling begrijpen .
Tijdens de celdeling, chromosoom segregatie is sterk afhankelijk van de montage van de microtubule spoelfiguur en de vestiging van stabiele chromosoom-microtubuli interacties voor de juiste bevestiging aan tegenovergestelde spindelpalen. Belangrijker nog, meiotische spindel formatie in zoogdieren eicellen verschilt van mitose in somatische cellen, en wordt gereguleerd door unieke microtubule organiserende centra (MTOCs) dat centriolen 3,4 missen. Essentiële eiwitten die nodig zijn voor microtubuli nucleatie en organisatie lokaliseren aan eicel MTOCs, waaronder γ-tubuline dat microtubule assemblage katalyseert. Bovendien pericentrin functioneert als essentiële steigers eiwit, dat bindt en ankers γ-tubuline alsook andere factoren MTOCs 5. Met name onze studies aangetoond dat depletie van belangrijke MTOC-geassocieerde eiwitten verstoort meiotische spindel organisatie en leidt tot chromosoomsegregatie fouten eicellen, die niet volledig opgelost door de spileenheid checkpoint (SAC) 6,7. Daarom defecten in spindel stabiliteit, die niet leiden tot meiotische arrestatie, vormen een groot risico bij te dragen aan aneuploïdie. Ondanks hun essentiële rol in de assemblage van de spoel en organisatie, eicel MTOC protein samenstelling en functie blijft slecht begrepen.
Het testen van de functie van de specifieke doelgroep eiwitten in zoogdieren eicellen is een uitdaging, omdat de cellen transcriptie rusttoestand kort voor de hervatting van de meiose 8,9. Vandaar pre-ovulatoire eicellen afhankelijk maternale mRNA winkels meiose hervatten en te ondersteunen meiotische deling en de eerste splitsing divisies na bevruchting 10,11. De werkzaamheid van RNA-interferentie (RNAi) gemedieerde afbraak van mRNA transcripten in zoogdieren eicellen is goed ingeburgerd en moedersterfte RNA's geworven voor de vertaling tijdens de meiose rijping zijn bijzonder vatbaar voor siRNA gericht 12-14. Daarom, micro-injectie van korte interfererende RNA's (siRNA's) in de eicellen levert een waardevolle aanpak doel mRNA afbrekende voor functionele testen.
We beschrijven hier werkwijzen voor de isolatie van muizen eicellen en siRNA-gemedieerde depletie specifieke transcripts de functie van wezenlijke MTOC-geassocieerde eiwit te testen, pericentrin. Verder beschrijven we immunofluorescentieanalyse voorwaarden meiotische spindel formatie in oöcyten evalueren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Georgia.
1. Voorbereidingen
- Voor eicel cultuur aankoop of vers bereiden Minimaal Essentieel Medium (MEM) en aangevuld met 3 mg / ml runderserumalbumine (BSA) als aangegeven in tabel 1. Plaats een polystyreen fles op een laad- saldo (tarra nul). Voeg alle reagentia, behalve BSA, teneinde brengen en het uiteindelijke volume met MQ-water per gewicht in totaal 250 g. Voeg dan de BSA, laten ontbinden en filter steriliseren.
Opmerking: De beschreven MEM medium vereist equilibratie en celincubatie met een medisch gasmengsel van 5% CO2, 5% O2 en 90% N2. Maar ook andere media (bijvoorbeeld CZB) worden gebruikt die het mogelijk maken cellen incuberen in 5% CO 2 onder atmosferische omstandigheden. - Voor eicel micro-injectie, kopen of te bereiden M2 medium.
- Bereid pregnant merrie serum gonadotropin (PMSG) tot een concentratie van 5 IU / 100 ui.
- Aankoop en reconstrueren siRNA voorraden om een werkende concentratie van 1 uM.
2. Mouse Eicel Collection
- DAG 1: follikel ontwikkeling te stimuleren en het verhogen van het aantal pre-ovulatoire follikels, beheren 5 IE PMSG intraperitoneaal aan vrouwelijke muizen 48 uur voorafgaand aan de eicel collectie.
