Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography

Summary

We presenteren een protocol over hoe om high-throughput cryo-electron tomography gebruiken om hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines te bepalen. Het protocol maakt grote hoeveelheden gegevens te verwerken, vermijdt gemeenschappelijke resource bottlenecks en vermindert stilstand, zodat de gebruiker zich concentreren op belangrijke biologische vragen.

Abstract

Cryo-elektronentomografie (Cryo-ET) is een krachtige driedimensionale (3-D) beeldvormingstechniek voor het visualiseren van macromoleculaire complexen in hun oorspronkelijke context op moleculair niveau. De techniek omvat het eerst bewaren van het monster in zijn oorspronkelijke toestand door het exemplaar snel te bevriezen in glasachtig ijs, vervolgens het verzamelen van een reeks micrografieën uit verschillende hoeken bij hoge vergroting, en tenslotte het computationeel reconstrueren van een 3-D dichtheidsmap. Het bevroren-gehydrateerde exemplaar is uiterst gevoelig voor de elektronenstraal en daarom worden micrografieën verzameld bij zeer lage elektronendoses om de stralingsschade te beperken. Als gevolg hiervan heeft de ruwe cryo-tomogram een zeer lage signaal-ruisverhouding, gekenmerkt door een intrinsiek ruizig beeld. Om objecten van belang beter te visualiseren, worden conventionele beeldanalyse en sub-tomogram averaging, waarbij sub-tomogrammen van het object worden geëxtraheerd uit de initiële tomogram en uitgelijnd en gemiddeld, gebruikt om zowel het contrast als de resolutie te verbeteren. Grote datasets van kantelingenreeksen zijn essentieel om de complexen in verschillende toestanden, omstandigheden of mutaties te begrijpen en op te lossen, evenals om een voldoende grote verzameling sub-tomogrammen te verkrijgen voor averaging en classificatie. Het verzamelen en verwerken van deze gegevens kan een groot obstakel zijn dat verdere analyse verhindert. Hier beschrijven we een high-throughput cryo-ET protocol gebaseerd op een computergestuurde 300kV cryo-elektronenmicroscoop, een direct detectieapparaat (DDD) camera en een zeer effectieve, semi-geautomatiseerde beeldverwerkingssoftwarebibliotheek tomoauto, ontwikkeld in-house. Dit protocol is effectief gebruikt om het intacte type III secretiesysteem (T3SS) in Shigella flexneri minicellen te visualiseren. Het kan toepasbaar zijn op elk project dat geschikt is voor cryo-ET.

Introduction

Type III secretie systeem (T3SS) zijn essentiële virulentie determinanten voor vele Gram-negatieve pathogenen. De injectisome, ook bekend als de naald complex, is de centrale T3SS machine vereist voor directe translocatie van effector eiwitten van de bacterie in eukaryote gastheercellen ^{1, 2.} De injectisome omvat een extracellulair naald, een basale lichaamstemperatuur, en een cytoplasmatisch complex ook bekende als sorteren complex ^3. Eerdere studies hebben opgehelderd 3-D structuur van gezuiverd injectisomes van Salmonella en Shigella, evenals de atomaire structuur van grote basale lichaamseiwitten ^{4, 5.} Recente in situ structuren van injectisomes van Salmonella, Shigella en Yersinia werden onthuld door cryo-ET ^{6 , 7.} De cytoplasmatische complex, essentieel voor effector selectie en naaldsamenstel, is niet zichtbaar in deze structuren.

