Methodenartikel

Primaire endodermale epitheelcellen Cultuur van de dooierzak membraan van de Japanse kwartel embryo

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53624

⸱

10 maart 2016

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

In dit artikel

Samenvatting

Om het mechanisme van lipidenbeschikbaarheid in dooierzakmembranen tijdens de late stadia van embryonale ontwikkeling van vogels te bestuderen, hebben we een primaire Japanse kwartelembryonale endoderm epitheliale celkweeksysteem opgezet.

Samenvatting

Wij vestigden een endodermale epitheliale celcultuur model (EEG) voor het bestuderen van de functie van bepaalde enzymen en eiwitten in het bemiddelen nutriëntenbenutting door aviaire embryo's tijdens de ontwikkeling. Bevruchte Japanse kwartel eieren werden bij 37 ° C gedurende 5 dagen en dan dooierzak membranen (YSM) werden verzameld om de EEG-cultuur op te zetten. We isoleerden embryonale endoderm laag uit YSM, en gesneden het membraan in 2-3 mm gesneden en gedeeltelijk gedigereerd met collagenase voor het zaaien in 24-well kweekplaten. De EECS vermenigvuldigen uit het weefsel en zijn klaar voor celcultuur studies. We vonden dat de EECS had typische kenmerken van YSM in vivo, bijvoorbeeld, accumulatie van lipide druppeltjes, expressie van sterol O-acyltransferase en lipoproteïne lipase. De gedeeltelijke spijsvertering behandeling aanzienlijk toegenomen de succesvolle tarief van EEG-cultuur. Gebruik makend van de EECS, hebben we aangetoond dat de expressie van SOAT1 werd gereguleerd door de cAMP dependent proteïne kinase A gerelateerde route. Deze primaire Japanse kwartel EEG kweeksysteem is een nuttig instrument om embryonale lipide transport te bestuderen en om de rol van genen die betrokken zijn bij de bemiddeling nutriëntenbenutting in YSM tijdens aviaire embryonale ontwikkeling te verduidelijken.

Inleiding

De grotere voedingswaarde bron van het aviaire embryo dooier, bestaande uit 33% lipiden, 17% eiwit en 1% as. 1 tijdens de embryonale ontwikkeling, de dooierzak membraan (YSM) groeit vanuit de embryonale buikholte en geleidelijk omvat de dooier oppervlak. Beginnend bij de embryonale dag 2, wordt genexpressie geassocieerd met de vetstofwisseling en angiogenese geleidelijk verhoogd in YSM, en de YSM ontwikkelt zich langzaam villus-achtige projecties. 8,9 Deze projecties te verhogen absorptie van dooier voedingsstoffen naar de embryonale ontwikkeling te ondersteunen. De YSM is een extra-embryonale weefsel dat drie kiem lagen, endoderm, mesoderm en ectoderm bevat. 14 De dooierzak ectoderm kijkt uit op het eiwit en banden met de vitelline membraan om voorzichtig te dekken de dooierzak. De endodermale epitheelcellen worden direct geconfronteerd met de richting van de eidooier en dienen als nutriëntenbenutting portals. 6 Zoals de YSM uitbreidt, endodermale epitheliale cellen (EECS) kan worden gedeeld door shape en functionaliteit in twee groepen, het gebied vitelline en omgeving vasculosa. 7

Area vitelline bestaat uit endodermale cellen en is ver van het embryo; gebied vasculosa bestaat uit mesodermale cellen en dekt gedifferentieerde EECS met bloedvaten en bindweefsel. Door embryonale dag 5 wordt de dooier volledig onder ectoderm en endoderm van YSM en de vasculaire gebied snel gegroeid. De YSM absorbeert, opnieuw samenstelt en releases lipiden (als-dooier afgeleid zeer low density lipoprotein) en eiwitten in de embryonale bloedsomloop. 9, 2 Daarom is een primaire Japanse kwartel embryonale endodermale epitheelcel kweeksysteem opgericht we, om de mechanismen van lipide bestuderen gebruik in YSM tijdens aviaire embryonale ontwikkeling.

Lipiden zoals triglyceriden, lecithine, fosfolipiden en cholesterol ester (CE) zijn de primaire energiebronnen voor aviaire embryo's. In de vroege stadia van ontwikkeling, dooier lipiden composed van slechts 1,3% CE en het stijgt tot 10-15% op de middellange termijn van aviaire embryonale ontwikkeling 3, is 11. Cholesterol ester gesynthetiseerd uit cholesterol door sterol O-acyltransferase 1 (SOAT1) in aviaire embryo YSM. 4

De opslag vorm van cholesterol is CE, wordt CE uitgevoerd in lipoproteïnen, en lipoproteïnen worden door het verkeer getransporteerd naar weefsels. 13 Een week voor luik is er een snelle groei van aviaire embryo's. Ongeveer 68% van de resterende inhoud lipide in de dooier wordt geabsorbeerd tijdens deze fase. 10 Het mechanisme waarmee lipiden dooier gebruikt kan worden verduidelijkt door EEG onderzoeksmodel. Een kip EEG cultuurprotocol opgericht om dit onderzoek doel te bereiken. 2, 9 Vanwege de lage slagingspercentage weefsel explantaten een verbeterde celcultuur procedure EEG nodig is om de functie van bepaalde enzymen en eiwitten te bestuderen in het mediëren nutriëntenbenutting door aviaire embryo tijdens de ontwikkeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Deze procedure is een modificatie van een kip model cultuur protocol ontwikkeld door Bauer et al 2013 en Nakazawa et al, 2011 2,9..

