Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

Summary

We beschrijven een reeks protocollen die samen een weefsel nabootsen hydrogel bioink waarmee functionele en levensvatbare 3-D weefsel constructen kunnen worden bioprinted voor gebruik in in vitro screening toepassingen.

Abstract

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Introduction

In de afgelopen jaren zijn verschillende technologieën beschikbaar komen die de behoefte aan alternatieve functionele organen en weefsels richt door te trachten vervaardigen of biofabricate, hen. Bioprinting heeft ontpopt als een van de meest veelbelovende van deze technologieën. Bioprinting kan worden gezien als een vorm van robotachtige additieve vervaardiging van biologische onderdelen, die kunnen worden gebruikt voor het in patroon levensvatbare orgelachtige of weefselachtige structuren op te bouwen of in 3 dimensies. ¹ Meestal bioprinting gebruik van een 3-dimensionaal (3 D) drukinrichting die wordt bestuurd door een computer om cellen en biomateriale....

Protocol

1. Hydrogel Bioink formuleringen en Voorbereiding

1. Om weefselspecifieke biochemische bieden bereiden weefselspecifieke ECM verteren oplossingen zoals eerder beschreven voor de lever. ²⁰
   Opmerking: In het algemeen zal deze ECM digest 40% van het uiteindelijke hydrogel bioink volume dat wordt gebruikt omvatten. Honderden ml ECM digest oplossing kan worden bereid, in porties verdeeld en ingevroren bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
2. Vóór formulering hydrogel lossen een foto-initiator, 2-hydroxy-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiofenon, in water van 0,1% w / v.
   Opmerking: De volumes in de 50-100 ml bereik kan van tevor....

Results

Wanneer de bovenbeschreven procedures correct worden gevolgd, hydrogels een biochemisch profiel specifiek het doelweefsel, behelzen, ²⁰ zorgen voor een hoge mate van controle over bioprinting en laatste elasticiteitsmodulus, ³⁴ en steunen functionele levensvatbare cellen in weefselconstructen.

hydrogel Customization
Om zo goed mogelijk na te bootsen natieve lever, werd de hydrogel .......

Discussion

Er zijn verschillende componenten die essentieel zijn om te overwegen wanneer u probeert om biofabricate 3-D weefsel constructies, voor eventuele toepassing bij de mens of voor in vitro screening toepassingen. Onder toepassing van de geschikte cellulaire componenten bepaalt het einde mogelijke functionaliteit, terwijl de biofabrication apparaat zelf bepaalt de algemene methode voor het bereiken van het einde construct. De derde component, het biomateriaal, is net zo belangrijk, omdat het dient dubbele rol. Spec.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronic acid	Sigma	53747
Gelatin	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primary human hepatocytes	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primary human liver stellate cells	ScienCell	5300
Primary human Kupffer cells	Life Technologies	HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide	Fischer Scientific	A669	Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue	n/a	n/a
Lyophilizer	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D Culture Platform