Een microfluïdische Model van Biomimetically Breathing Pulmonary Acinaire Airways

Samenvatting

Zachte litografie werd gebruikt om een representatief model op ware grootte te produceren van longblaasjes luchtwegen die periodiek uitzetten en samentrekken, waardoor de fysiologische ademhalingsbeweging wordt nagebootst. Dit platform reproduceert respiratoire acinarische stromingen op een chip en zal naar verwachting experimenteel onderzoek vergemakkelijken naar de dynamica en afzetting van geïnhaleerde aerosolen in de longblaasjes.

Samenvatting

Het kwantificeren van de luchtwegen vloei-eigenschappen in de pulmonaire acinaire diepten en hoe beïnvloeden ze geïnhaleerd aerosol vervoer is van cruciaal belang in de richting van het optimaliseren van drug inademing technieken als het voorspellen van depositie patronen van potentieel giftige deeltjes in de lucht in de longblaasjes. Hier worden soft-lithografie technieken die gebruikt worden om complexe acinar-achtige luchtwegen structuren fabriceren in het waarheidsgetrouw anatomische lengte-schalen die fysiologische acinar stromingsfenomenen reproduceren in een optisch toegankelijk systeem. De microfluïdische apparaat beschikt over 5 generaties bifurcating cell kanalen met periodiek uit te breiden en contracting muren. Wand activering wordt bereikt door het veranderen van de druk in-water gevulde kamers rond de dunne PDMS acinaire kanaalwanden zowel de zijkanten en de bovenkant van de inrichting. In tegenstelling tot gewone multilayer microfluïdische inrichtingen waar het stapelen van verschillende PDMS mallen vereist, is een eenvoudige werkwijze gepresenteerd boven fabricerenkamer door het inbedden van de sectie loop van een injectiespuit in de PDMS mal. Deze roman microfluïdische setup levert fysiologische ademhaling bewegingen die op hun beurt leiden tot karakteristieke acinar luchtstromen te geven. In de huidige studie, micro particle image velocimetry (μPIV) met vloeistof zwevende deeltjes werd gebruikt om dergelijke lucht te kwantificeren stromen op basis van hydrodynamische gelijkenis matching. De goede overeenstemming tussen μPIV Resultaten en verwachte acinaire transportprocessen suggereren dat de microfluïdische platform in de nabije toekomst kan dienen als een aantrekkelijk vitro hulpmiddel om direct lucht representatieve deeltjes transport en afzetting in de acinaire gebieden van de longen te onderzoeken.

Inleiding

Een gedetailleerde kwantificatie van ademstroom dynamiek in de distale cell gebieden van de longen naar het ontrafelen grootste menging luchtstroom in de longen acinus en voorspellen van het lot van geïnhaleerde aerosolen in het diepste luchtwegen ^1-3. Dit laatste is van bijzonder belang bij de aanpak van enerzijds de gevaren van geïnhaleerde verontreinigende deeltjes of omgekeerd bij het ​​zoeken naar nieuwe strategieën voor betere en doelgerichte geneesmiddelafgifte geïnhaleerde therapeutica gelokaliseerde long plaatsen ^{4, 5} en voor systemische afgifte.

Tot op heden hebben de luchtwegen stromen in de diepe pulmonale acinar regio's zijn meestal onderzocht in silico met behulp van computational fluid dynamics (CFD) of in vitro met opgeschaald experimentele modellen volgende hydrodynamische gelijkenis matching. In de afgelopen decennia zijn CFD methodes in toenemende mate toegepast op acinar stroom fenomenen te bestuderen, uit enke alveolaire modellen ^{6, 7} en cell kanalen ^8-12 voor meer uitgebreide in silico modellen capture anatomisch realistische acinaire boomstructuren met meerdere generaties cell kanalen tot enkele honderden individuele alveoli ^13-15.