1. Bereid Gezonde embryonale Dag 5 embryo's uit de Japanse kwartel

  1. Plaats 1 mannelijke en 3 vrouwelijke geslachtsrijp Japanse kwartel samen in dezelfde kooi. Supply voer en water ad libitum. Pas het licht in het dier kamer 14 uur licht en 10 uur duisternis.
  2. Verzamel bevruchte eieren in plastic zakken elke dag in de middag en bewaar ze in een 16 ° C koelkast om de groei van de embryo's te vertragen.
  3. Na een voldoende aantal eieren te verzamelen binnen een periode van twee weken, broeden de bevruchte eieren in een 37 ° C incubator met goede ventilatie voor vijf dagen.

2. Bereid Basale Medium en Wash Solutions

  1. Gebruik DMEM / F-12 medium (pH 7,2) als groeimedium en aanvullenmet 10% pasgeboren kalf serum (NBCS) en 1% Pen-Strep Ampho. Oplossing (PSA, penicilline, 10 5 eenheden / l, streptomycine 100 mg / l; Amfotericine B, 0,25 mg / l).
  2. Bereid oplossing fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij een 10x concentratie voor opslag; Gebruik 1x PBS-oplossing (bevattende NaCl, 137,93 mM, KCl, 2,667 mM; KH 2PO 4, 1,471 mM; Na 2 HPO 4 -7H 2 O, 8,06 mM, op pH 7,2) te wassen en bevochtigen dooierzak membraan terwijl scheiden van het endoderm uit eidooier en albumine.
  3. Gebruik DMEM medium (pH 7,2) te resuspenderen endoderm pellets.

3. Inning van Primary EECS van de Japanse kwartel YSMs

  1. Incubeer de verzamelde eieren voor 5 dagen (stap 1,3). Onderzoek de eieren met een ei candler de normale embryonale ontwikkeling te bevestigen.
    OPMERKING: Op embryonale dag 5 de grens van YSM mesoderm is duidelijk en 3 embryonale lagen minder strak tegen elkaar verbonden, zodat het gemakkelijk te obTain endoderm. Gebruik alleen de eieren met normale capillaire circulatie ontwikkeling YSM collecties.
  2. Maak de eierschaal voorzichtig met vers water en 75% ethanol. Open de eierschaal uit de lucht cel positie door een schaar, zachtjes schil uit en verzamel de gehele YSM door pincet en plaats in een 10 cm cultuur schotel gevuld met 37 ° C 1x PBS.
  3. Met behulp van een schaar verwijder het embryo, dooier en eiwit, en voorzichtig wassen YSM met 1x PBS en driemaal plaats YSM in PBS oplossing in een 10 cm kweekschaal.
  4. Gebruik pincet en een schaar om het ectoderm van YSM verwijderen. Gebruik 2 tang, een om stevig vast te houden de endodermale cellaag, en de andere naar de capillaire mesoderm te houden.
  5. Onder een microscoop ontleden, uit elkaar trekken en scheiden de endoderm van de rand van het mesoderm in de richting van het embryo. Verzamel de lichtgele endoderm in 50 ml centrifugebuizen behulp van een druppelaar en plaats in 15 ml kweekmedium in een 37 ° C water bad totdat alle weefsel collecties zijn voltooid.