Cryo-ET is het most geschikte techniek voor beeldvorming van moleculaire machines in nanometer resolutie in zijn geboorteland cellulaire context (in situ). Toch is de haalbare resolutie van cryo-ET beperkt door de dikte van het monster. Om het nadeel te overwinnen, we afgebeeld intact injectisomes in een virulente Shigella flexneri stam die genetisch gemodificeerd om minicellen dun genoeg voor cryo-ET produceren. Een andere beperking van cryo-ET is de gevoeligheid van het monster om de straling geïnduceerd door de elektronenbundel, die zeer snel vernietigt de hoge-resolutie-informatie in het monster. Hierdoor zijn zeer lage doses voor individuele tilt-beelden, zodat een geschikte dosis kan worden verdeeld over de volledige tilt-series. Dit vermindert sterk de signaal-ruisverhouding (SNR) in het uiteindelijke reconstructie, wat het moeilijk maakt de structurele kenmerken van het onderwerp van de grote hoeveelheid ruis in het tomogram differentiëren en beperkt de resolutie die kan worden bereikt door cryo- ET. Conventional beeldverwerking zoals Fourier en real-space filters en downsampling kan worden gebruikt om het contrast te verhogen, maar ten koste van het uitfilteren van veel van de hoge-resolutie gegevens. Onlangs heeft sub-tomogram middeling het mogelijk om sterk toenemen van de SNR en vervolgens de uiteindelijke resolutie in sommige gevallen sub-nanometer niveau ^{8, 9.} Een meer gedetailleerde analyse van de complexen mogelijk door computationeel extraheren duizenden sub-tomogram bevattende de aandachtsgebieden van de oorspronkelijke tomogram en vervolgens uitlijnen en het gemiddelde van de sub-tomogram te bepalen in situ complexe structuren met een hogere SNR en een hogere resolutie. Deze werkwijzen kunnen worden geïntegreerd met genetische benaderingen nog meer inzicht verschaffen in macromoleculaire samenstellingen en hun dynamische conformaties in de natieve cellulaire context.

In het algemeen tientallen of zelfs honderden duizenden sub-tomogram moeten worden gemiddeld om vast te stellen high-Resolutie structuren in situ. De overname van een voldoende aantal van de tilt-serie die nodig zijn om de productie van dit grote aantal sub-tomogram wordt al snel een bottleneck. De resulterende tilt-serie wordt vaak beïnvloed door-beam geïnduceerde verschuiving, stadium terugslag, alsmede vergroting, rotatie en scheve gebreken, die moeten worden opgelost om de tilt-serie in lijn voorafgaand aan de reconstructie brengen. De tilt-serie wordt meestal uitgelijnd door het bijhouden van goud de vaste markers, die traditioneel met de hand door middel van controle van de tilt-serie zijn geselecteerd, waardoor nog een ander knelpunt. Veel software pakketten zijn ontwikkeld voor geautomatiseerde tilt-serie overname door de computer gestuurde elektronenmicroscopen ^{10, 11, 12,} tilt-serie uitlijning en wederopbouw ^{13, 14 en} sub-tomogram gemiddeld ^15-18. Aangezien deze pakketten verwerken discrete activiteiten in de werkstroom van cryo-ET het gewenst wordt om een ​​hoger abstractieniveau bouwen in het proces systematisch stroomlijnen van de gehele regeling in één pijplijn. Daarom hebben we een software wrapper library "tomoauto" bedoeld om een ​​aantal van deze verpakkingen te ordenen in een semi-automatische eenheid, waardoor de gebruiker eenvoudige bediening met behoud van volledige configuratie van elke component op een gecentraliseerde wijze. De bibliotheek is open-source, goed gedocumenteerd, voortdurend ontwikkeld en vrij beschikbaar voor gebruik, op maat ontwikkeling of verdere integratie door middel van een online remote source code repository (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

Deze high-throughput cryo-ET pipeline is gebruikt om intact injectisomes in S. visualiseren flexneri minicellen. Een totaal 1.917 tomogram werden gegenereerd met behulp van deze methode, onthullen een hoge resolutie in situ structuur van de intacte machine waaronder het cytoplasmatische sortering platform bepaald door sub-tomogram gemiddeld ^19. Samen met moleculaire modellering van wildtype en mutant machines, onze high-throughput pijplijn biedt een nieuwe weg voor de structuur en functie van het intacte injectisome begrijpen de natieve cellulaire context.