Samen hebben numerieke inspanningen cruciaal in licht werpen op de rol en invloed van wandbeweging tijdens de ademhaling bewegingen op daaropvolgende acinar luchtstroom patronen geweest. Bij afwezigheid van ademhaling beweging, statische alveoli feature recirculerende stromen binnen hun holtes die geen convectieve luchtuitwisseling tussen de acinaire kanaal en de alveolus ^{6, 7} vertonen; Met andere woorden, zou alvéolaire stromen volledig geïsoleerd van stromen in de acinaire bomen en luchtverversing zou uniek gevolg van diffuse mechanismen. Met de aanwezigheid van cyclische uitbreidingen van het alveolaire gebied te voorkomen, alveolaire stroom topologieën drastisch gewijzigd en de resulting stroompatronen binnen alveoli zijn nauw verbonden met de locatie van een alveole langs de acinaire structuur (bijv., proximale versus distale generaties).

Met name is gespeculeerd in simulaties dat alveolaire stromingspatronen sterk beïnvloed door de verhouding van alveolaire tot stroomsnelheden ductale zodat proximale generaties van de pulmonaire acinaire boom, waarbij deze verhouding relatief groot massacategorieën instandhouding in een boomstructuur, feature complex recirculatie stroomt binnen in de alveolaire holten met onomkeerbare vloeistof stroombanen. Met elke diepere acinaire generatie, de verhouding van alveolaire om ductale stroomsnelheden geleidelijk afneemt zodat distale acinaire generaties vertonen meer radiaal-achtige stroomlijnen die doen denken aan eenvoudige inflaties en deflations van een ballon zijn. Met de vooruitgang in de moderne beeldvormende modaliteiten, long- beeldgegevens ^{16, 17} van knaagdieren, met inbegrip van ratten en muizen, hebben aanleiding gegeven tot een aantal van de eerste CFD Simulaties van anatomisch gereconstrueerd acinaire stromen in gereconstrueerde alveoli. Ondanks deze veelbelovende vooruitgang, zijn deze recente studies nog steeds beperkt tot het aanpakken van de luchtstroom verschijnselen in terminal longblaasjes slechts ^{18, 19} of een paar alveoli rond één kanaal ^20. Hierdoor blijven state-of-the-art onderzoeken ademstroom verschijnselen in de acinus gedomineerd door studies betreffende de aspecifieke anatomisch geïnspireerd geometrie van de acinaire milieu ^2.

Op de experimentele zijde zijn verschillende opstellingen die een luchtweg met één of meerdere alveoli ontwikkeld in de jaren ^21-24. Toch bestaat er geen experimentele modellen van bifurcating cell luchtwegen die in staat is na te bootsen fysiologische ademhaling door uitbreiding en contracting van projecten in een adem-achtige mode zijn. Gezien het gebrek aan aantrekkelijke experimentele platforms bij de hand, de studie van acinar transport verschijnselen blijft beperkt met betrekking tot validaTing computational studies en kritisch, blijft er een gebrek aan experimentele gegevens beschikbaar. . In de afgelopen jaren, Ma et al (2009) hebben een opgeschaalde stijve wand model van een acinus uit drie generaties acinaire geconstrueerd; echter, het gebrek aan wandbeweging in dit model beperkt zijn vermogen om realistische alveolaire stromingspatronen onder ademhalingsomstandigheden vangen.

Andere opgeschaalde experimenten, inclusief een bewegende muur model gebaseerd op anatomische gegevens van cast replica werden onlangs geïntroduceerde ^25; Aangezien het model alleen gevangen de laatste twee acinaire generaties (bijv., terminal zakken), zij geen complexe recirculerende stromen die meer proximaal acinaire generaties karakteriseren vangen. Deze laatste voorbeelden van opgeschaalde experimenten verder onderstrepen de voortdurende beperkingen met dergelijke benaderingen. Specifiek is er geen bestaande experiment tot nu toe gebleken dat de hypothese overgang van recirculerende stromen naar radial meede acinus en daardoor numerieke voorspellingen van stroming topologieën hypothese bevestigt dat er in real pulmonale acinaire bomen ^{7, 15.} Misschien het meest kritisch worden opgeschaald experimenten uiterst beperkte het onderzoeken geïnhaleerde deeltjes transport en depositie dynamiek ²⁶ vanwege problemen in bijpassende alle relevante niet dimensionale parameters (bijv., deeltje diffusie, een kritische transportmechanisme voor sub-micron deeltjes volledig verwaarloosd).

