Ontwikkeling van een Backbone cyclisch peptide bibliotheek als potentieel antiparasitaire Therapeutics behulp van microgolfstraling

Summary

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Abstract

Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn nauw betrokken bij bijna alle biologische processen en zijn verbonden met vele menselijke ziekten. Daarom is er een grote inspanning om protonpompremmers in fundamenteel onderzoek en in de farmaceutische industrie richten. Eiwit-eiwit interfaces zijn meestal groot, plat, en vaak niet zakken, complicerende de ontdekking van kleine moleculen die dergelijke sites richten. Alternatieve targeting benaderingen met behulp van antilichamen hebben beperkingen als gevolg van slechte orale biologische beschikbaarheid, lage cel-permeabiliteit, en de productie inefficiëntie.

Met behulp van peptiden aan PPI interfaces doel heeft verschillende voordelen. Peptiden hebben hogere conformationele flexibiliteit, verhoogde selectiviteit en die in het algemeen goedkoop. Echter, peptiden hun eigen beperkingen waaronder slechte stabiliteit en inefficiëntie oversteken celmembranen. Om zulke beperkingen te overwinnen, kan peptide cyclisatie worden uitgevoerd. Cyclisatie werd aangetoond dat peptide selectiviteit te verbeteren, Metabolische stabiliteit en biobeschikbaarheid. Echter, het voorspellen van de biologisch actieve conformatie van een cyclisch peptide is niet triviaal. Om deze uitdaging te overwinnen, een aantrekkelijke benadering is om een ​​gerichte bibliotheek scherm waarin alle backbone cyclische peptiden hebben dezelfde primaire sequentie, maar verschillen in parameters die hun conformatie beïnvloeden, zoals de ring grootte en positie te screenen.

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de synthese van een bibliotheek van backbone cyclische peptiden gericht op specifieke parasiet PPI. Met behulp van een rationeel ontwerp aanpak, ontwikkelden we peptiden afgeleid van het schavot eiwit L eishmania receptor voor geactiveerde C-kinase (gebrek). Onze hypothese was dat sequenties in LACK die geconserveerd in parasieten, maar niet in de zoogdiergastheer homoloog kan interactieplaatsen voor eiwitten die essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van de parasieten zijn vertegenwoordigen. De cyclische peptiden werden gesynthetiseerd onder microgolfbestraling op reactietijden verminderen enefficiency. Het ontwikkelen van een bibliotheek van backbone cyclische peptiden met verschillende ringmaten vergemakkelijkt een systematische scherm voor de meest biologisch actieve conformatie. Deze werkwijze geeft een algemene, snelle en gemakkelijke manier om cyclische peptiden te synthetiseren.

Introduction

Eiwit-eiwit interacties (PPI's) spelen een centrale rol in de meeste biologische processen, van intracellulaire signaaltransductie celdood ^1. Daarom richten PPI is van fundamenteel belang voor fundamenteel onderzoek en therapeutische toepassingen. PPI kan worden geregeld door specifieke en stabiele antilichamen, maar antilichamen zijn duur en moeilijk te vervaardigen en hebben een slechte biobeschikbaarheid. Als alternatief kan PPI's worden gericht op kleine moleculen. Kleine moleculen zijn gemakkelijker te synthetiseren en goedkoop in vergelijking met antilichamen; Maar ze relatief minder flexibel en beter passen aan kleine holtes dan groot eiwit-....

Protocol

1. Apparatuur en reagentia Voorbereiding

1. Voorbereiden van apparatuur
   1. Voer alle stappen in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
   2. Chemisch synthetiseren peptiden op vaste drager met behulp van een magnetron Peptide Synthesizer met een extra module van Discover voorzien van een vezeloptische temperatuursensor voor het regelen van de microgolf vermogensafgifte in een Teflon reactievat (30 ml, met glasfrit) of in een wegwerp polypropyleen cartridge (12 ml, met een grove frit).
   3. Voor een goede menging, sluit stikstof toevoer naar het reactievat, of als alternatief verzegelen beide uiteinden van de polypropyleen....

Results

Hier beschrijven we de ontwikkeling van een gerichte kleine bibliotheek van backbone cyclische peptiden die zich specifiek richten op vitale PPI's van de Leishmania parasiet en fungeren als antiparasitaire middelen (review over peptiden die PPI's richten als antiparasitaire agenten ^87). Door de synthese van nieuwe backbone cyclische peptiden worden farmacoforen geconserveerd in een scaffold uitschuifbare grootte. De sterkte van de hier voorgestelde gerichte bibliotheek is de mogelijkheid om p.......

Discussion

De synthese van een gefocusseerde bibliotheek van hoofdketen cyclische peptiden afgeleid uit het ontbreken eiwit van de Leishmania parasiet met een volautomatische magnetron synthesizer wordt beschreven. Een gerichte bibliotheek van cyclische peptiden werd ontwikkeld met geconserveerde farmacoforen en diverse linkers. Toevoeging van verschillende linkers zoals glutaarzuuranhydride, barnsteenzuuranhydride, adipinezuur, pimelinezuur, lysine, ornithine en andere bouwstenen kan worden gebruikt om de verscheidenheid.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML	CBL	BR-1330	loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma	328634	Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Alfa Aesar	43465	Caution Toxic. Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM)	Sigma	D65100	Caution Harmful
Dibromomethane (DBM)	Sigma	D41868	Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma	T62200	Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA)	Sigma	91707	Caution Corrosive/Toxic
Diethylether	Sigma	31690	Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS)	Sigma	233781	Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade	Sigma	270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN)	Fisher Scientific	A998-4	Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA)	Sigma	3440	Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine	Sigma	W290807	Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine	Sigma	270970	Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH)	Sigma	459844	Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt)	Sigma	157260	Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)	Sigma	12804	Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP)	Advanced Chemtech	RC8602	Caution Irritant
Ninhydrin	Sigma	454044	Caution Harmful
Phenol	Sigma	P3653	Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN)	Sigma	11813	Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	221473	Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC)	Sigma	38370	Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma	522805	Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride	Sigma	G3806	Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride	Sigma	239690	Caution Irritant/Harmful
Adipic acid	Sigma	A26357	Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid	Sigma	P45001	Caution Toxic/Irritant
Chloranil	Sigma	23290	Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde	Sigma	402788	Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer	Labconco	freezone 4.5
Vacuum pump	Franklin Electric	model 1101101416 with 3/4 HP	Alcatel pump with Franklin Motor
Polypropylene cartridge 12 ml	Applied Separation	2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge	Applied Separation	8157
Polypropylene cartridge 3 ml	Applied Separation	2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge	Applied Separation	8054
Stop cocks PTFE	Applied Separation	2406
Tubes flat, 50 ml	VWR	21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes	Waters	WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer	Fisher scientific	22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml	Fisher scientific	03-312-8
Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB-501, 500 ml
Heating block	Thermolyne	1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end	Fisher Scientific	14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette	Thermo	20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100	VWR	69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap	VWR	66030-600
Analytical HPLC column	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge	Waters	OBD C18 5 µm column	19 mm × 150 mm
Mass spectrometer	Applied Biosystems	Voyager DE-RP
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20			equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20			equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).