Protocol

1. Minicel Voorbereiding

1. S. maken flexneri minicellen, transformeren 1 pl plasmide pBS58, die constitutief uitdrukt Escherichia coli celdeling genen FtsQ, ftsA en ftsZ van een low-copy spectinomycine-resistente plasmide in 5 ul elektrocompetente streptomycine resistente serotype 5a (M90T-Sm) cellen door elektroporatie op 2,5 kV voor 5 msec bij 1 mm cuvettes.
2. WINKEL minicel monsters bij -80 ° C in 15% glycerol in 1,5 ml microbuisjes cryogeen. Wanneer klaar voor gebruik, schraap ongeveer 5 ul van cellen uit het ontdooid microbuisjes met een pipet tip en schorten de cellen in 4 ml tryptische soja bouillon met spectinomycine toegevoegd aan 100 ug / ml concentratie. Grow O / N bij 37 ° C.
3. Pipetteer 2 ml van de kweek van 1,2 in 200 ml tryptische soja bouillon met spectinomycine opnieuw toegevoegd aan 100 ug / ml concentraties. Groeien bij 37 ° C tot de late log-fase.
4. Om minicellen, centrifuge verrijken200 ml van de kweek van 1,3 bij 1000 g gedurende 5 min. Giet het supernatans fractie in een nieuwe centrifugebuis en centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min. Giet uit en de supernatantfractie ontdoen en meng de pellet met de resterende vloeistof met een pipetpunt en breng circa 100 ul van het mengsel tot pellets een 1,5 ml microcentrifugebuis.

2. EM Grid Voorbereiding

1. Plaats een R2 / 2 essen carbon film 200-mesh koperen rooster koolstof side up op een glasplaatje.
   Opmerking: A R2 / 2 200-rooster wordt geselecteerd om het aantal tilt-serie die kan worden ingesteld op verkrijgen in een vierkant rooster terwijl ondersteuning van het monster en het de rand van de koolstoffilm op het gebied van de camera te maximaliseren de gewenste vergroting. Fijnmaziger rasters en kleinere essen koolstoffilms zoals R1.2 / 1,3 400-mesh kan worden gebruikt voor monsters afgebeeld bij een grotere vergroting; grotere essen carbon films zoals R3.5 / 1 200-mesh kan gebruik wordend voor monsters afgebeeld in kleinere vergroting of de microfoto geen koolstof rand en essen koolstoffilms grotere afstand als R1 moet bevatten / 4 200 mesh kan worden gebruikt om te helpen bij het uitlijnen van de fase op het interessegebied en beschermen areas over-exposure in het richten en het bijhouden van routines.
2. Plaats de dia op het platform in een glimontlading apparaat.
   OPMERKING: We gebruiken een interne inrichting waarin een anode en platform is machinaal in een vacuümexsiccator en wordt aangedreven door een hoogfrequent generator. Nadat vacuüm, sluit de hoogfrequent generator sonde naar de anode en zet de sonde gedurende 1 min glimontlading het raster. De tijd die nodig is om kwijting het net kan variëren van een paar seconden tot een minuut gloeien. Het variëren van de glimontlading tijd kan worden gebruikt om problemen met het monster concentratie en rasters die droog verschijnen zonder glasvocht ijs diagnosticeren.
3. Verwijder het rooster met een set van een tang, en sluit de tang afgesloten met een elastische ben.
4. Voeg 100 ul van 10 nm colloïdaal goud oplossing voor de microcentrifugebuis met bereid 1,4 minicellen en meng door voorzichtig tikken de buis met een vinger. Met een nieuwe pipet plaats 4 pi van het mengsel op het rooster opgesteld 2,2.
   OPMERKING: Colloïdaal goud is verkrijgbaar in diverse afmetingen en zorg moet worden genomen dat de grootte van het goud is groter dan 5 pixels gezien de pixelgrootte van de microfoto van het verkregen vergroting te verwerken, terwijl niet te groot om onduidelijke functies interessant.
5. Bereid de duik-vries apparatuur; Vul de buitenste bevriezing container met vloeibare stikstof en vul dan de binnenste kamer met vloeibaar ethaan. Bevestig de tang met het raster om de zuigerstang en vergrendel de zuigerstang in de hoge stand.
   OPMERKING: Zie Iancu et al ^{20 voor een} protocol beschrijft het gebruik van een commercieel duik-vries apparatuur..
6. Dep het rooster door voorzichtig aanraken van een stuk filtreerpapier tHij vallen van het monster totdat de meniscus tussen het net en filterpapier scheidt en de wicking op het filter papier stopt, dan onmiddellijk de zuigerstang los, het bevriezen van de grid. Haal de tang van de zuigerstang en plaats het rooster in een houder net.
7. Bereid de cryo-EM overslagstation door het invullen van de laadruimte en absorptie pomp container met vloeibare stikstof. Zodra de laadruimte is op vloeibare stikstof temperatuur plaats de houder net en een microscoop exemplaar cartridge in de laadruimte.
8. Verwijder de borgring, die ofwel een kleine schroefdraad borgring op eerdere Polara microscopen of een C-stijl clip ring op latere modellen zorgvuldig; Plaats de EM rooster in de cartridge met behulp van een tang en dan zachtjes plaats de borgring terug op de cartridge het veiligstellen van de grid.
9. Verwijder de meerdere specimen houder van de microscoop en bevestig deze aan het overslagstation. Plaats het monster cartridge in de houder met behulp van een tang een cartridged trekken de houder van de laadruimte en de overdracht van de verschillende monster houder terug naar de microscoop.
   OPMERKING: Zie Chen et al ^{21 voor} een visuele protocol detaillering 2,1-2,9..