Met de lopende experimentele uitdagingen, nieuwe experimentele platforms dat onderzoeken van respiratoire luchtstromen en particle dynamics toestaan ​​in complexe bewegende muren acinar netwerken worden gezocht. Hier, een anatomisch-geïnspireerde in vitro acinar model wordt geïntroduceerd. Deze microfluïdische platform bootst pulmonale acinar stroomt direct aan de vertegenwoordiger acinaire schaal, en vergroot het groeiende aanbod van pulmonale microfluïdische modellen ^27, met inbegrip van bronchiale vloeibare plug-flows ^28-30 en de alveolaire-capillaire barrière ^31.

Namelijk, het huidige ontwerp is voorzien van een vereenvoudigde vijf generatie cell luchtwegen boom met cyclisch uitbreiden en contracteren van muren, waar de cyclische bewegingen worden bereikt door het regelen van de druk in een water kamer die de dunne PDMS zijwanden omgeeft en waar de top muur wordt vervormd door een extra water kamer zitten direct boven de acinar structuur. In tegenstelling tot gewone multilayer microfluïdische apparaten, wordt deze kamer gewoon gevormd door het inbedden van de sectie loop van een spuit in de PDMS apparaat, en heeft de voorbereiding van een extra PDMS mal nodig.

De geminiaturiseerde hier gepresenteerde benadering biedt een eenvoudige en veelzijdige voor het reproduceren gecompliceerde acinaire structuren met bewegende wanden tegenover opgeschaalde modellen tijdens het vastleggen van de onderliggende eigenschappen van de acinaire stroom milieu. Dit platform kan worden gebruikt voor flow visualisatie met behulp van vloeistof zwevende deeltjes in de luchtwegen (zie Representatieve resultaten hieronder). In de nabije toekomst zal het model worden gebruikt met de lucht zwevende deeltjes te bestuderen ingeademd acinar particle dynamics.

Protocol

1. Master Fabrication

1. Gebruik diepe reactief ionen etsen (DRIE) van een silicium op isolator (SOI) wafer om een master silicium wafer fabriceren, zoals beschreven in het voormalige werken ^{32, 33.}
   OPMERKING: DRIE voorkeur standaard SU-8 micromachining vanwege de hoge aspectverhouding kenmerken (40 urn brede en 90 urn diepe geulen).

