Hier presenteren we een protocol specifieke siRNA-gemedieerde mRNA afbraak gevolgd door immunofluorescentie analyse meiotische spileenheid en organisatie evalueren muizen oöcyten. Dit protocol is geschikt voor in vitro depletie van transcripties en functionele beoordeling van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren in oöcyten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fouten in chromosoomsegregatie tijdens meiotische deling in gameten kunnen leiden tot aneuploïdie die vervolgens bij bevruchting aan het embryo wordt overgedragen. De resulterende aneuploïdie in zich ontwikkelende embryo's wordt herkend als een belangrijke oorzaak van zwangerschapsverlies en aangeboren geboorteafwijkingen zoals het syndroom van Down. Nauwkeurige chromosoomsegregatie is kritisch afhankelijk van de vorming van het microtubulusspilapparaat, toch blijft dit proces slecht begrepen in zoogdier-eicellen. Intrigerend is dat meiotische spilvorming verschilt van mitose en wordt gereguleerd, althans gedeeltelijk, door unieke microtubulus-organiserende centra (MTOC's). Beoordeling van MTOC-geassocieerde eiwitten kan waardevolle inzichten verschaffen in de regulatorische mechanismen die meiotische spilvorming en organisatie beheersen. Hier beschrijven we methoden om muis-eicellen te isoleren en MTOC-geassocieerde eiwitten te depleteren met behulp van een siRNA-gemedieerde aanpak om functie te testen. Daarnaast beschrijven we omstandigheden voor eicellenfixatie en immunofluorescentie-analyse om meiotische spilvorming en organisatie te evalueren.
Inleiding
Meiose is een unieke divisie proces dat plaatsvindt in gameten (eicellen en zaadcellen) en omvat twee opeenvolgende divisies zonder tussenliggende DNA-synthese van homologe chromosomen en zusterchromatiden scheiden tijdens de meiose I en meiose II, respectievelijk 1. Fouten in chromosoom segregatie tijdens de meiose verdeeldheid in eicellen kan leiden tot aneuploïdie, die wordt overgenomen door het embryo tijdens de bevruchting. Met name de incidentie van aneuploïdie in ontwikkelende embryo's stijgt met voortschrijdende leeftijd van de moeder en is een hoofdoorzaak van aangeboren afwijkingen en miskramen 1,2, dus het benadrukken een grote be....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Georgia.
1. Voorbereidingen
- Voor eicel cultuur aankoop of vers bereiden Minimaal Essentieel Medium (MEM) en aangevuld met 3 mg / ml runderserumalbumine (BSA) als aangegeven in tabel 1. Plaats een polystyreen fles op een laad- saldo (tarra nul). Voeg alle reagentia, behalve BSA, teneinde brengen en het uiteindelijke volume met MQ-water per gewicht in totaal 250 g. Voeg dan de BSA, laten ontbinden en filter steriliseren.
Opmerking: De beschreven MEM medium vereist equilibratie ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Micro-injectie van siRNAs een effectieve aanpak voor mRNA afbraak en daaropvolgende eiwit depletie in oöcyten die efficiënt en zeer specifieke functionele testen van verschillende doelwit factoren in vitro mogelijk maakt. Vervolgens wordt immunofluorescentie gebruikt voor specifieke fenotype analyse en eiwit uitputting valideren siRNA-geïnjecteerde oöcyten. In het huidige voorbeeld, fluorescent etikettering van individuele eicellen met DAPI samen met anti-tubuline en anti-pericentrin antilichamen ingeschakeld: .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel er meerdere werkwijzen voor het exogene nucleïnezuur overdracht somatische cellen, zoals elektroporatie en transfectie, microinjectie is de optimale methode voor afgifte van RNA moleculen in transcriptioneel rustende muizen oöcyten. Het huidige protocol levert een effectieve aanpak voor in vitro depletie van specifieke mRNAs die de functionele testen van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren bij oöcyten mogelijk. Deze aanpak resulteert in een efficiënte transcript uitputting en is zeer f.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Georgia en een subsidie (HD071330) van de National Institutes of Health aan MMV.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
Referenties
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