3. High-throughput Geautomatiseerde Tilt-serie Collection

1. Verzameling van Low-vergroting Maps
   1. Open een nieuw venster Navigator door te klikken op 'Open' in de 'Navigator' menu van SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Zoek rooster vierkanten die aanvaardbaar beeldvorming voorwaarden bevatten (dat wil zeggen, dun ijs, geen vervuiling, onderwerp van belang) met behulp van de tl-scherm bij lage vergroting (~ 2,300X voor minicel specimen).
      OPMERKING: [Optioneel:. Deze stap kan worden geautomatiseerd met SerialEM door montaging het hele net, maar het kan sneller zijn om gewoon handmatig een paar gebieden]
   3. Stel het podium om eucentrische hoogte door het kantelen van het monster houder tot 50 ° dan passende z-hoogte tot de xy vertaling van het podium is minimaal tussen de gekantelde en untilted uitzicht.
   4. Verplaatsen naar het midden van het plein rooster en klik op 'toevoegen Stage Pos' knop in het venster Navigator om de huidige fase positie op te slaan.
   5. Blijven stappen 3.1.1-4 boven totdat alle acceptabele raster pleinen podium posities zijn opgeslagen.
   6. Open een nieuwe montage MRC bestand door te klikken op 'Nieuwe montage' in het menu 'Bestand'. In de Montage Setup dialoogvenster dat opent, selecteer een aantal stukken in de X en Y dat de hele rooster plein (bijvoorbeeld 10 x 10 voor een standaard 200 rooster) zal verwerven. Gebruik een hoge binning zoals 8 en selecteer de 'Move Stage plaats van Shifting Beeld' en 'Ga correlaties gebruikt om stukken af ​​te stemmen' radio knoppen.
   7. In het venster Navigator klikt u op de eerste fase positie en zet deze om te worden overgenomen door het controleren van de checkbox 'Acquire'. Herhaal dit voor elke fase positie in het venster Navigator.
   8. Open de Navigator Acquire Dialog door te klikken op 'Acquire op Points' in de 'Navigator' menu. Controleer de 'Acquire image map' en checkbox 'Rough eucentricity' en zorg ervoor dat alle andere selectievakjes zijn uitgeschakeld. Klik op 'Doorgaan' om een ​​montage in elk stadium plaats te verzamelen.
2. Tilt-serie Acquisition
   1. In het venster Navigator selecteert u een van de verworven kaarten en klik op de 'Load kaart' te klikken.
   2. In het venster Navigator klikt u op de 'Add Points' en selecteer de punten in de kaart waarop een tilt-serie te verwerven. Klik vervolgens op de 'Stop Points toevoegen' te klikken. Herhaal dit voor elke kaart verzameld.
   3. In het Camera menu 'Parameters' en definieer de parameters voor de Focus, Trial en Record modes. [Optioneel:. Dosis-gefractioneerde gegevens kunnen in de parameters voor de opnamemodus worden gespecificeerd]
   4. Selecteer een punt in het venster Navigator en controleer de 'Tilt-Series9; vakje. In het dialoogvenster Tilt-serie geopende venster selecteert u de gewenste parameters voor de tilt-serie collectie. Herhaal dit voor de rest van de geselecteerde punten in het venster Navigator, maar de kaarten niet selecteren.
   5. In het Navigator menu opnieuw selecteren van de 'Acquire op Points'. In de Navigator Acquire dialoogvenster kies 'Lijn punt', Autofocus 'en' Rough eucentricity 'als voorbereidende taken, en selecteer' Acquire tilt serie 'als de primaire taak, en selecteer' Sluiten kolom kleppen aan het einde 'van de kolom te sluiten wanneer alle van de punten zijn verzameld. Na te gaan van een tilt-serie zal worden verzameld op elk punt in elke kaart.