2. Gieten en afdichten van de microfluïdische apparaat

1. PDMS mengen en verharder bij een 10: 1 gewichtsverhouding in een schone kleine houder, zoals een plastic weegschaal.
2. Ontgas het mengsel in een exsiccator onder vacuüm totdat alle luchtbellen worden verwijderd.
   OPMERKING: Bereid genoeg PDMS voor alle volgende stappen. Hieronder, de afkorting "PDMS" verwijst altijd naar de ontgaste 10: 1 PDMS: curing agent mengsel dat bereid is in stappen 2,1 en 2,2.
3. Giet het ontgaste mengsel een hoogte van ongeveer 1 mm boven de master wafer. Ontgas opnieuw minstens40 min om alle luchtbellen te verwijderen boven de wafel en de bellen onder de wafel te minimaliseren.
   OPMERKING: Controleer of de wafel zo dicht mogelijk bij de bodem van het schaaltje. Indien nodig drukt u op de wafer langzaam naar de bodem met behulp van 2 roeren sticks en ontgassen nogmaals.
4. Bakken bij 65 ° C gedurende 20 min in een natuurlijke convectie oven.
   LET OP: Na 20 min het PDMS is gehard en bijna volledig uitgehard. Terwijl een langere baktijd kan bakken voor 20 min bespaart tijd en verbetert de hechting van de tweede laag PDMS (zie hieronder) om de eerste.
5. File de sectie loop van een plastic 2 ml spuit met een fijn schuurpapier om de naleving van PDMS te verbeteren. Daarnaast maken de schuurpapier aan de basis van de injectiespuit te vlakken door het plaatsen van het schuurpapier op een vlak oppervlak en schuiven de onderzijde van de injectiespuitcilinder erbovenop. Maak de spuit met behulp van perslucht.
6. Plaats de vatsectie van de spuit bovenop de eerste laag PDMS de laRGE opening naar het oppervlak van het PDMS en giet een tweede laag van PDMS bovenop de eerste om een ​​hoogte van ~ 5 mm en ontgas de PDMS opnieuw in een exsiccator.
   OPMERKING: De tweede PDMS laag moet de kleine container rond het vat te gieten, en niet daarin voeren.
7. Bak de volledige setup bij 65 ° C gedurende ten minste 2 uur in een natuurlijke convectie oven.
   Opmerking: Het is niet nodig om het vat op zijn plaats te houden tijdens het uitharden processen aangezien het gewicht van de PDMS drukken tegen de brede basis van de cilinder houdt het vat vast.
8. Knip de PDMS schimmel rond het patroon gebied van de master wafer met behulp van een scalpel. Tijdens het snijden, moet de scalpel zwak raak het oppervlak van de wafer. Dan, voorzichtig plaatst u een dun voorwerp, zoals wafer tang in de inkeping gemaakt door de scalpel, en trek het werpen van de meester wafer PDMS.
9. Plaats de cast op een zacht oppervlak bedekt met aluminiumfolie aan de kant patroonomhoog (bijv. moet het vat hangen vanaf de rand van de tafel), en slaat een gat in het PDMS bij de Kamer inlaat en inlaat met een 1 mm biopsie punch.
10. Bekleed een schone glasplaatje met (ontgast) 10: 1 PDMS: curing agent mengsel met behulp van een spin coater geprogrammeerd 3000 rpm gedurende 30 seconden, en bak> 1 uur bij 65 ° C. Dan, het reinigen van de glijbaan en PDMS gegoten met behulp van doorzichtige tape.
11. Behandel het oppervlak van het PDMS schimmel en PDMS gecoat glasplaatje met _O2 plasma (bijvoorbeeld met behulp van een handbediende corona treater) gedurende 1 min, en vervolgens voorzichtig op de oppervlakken elkaar en bakken bij 65 ° C gedurende de nacht (O / N) .

3. Inrichting Vullen en Aandrijving

1. Meng water gesuspendeerd fluorescerende polystyreen deeltjes met water en glycerol in een glazen flacon op een 64/36 (v / v) glycerol / water mengsel te verkrijgen met 0,25% (w / w) deeltjes ..
2. Een druppel van de glycerol oplossing bovenop de kanaal inlaat en een druppel DI water op de kamer inlaat, dan plaatst u het apparaat in een exsiccator en vacuüm voor ~ 5 min.
   LET OP: Voor het vrijgeven van de vacuüm wachten op de belletjes die zich vormen in de dalingen van glycerol-oplossing en DI water tot pop. Bij het vacuüm de release van de vloeistoffen worden meegezogen in de holtes in het apparaat. Als resterende lucht in de kanalen blijft elimineren door het toepassen van uitwendige druk op de vloeistof (bijv., Met een injectiespuit) en waardoor de lucht diffunderen in de PDMS.
3. Injecteren ~ 2 ml van DI water in de bovenste kamer (dat wil zeggen, de spuit vat, Fig. 2b), totdat het is volledig gevuld met water. Bedek de bovenste kamer met een 19 gauge stompe spuit tip, snijd de tip van een andere stompe 19 gauge spuit en steek deze tip naar de zijkamer inlaat. Sluit beide spuit tips om een ​​1 ml spuit via dunne Teflon slang en een T-vormige connector.
   LET OP: Zorg ervoor dat de 1 ml spuit, teflon slangen, T-vormige connector en de bovenste kamer (2 ml spuit barrel) zijn allemaal gevuld met water zonder bubbels. Dit kan worden bereikt door het openen aansluitpunten, waardoor water door de lege buissegmenten en opnieuw aansluiten van de aansluitpunten.
4. Sluit de spuit 1 ml van een spuitpomp voorgeprogrammeerd te bootsen bijvoorbeeld een rustige ademhalingscyclus cyclus (met een periode van T = 4 sec) geconstrueerd uit lineaire hellingen, dwz van nul tot 1,8 ml / min in 1 sec, uit 1,8 ml / min op -1,8 ml / min bij 2 sec en van -1,8 ml / min weer op nul in 1 sec.