- DAG 3: Voor eicel inzameling en cultuur, het opzetten van 35 mm cultuur gerechten met 3 ml MEM / BSA aangevuld met 1 ug / ml milrinon. Dit fosfodiesteraseremmer handhaaft de eicellen in profase-I te arresteren en voorkomt kiemblaasje afbraak (GVBD). Equilibreer de kweekschalen in een medisch gasmengsel gedurende tenminste 15 min.
Opmerking: Milrinon aangevuld media vereist heel eicel collectie, evenals eicel micro-injectie en de 24 uur cultuur hold periode na siRNA. - Halen de eierstokken van de vrouwelijke muizen met gevestigde laboratorium beoefent 15 en over te dragen aan een nieuwe cultuur schotel met voorverwarmde en in evenwicht MEM / BSA / milrinon.
- Plaats de cultuur schotel op het podium van een stereomicroscoop voor eicel collectie. Vrijkomen cumulus-eicel complexen (COC's) door het handmatig doorboren de antrale follikels met 27 G naalden. Bevestig een eierstok aan de bodem van de kweekschaal met een 27 G naald bevestigd aan een injectiespuit 1 ml, en moet een tweede naald alle grote follikels doorboren. Herhaal dit voor elke eierstok.
- Met behulp van standaard procedures mond pipetteren of ander eicel aspiratie, verzamel oöcyten die zijn omgeven door 2 of meer lagen compacte cumulus cellen. Breng de COC's een nieuwe schaal en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Haal de omringende cumulus cellen door herhaalde voorzichtig pipetteren met een pipet 1 ml ingesteld op een aspiratie volume van 750 pi. Herhaal de pipetteren stap ongeveer 12 keeren laat de oöcyten te herstellen gedurende 5 min. Ga zo verder totdat alle of de meeste van de cumulus cellen zijn verwijderd. Breng de blootgelegde oöcyten om een kweekschaal om de temperatuur bij 37 ° C gedurende 15 min.
- Verdeel de blootgelegde oöcyten in drie experimentele groepen worden gebruikt: (i) micro-injectie van siRNA's tegen doelwit van belang, (ii) micro-injectie van onspecifieke (control) siRNAs, en (iii) een niet-geïnjecteerde controlegroep verantwoorden kweekomstandigheden.
3. Eicel micro-injectie
- Opgericht kweekplaten met 3 ml M2 medium aangevuld met milrinon (1 ug / ml) voor oöcyt micro-injectie. Bereid cultuur gerechten met MEM / BSA / milrinon voor het wassen en de daaropvolgende cultuur van de geïnjecteerde eicellen.
Opmerking: M2 medium bevat HEPES buffer en vereist voorverwarmen bij 37 ° C gedurende 15 min onder atmosferische omstandigheden. MEM vereist pre-opwarming en verevening met behulp van medische gassen zoals beschrevend hierboven. - Bereid de micro-injectie systeem. Laad de injectienaald met 5 ul van 1 uM specifieke siRNA-oplossing. Bevestig het bedrijf pipet en injectienaald te micromanipulators van de micro-injectie systeem en het opzetten van de injectie-eenheid met gekalibreerde volume en druk.
- Plaats een 200 ul micro-druppel M2 media aan de binnenzijde van het deksel van een 3 cm kweekschaal en voeg een eicel te zetten en uitlijning van de micro-injectie systeem.
- Met behulp van de eicel als een gids, stel de positie van het bedrijf en injectienaalden. Breng negatieve druk op het bedrijf pipet zachtjes zet de eicel en de positie van de injectienaald aan te passen aan het breedste diameter van de cel. Instellingen aanpassen om micro-injectie van ongeveer 10 pl van de siRNA-oplossing mogelijk te maken overal in de eicel cytoplasma.