4. High-throughput Geautomatiseerde Tilt-serie Verwerking en Wederopbouw behulp Tomoauto

1. Correctie van Beam-geïnduceerde Motion in Dose-gefractioneerde gegevens [optioneel]
   OPMERKING: Tomoauto gebruikt MOTIONCORR ²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) tot-beam veroorzaakte bewegingen verwijderen uit dosis gefractioneerde microfoto. NOTIONCORR ¹⁶ moeten op het systeem worden geïnstalleerd.
   1. Met de originele tilt-serie, de output logboek van SerialEM ^{10 en de} individuele dosis-gefractioneerde beelden allen in de huidige directory, in een terminal het commando:
      dose_fractioned_to_stack
      is de naam van de tilt-serie te verwerken.
2. Uitlijning en Reconstructie van Tilt-serie
   OPMERKING: Tomoauto standaard gebruikt IMOD ¹³ (http://bio3d.colorado.edu/imod/) naar tilt-serie geautomatiseerde de vaste model generatie, uitlijning, de bepaling van het contrast transfer functie (CTF), CTF-correctie ^23, behandelen en wederopbouw. Als alternatief hebben gebruikers de mogelijkheid om in tomoauto RAPTOR ²⁴ te gebruiken (inbegrepen in IMOD) voor geautomatiseerde de vaste model generatie, CTFFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) aan de CTF bepalen en tomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) voor de wederopbouw of in combinatie van softwarepakketten door een configuratie. Deze configuratie alsook de parameters in elk pakket behandeld door een globale configuratie bestand dat kan worden bewerkt om de waarden het meest gebruikt in een laboratorium te passen terwijl de lokale configuratiebestanden kunnen ook worden gemaakt voor detail parameters voor een specifiek monster, inzameling instellen of individuele tilt-serie. Alle pakketten die willen gebruiken moeten op het systeem worden geïnstalleerd.
   1. Met de tilt-serie in de huidige directory, in een terminal het commando
      tomoauto --CTF --mode align =
      is de tilt-serie worden verwerkt en de Diameter van de vaste markers in nanometer. Dit commando zal lijn en schat de CTF van de tilt-serie automatisch. Het is mogelijk om CTF verwerking overslaan door het verwijderen van de --CTF optie uit de opdracht.
   2. Inspecteer de uitgelijnde tilt-serie visueel te flagrante fouten in de uitlijning verwerking en inspecteer de geschatte CTF door het uitvoeren van de commando's:
      3dmod .ali
      submfg _ctfplotter.com
      respectievelijk, waarbij de naam van de tilt-serie zonder suffix. Controleer ook de uitgang van de tomoauto commando om de gemiddelde resterende fouten gegenereerd door de uitlijning, die kwantitatief statistiek van aanpassing kwaliteit te zien.
   3. Gegeven een acceptabele uitlijning te gaan verwerken door het uitvoeren van de opdracht:
      tomoauom --CTF --mode = reconstrueren
      met dezelfde gebruiker vervangingen als in 4.2.1. Dit commando zal de CTF corrigeren, wist de vaste markers van de tilt-serie en bereken de wederopbouw. Weer CTF verwerking kan worden overgeslagen als in 4.2.1.
   4. [optioneel] Voor de visuele inspectie stap overslaan en volledig automatiseren van de verwerking en de wederopbouw van de opdracht uit te voeren
      tomoauto --CTF
   5. [optioneel] Als u een specifieke lokale configuratie te gebruiken, raadpleegt u de tomoauto documentatie over hoe een lokaal configuratiebestand te genereren, en dan is het commando
      tomoauto [opties] -L
      waarbij is de naam van de lokale configuration bestand.