4. Flow Visualisatie Experimenten: Micro-deeltje Image Velocimetry (μPIV)

1. Terwijl het apparaat wordt bediend, het verkrijgen van een reeks van 9-12 fasevergrendelde, dubbele framebeelden van het deeltje geplaatste stroming behulp van een micro-particle image velocimetry (μPIV) bestaande bijvoorbeeld uit een dubbel frame meervoudige belichting CCD camera (bijv., 1600 × 1200 pixels om voldoende resolutie te bereiken), een dubbel gepulseerde Nd-YAG laser (golflengte: 532 nm, uitgangsenergie: 400 mJ, pulsduur: 4 nsec) en een omgekeerde microscoop.
   Opmerking dergelijk systeem kan verkrijgen montuur paren met een vertraging van tot een paar microseconden tussen de eerste en tweede frames. Om te bereiken fasevergrendelde dubbel frame beelden, is het nuttig om een dubbel frame reeks in bijvoorbeeld verwerven., 10 Hz (frame paren zijn gescheiden door 0,1 sec van elkaar). Vervolgens kunnen de gegevens worden gereorganiseerd zodat alle frame-paren die gescheiden worden door een cyclustijd (here T = 4 sec) een nieuwe tijdreeks. Beeldacquisitie moet meerdere malen worden herhaald bij het ​​aanpassen van de vertraging tussen de eerste en tweede frames in elk frame paren (bijv., 100 psec tot 0,1 sec) voor het oplossen van verschillende stroomgebieden in de alveolaire holte.
   Opmerking: alternatieve opstellingen met betrekking tot de beste combinaties van beeld acquisitie systemen (. Dwz camera) en de verlichting bronnen (dwz, lasers) om de afbeelding zodanigmicroflows zijn ook beschikbaar ^{34, 35.}
2. Gebruik een som-van-correlatie algoritme om fasevergrendelde snelheidsvector kaarten van het resulterende stromingsveld van de beeldreeks voor elke vertraging gebruikt. Herhaal dit proces meerdere malen met verschillende vertraging tijd tussen de eerste en tweede frames in elk frame paar voor het oplossen van verschillende stroomgebieden in de alveolaire holte. Gebruik vervolgens een data-analyse programma om de individuele stroom kaarten in een compleet en high-gedetailleerde kaart van stromingspatronen samenvoegen door het gemiddelde overlappende datapunten ^33.

Resultaten

Computer-aided design (CAD) en microscoop beelden van de in vitro acinar platform worden gepresenteerd in Fig. 1. De biomimetic acinaire model heeft vijf generaties van vertakking rechthoekige kanalen omzoomd met alveolaire-achtige cilindrische holtes (afb. 1). Hier wordt het model van generatie generaties genummerd 1 (de meest proximale generatie) generatie 5 (de meest distale generatie). Alleen de kanaalinlaat leidt op generatie 1 is open naar de buitenomgeving via een openin...

Discussie

Een kritisch kenmerk van de microfluïdische acinaire platform hier gepresenteerde is de mogelijkheid om fysiologisch realistisch ademhaling bewegingen die leiden tot fysiologische stromingsprofielen en snelheden in acinaire leidingen en binnen alveoli reproduceren. Aangezien de microkanalen worden met een relatief lage verhouding (dwz., W _d / h ≈ 3,9, waarbij w _d de kanaalbreedte en h de puthoogte), de gemeten stromen toon meer pl...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polydimethylsiloxane (PDMS) en uithardingsmiddel	Dow Corning	(240)4019862	Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit
Plastipak 2 ml spuit	BD	300185
Norm-Ject Luer slip 1 ml spuit	Henke Sass Wolf	4010-200V0
1 mm Biopsie punch	Kai Medical	BP-10F
Laboratorium Corona Treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
PHD Ultra Spuitpomp	Harvard apparatus	703006
Gekleurde rode rqueous fluorescerende deeltjes	Thermo-Scientific		Uncatalloged 0.86 µm kralen werden gebruikt
Glycerine AR	Gadot	830131320
FlowMaster MITAS micro-particle image velocimetry (µPIV) systeem	LaVision	1108630