Figuur 1. Eicel micro-injectie opgezet. ( A) representatief beeld van 200 ul micro-druppel M2 media uit een 3 cm kweekschaal geplaatst op het deksel, met het bedrijf pipet en injectienaald gepositioneerd links en rechts, respectievelijk. (B) Groep profase-I gearresteerd eicellen (GV-fase) voor micro-injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. - Zet de deksel op de stereomicroscoop podium en voeg 200 ul micro-druppel vers medium M2. Een groep van eicellen (~ 10) aan de micro-drop via de mond pipetteren of alternatieve methoden, dan terug het deksel met micro-neerzetten aan de micro-injectie podium.
- Overgaan tot de individuele eicellen microinject. Bevestig een eicel met die pipet langzaam steek de punt van de injectienaald in het cytoplasma en uitzetting van het injectievolume van siRNA oplossing. Intrekken zorgvuldig de injectienaald en move de geïnjecteerde eicel naar een positie onder in de micro-drop. Verplaats succesvol geïnjecteerde oöcyten naar een positie aan de bovenkant van de micro-drop.
- Herhaal de procedure micro-injectie bij elke oöcyt. Om een optimale leefbaarheid eicel, microinject slechts een klein aantal eicellen te houden op een moment. Ervoor zorgen dat dit proces niet meer dan een paar minuten op temperatuur en pH veranderingen in het micro-schommelingen te voorkomen.
- Aspireren succes geïnjecteerd eicellen of voorzichtig te verplaatsen van het deksel met de micro-drop van geïnjecteerde eicellen aan de stereomicroscoop. Breng de geïnjecteerde levensvatbare oöcyten oraal pipetteren of alternatieve methoden, naar / BSA / milrinon medium te wassen en te equilibreren bij 37 ° C MEM.
- Een andere groep oöcyten, herhaalt de micro-injectie proces een nieuwe injectienaald geladen met aspecifieke siRNA's van de controlegroep. Was de eicellen in MEM / BSA / milrinon en transfer naar een aparte cultuur schotel.
- Cultuur alle groepenoöcyten voor 24 uur in MEM / BSA / milrinon bij 37 ° C onder een atmosfeer van medisch gas.
Opmerking: De 'milrinon blok' kweekperiode is nodig voor een efficiënte doelwit mRNA / eiwit uitputting.
4. Eicel Cultuur voor Meiotische rijping
- DAG 4: Voor elke experimentele groep van eicellen set-up 4 cultuur gerechten (35 mm) met 3 ml MEM / BSA. Supplement één media schotel per groep 10% (hoge kwaliteit) foetaal runderserum (FBS) dat voor rijping van oöcyten. Sta alle cultuur gerechten in evenwicht komen bij 37 ° C met medische gasmengsel.
- Om eicellen vrijgeven van "milrinon block", achtereenvolgens wassen van de eicellen driemaal in schalen met MEM / BSA en breng de oöcyten om de rijping schaaltje met medium met 10% FBS. Culture alle eicel groepen voor 17 uur bij 37 ° C, om hervatting van de meiose en progressie mogelijk.
- DAG 5: Bereid oplossingen voor eicel fixatie, waaronder: (i) 4% paraformaldehyde (PFA) in PEM buffer (100 mM PIPES [pH 6,9], 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA) met 0,5% Triton-X 100, en (ii) PBS aangevuld met 5 % FBS die wordt gebruikt voor wassen en blokkeren de eicellen.
Opmerking: Deze oplossingen vereisen vooraf opwarmen tot 37 ° C voorafgaand aan fixatie eicel. - Voor eicel fixatie (na 17 uur kweek), snelle elke experimentele groep eicellen overdragen via de mond pipetteren of alternatieve werkwijzen in individuele putjes (een 4-putjes) met 750 ul voorverwarmde 4% PFA-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Vervolgens wast elke groep oöcyten 3 keer (15 minuten elk) in 750 pl voorverwarmde PBS bevattende 5% FBS.
- Block eicellen in 200 ul PBS / 5% FBS O / N bij 4 ° C om niet specifieke binding te minimaliseren antilichaam.