5. Sub-tomogram Middelingstijd

LET OP: We gebruiken de i3 pakket ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/) om sub-tomogram middeling experimenten te verwerken, maar het protocol beschreven geldt in het algemeen voor de meeste beschikbare sub-tomogram middeling software packages16to proces sub-tomogram middeling experimenten, maar het protocol beschreven geldt in het algemeen voor de meeste beschikbare sub-tomogram middeling softwarepakketten ^16-18.

1. Met de gereconstrueerde tomogram in de huidige directory het openstellen van de tomogram voor deeltjesfysica plukken door het uitvoeren van de opdracht:
   tomopick .rec
   waarbij is als in 4.2.2. In het venster dat opent met de linker muisknop te klikken op de eerste de basale lichaam en dan de naald om een ​​injectisome selecteren en gebruik de pijlen omhoog en omlaag-toetsen om riff door het plakken van de tomogram. Selecteer alle zichtbare injectisomes op deze manier. Deze slaat de coördinaten in een tekstbestand waarin de lange as van de structuur en het schatten van twee van de drie Euler hoeken beschrijft de oriëntatie van de structuur.
2. Computationeel extract 400 ³ voxel kubussen tomogram gecentreerd op het middelpunt van de gedefinieerde lengteas door het commando:
   clip resize Cx -CY -CZ -IX 400 -iy 400 -iz 400
   .rec _001.mrc
   waarbij , , zijn het middelpunt coördinaten van de structuur en is als in 4.2.2. De grootte van de geëxtraheerde kubus dient te variëren door de structuur en de vergroting gebruikt en groot genoeg om de structuur van belang, die dit monster 400 ³ voxels afdoende omsluiten moeten zijn.
3. Down-monster (bin) de sub-tomogram met een factor vier tot de rekentijd voor de eerste lijn te verminderen door het uitvoeren van de opdracht:
   binvol -b 4 _001.mrc _001.bin4.mrc
   waarbij is als in 5.2.
4. Breng de bepaald Euler hoeken om sub-tomogram en bereken het mondiale gemiddelde op de oorspronkelijke sjabloon te produceren door het uitvoeren van de opdracht.
   I3totsum.sh
5. Af te stemmen en te classificeren down-bemonsterd sub-tomogram met een binaire indeling masker van het cytoplasmatische gebied. Het uitvoeren van sub-tomogram middeling in Fourier ruimte om de ontbrekende wig artefacten kenmerk van tomografie minimaliseren. Voor binning 4 data, gebruik dan SAMPFACT = "4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. Herhaal stap 5.5 met behulp van sub-tomogram down-bemonsterd met een factor twee (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") en nogmaals met de originele data (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
   i3mramsacls.sh

Results

Monsters van minicellen S. flexneri werden ingezameld en verwerkt zoals getoond in de schematische figuur 1 via tomoauto na de pijpleiding gedetailleerd in figuur 2. Tilt-serie werden verzameld met behulp SerialEM ^10, die zorgt voor high-throughput-tilt series verwerving punten door de gebruiker aangewezen lage vergroting montage maps (figuur 3). Microfoto's werden verzameld met behulp van dosis...

Discussion

De high-throughput hier beschreven methode ons in staat om 1917 cryo tilt-serie te verwerken en produceren meer dan 4.500 sub-tomogram van de intacte S. flexneri injectisome ^19. De verzamelde gegevens tot de gedetailleerde karakterisatie van in situ injectisome, waaronder het cytoplasmatische sorteren complex. De werkwijze werd eveneens toegepast om verschillende mutantcellen visualiseren specifieke deletie van vermoedelijke eiwitcomponenten, die hielp verhelderen de samens...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es, Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch, PyTom http://pytom.org