4. Digestie van de Endoderm Slices door Collagenase Spijsvertering

  1. Vers ontbinden 6,5 eenheden van type IV collagenase in 10 ml DMEM.
  2. Centrifugeer de 50 ml buizen (3,4) en 130 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het medium en leg alle endoderm in een 6 cm cultuur schotel met een pipet. Voeg 1 ml collagenase oplossing hiervoor kweekschaal.
  3. Snijd de vanuit 2 kwartel embryo's met een paar gebogen schaar tot de grootte van elk segment endoderm ongeveer 2 tot 3 mm. Gebruik een pipet, verzamel alle segmenten in een 50 ml centrifugebuis met 9 ml verse collagenaseoplossing.
  4. Digereer het weefsel met collagenase gedurende 30 min in een 37 ° C schuddend waterbad bij 175 rpm. Deze gedeeltelijke digestie met collagenase wordt gebruikt om de proliferatie explantatie cel verbeteren.
  5. Centrifugeren bij 130 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de bovenstaande fractie met een pipet. Was de pellet door de suspensie in 20 ml DMEM en verwijder de bovenstaande fractie na 130 xg centrifugeren gedurende 3 minuten.
  6. Resuspendeer de pellet met 12 ml groeimedium (DMEM / F12 met 10% NBCS en 1% PSA) en zaden voorzichtig en gelijkmatig in een 24-well plaat (elk putje met 500 pi celoplossing).
  7. Incubeer weefselexplantaten bij 37 ° C in 5% CO2 in lucht gedurende 2 dagen om cellen te laten groeien uit de weefsels.
  8. Incubeer cellen gedurende nog 2 dagen en karakteriseren van cellevensvatbaarheid door cellevensvatbaarheid testprotocol. 15
    LET OP: Levende cellen handhaven van een reducerende omgeving in de cytosol. Resazurin, het actieve bestanddeel, is een niet-toxisch, celpermeabel verbinding die blauw van kleur en vrijwel niet-fluorescerend. Wanneer toegevoegd aan celculturen resazurin wordt gereduceerd tot Resorufin in het cytoplasma van mitochondriale enzymen. Resorufin is rood van kleur en zeer fluorescent. Levensvatbare cellen continu zetten resazurin om resorufin, Incremend de totale fluorescentie en kleur van het kweekmedium omringende cellen.
  9. Voer endoderm epitheelcellen totale RNA-isolatie, reverse transcriptie en kwantitatieve real-time PCR van merkergen mRNA-expressie zoals beschreven. 16,17
    1. Gebruik reverse transcriptase PCR om mRNA te detecteren SOAT1 (sense: 5'- GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisense: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR-product = 168 bp) als een specifieke marker voor EEG-cellen. Gebruik β-actine-mRNA (sense: 5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisense: 5'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; PCR-product = 151 bp) als een housekeeping gen en interne controle.
    2. Gebruik gelelektroforese om de productgrootte van RT-qPCR detecteren. Bereid 1% agarose gel en meng 10 pl qPCR product met 2 pl ladingskleurstof. Load 10 pi mengsel in elk putje in de 1% agarosegel, en uitvoeren van de gel door 100V gedurende 30 minuten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met het oog op het doel van de oprichting van een consistente en bruikbare cel model te bereiken, moeten we uit te breiden en het stabiliseren van de proliferatie snelheid en prestaties van aviaire EECS. We vergeleken directe incubatie van het endoderm zonder enzymdigestie met endoderm gedeeltelijk gedigereerd met proteolytische enzymen, zoals collagenase of collagenase plus 0,6 U Dispase. Dispase een amino-endopeptidase dat het N-terminale peptide bindingen van niet-polaire aminozuurres...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Omdat de vorige cultuur systeem slechts beperkt succes, is een betere kweeksysteem nodig. De Japanse kwartel YSM endoderm vereist een behandeling met proteolytische enzymen zoals collagenase aan de cel-cel verbindingen los te maken om betere groei in de ex-vivo explantaten te bereiken. Onze gegevens tonen aan dat het aantal cellen van gedeeltelijke digestie behandeling na zaaien gedurende 2 dagen (figuur 1) groter is dan de onverteerde weefselkweek waren. Daarom is de gedeeltelijke proteolytische digest...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er zijn geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten. We hebben geen financiering ontvangen van enig particulier bedrijf.

Dankbetuigingen

De financiering voor de ontwikkeling van het huidige protocol is vooral gesteund door "Doel voor de Top Universiteit Plan 'van de National Taiwan University, Taiwan (subsidie ​​ID-104R350144), evenals het ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan (subsidie ​​ID: MOST 104 -2313-B-002-039-my3). We hebben vooral dank de Center for Biotechnology van de National Taiwan University voor het verstrekken van een dier kamer en laboratoriumruimte voor de huidige studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by Life technologies12800-017 10 X 1 LVoor het wassen van de EECs pellets
D-MEM/F-12Gibco by Life technologies12400-024 10 X 1 LAls basaal medium bij het kweken van EECs
NBCSGibco by Life technologies16010-159Als aanvullend serum bij het kweken van EECs
Pen-Strep Ampho. OplossingBI (Biological Industries)03-033-1B 100 mlVoor het verminderen van mogelijke infectie
Collagenase Type IVGibco by Life technologies17104-019 1 gCollagenase is een protease met specificiteit voor de binding tussen een neutraal aminozuur (X) en glycine in de sequentie Pro-XGly-Pro. Als protease voor het dissociëren van cellen uit primair weefsel.
24-well plateFALCON®REF-353047Voor het hechten en uitbreiden van EECs
50 ml PP centrifuge tubesCorning® CentriStarTM430829Voor transport van membranen en enzymdigeratie
50 ml Conical bottomed Tube met CapPRO TECHCT-50-PL-TWVoor transport van membranen en enzymdigeratie
Reciproke schudbaadDEAGLESB302Voor betere enzymatische digeratie van membranen

Referenties

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Collagenasedigestiecelproliferatie assayRT qPCR analyseaccumulatie van lipidedruppelsSOAT1 expressieregulatie van het cAMP padaviaire embryonale ontwikkeling

Gerelateerde artikelen