5. Immunofluorescentie analyse
- DAG 6:
Opmerking: Immunokleuring wordt uitgevoerd in een multi-putjesplaat en OOCYtes worden serieel overgedragen aan opeenvolgende putten, met respectieve antilichaam en wasoplossingen. Ofwel 48 of 96-well platen kunnen worden gebruikt, alleen het volume van de oplossing aanpassen op basis van goed formaat. Voor 96-putjes platen gebruiken 200 ul per putje. Eicellen worden overgebracht naar de verschillende oplossingen in de volgende volgorde: primaire antilichaam oplossing - 3 wash putten - secundair antilichaam oplossing - 3 wassen putten. Blootstelling aan licht de plaat kan worden afgedekt met folie te beperken.
Bereid verse PBS / 5% FBS en deze oplossing antilichaam verdunningen bereiden (bijvoorbeeld konijn anti-pericentrin (1 / 1.000), muizen anti-tubuline (1 / 1.000)). - Breng de vaste eicellen van elke experimentele groep individuele putjes die 200 ul (of 100 pl, indien minder volume gewenst) van de primaire antilichaamoplossing en bedekken het goed met parafilm. Incubeer volgens optimale antilichaam-specifieke omstandigheden (bijvoorbeeld 37 ° C gedurende 1 uur of 4 ° CO / N).
Opmerking: Primaire antilichaam dilution en specifieke incubatietijd en temperatuur vereisen testen om de optimale omstandigheden voor de verschillende gebruikte antilichamen te bepalen. - Na incubatie met het primaire antilichaam, was de eicellen drie keer in PBS / 5% FBS (10-15 min elk).
- Breng de eicellen in de oplossing die fluorescent-geconjugeerde secundaire antilichamen (bijvoorbeeld 1/1000 verdunning van anti-konijn en anti-muizen-antilichamen geconjugeerd met fluorochromen van verschillende golflengten). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Was de eicellen drie keer in PBS / 5% FBS (10 - 15 min elk).
- Na de laatste wasstap, de overdracht van de eicellen op een schoon glasplaatje en zachtjes zuigen de overtollige wasoplossing. Dit zal immobiliseren oöcyten op het glasoppervlak. Voeg 8 ul van de montage media (met DAPI) en voorzichtig overlay de montage media met een 22 mm x 22 mm dekglas. Laat de dekglaasje langzaam om te voorkomen dat luchtbellen en / of beschadiging van de eicellen.
Opmerking: Als alternatief voor het 3-dimensionale eigenschappen van de eicel voor confocale microscopie analyse handhaven, voeg een klein volume van 100 urn glasparels (gemengd met vaseline) aan de hoeken van het dekglas vóór montage op de dia. - WINKEL slides bij 4 ° C, of op de beoordeling van de meiotische progressie en de analyse van expressieniveaus en subcellulaire lokalisatie eiwit met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de nodige filters naar de secundaire antilichamen gebruikt passen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Micro-injectie van siRNAs een effectieve aanpak voor mRNA afbraak en daaropvolgende eiwit depletie in oöcyten die efficiënt en zeer specifieke functionele testen van verschillende doelwit factoren in vitro mogelijk maakt. Vervolgens wordt immunofluorescentie gebruikt voor specifieke fenotype analyse en eiwit uitputting valideren siRNA-geïnjecteerde oöcyten. In het huidige voorbeeld, fluorescent etikettering van individuele eicellen met DAPI samen met anti-tubuline en anti-pericentrin antilichamen ingeschakeld: ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel er meerdere werkwijzen voor het exogene nucleïnezuur overdracht somatische cellen, zoals elektroporatie en transfectie, microinjectie is de optimale methode voor afgifte van RNA moleculen in transcriptioneel rustende muizen oöcyten. Het huidige protocol levert een effectieve aanpak voor in vitro depletie van specifieke mRNAs die de functionele testen van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren bij oöcyten mogelijk. Deze aanpak resulteert in een efficiënte transcript uitputting en is zeer f...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Georgia en een subsidie (HD071330) van de National Institutes of Health aan MMV.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
Referenties
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P. Renaissance of mammalian endogenous RNAi. FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
