Methodenartikel

Identificatie van kinesine-1 Cargos Met behulp van fluorescentiemicroscopie

11.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53632

⸱

14 februari 2016

1Department of Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een protocol voorgelegd aan Kinesin-1 ladingen te identificeren. Een motorloze mutant van de kinesine-1 zware keten (KIF5B) aggregaten in het cytoplasma en induceert aggregatie van de ladingen. Beide aggregaten gedetecteerd onder fluorescentiemicroscopie. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om ladingen van andere auto eiwitten te identificeren.

Samenvatting

Fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om Kinesin-1-cargo's te identificeren. Onlangs werd aangetoond dat de zware keten van Kinesin-1 (KIF5B) de nucleaire transcriptiefactor c-MYC transporteert voor proteosomale degradatie in het cytoplasma. De hier beschreven methode omvat de studie van een motorloze KIF5B-mutant voor fluorescentiemicroscopie. De wildtype- en motorloze KIF5B-eiwitten zijn getagd met het fluorescerende eiwit tdTomato. Het wildtype tdTomato-KIF5B verschijnt homogeen in het cytoplasma, terwijl de motorloze tdTomato-KIF5B-mutant aggregaten vormt in het cytoplasma. Aggregation van de motorloze KIF5B-mutant induceert aggregatie van zijn cargo c-MYC in het cytoplasma. Daarom biedt deze methode een visueel middel om de cargos van Kinesin-1 te identificeren. Een vergelijkbare strategie kan worden gebruikt om de cargos van andere motoreiwitten te identificeren.

Inleiding

Kinesine-1 is een motor eiwit dat anterograde transport van de ladingen 1,2 medieert. Het is een heterotetrameer van de twee subeenheden van Kinesin lichte keten 1 (KLC1) en twee subeenheden van Kinesin zware ketens (KHCs). KIF5B 1, een KHC, bevat een motor domein aan het N-uiteinde, die ATP hydrolyseert en zet de chemische energie in mechanische energie voor beweging langs microtubules. De C-terminale regio bevat dimerisatie domein dat interageert met KLC1 die associeert met lading. Kinesine-1 transporteert ladingen zoals blaasjes, organellen en mRNA 3,4. Recentelijk KIF5B bleek de nucleaire transcriptiefactor c-MYC transporteren proteosomale voor afbraak in het cytoplasma 5. Drie methoden (chemische remmer, siRNA / shRNA en dominant negatieve mutant) gebruikt om kinesine-1 werking te remmen. Allen geïnduceerde aggregatie van c-MYC in het cytoplasma. De laatste methode, werd c-MYC alleen beïnvloed door de dominante negative mutant van KIF5B, maar niet door die van een andere verwante KIF5A motor eiwit, wat suggereert dat de mutant niet algemene effecten op de intracellulaire componenten (zoals microtubuli verstoren) of eiwitaggregatie uitoefent. De dominante negatieve mutant van KIF5B ook geen invloed op andere transcriptiefactor, wat suggereert dat zij algemene effecten op transcriptiefactoren uitoefent. In plaats daarvan suggereert dat de dominante negatieve mutant uitoefent specifieke effecten op de ladingen.

Het gebruik van dominant negatieve mutanten is gebruikelijk in het gebied van motorische eiwitten. Vergelijkbare motorloze mutanten van kinesins en myosins werden eerder gebruikte. Ze zijn vooral gebruikt om de effecten van de mutanten op het subcellulaire lokalisaties van hun lading of cellulaire functies 6-12 tonen. Minder nadruk werd gelegd op de ruimtelijke relatie tussen de mutanten en de getroffen door deze ladingen te zetten. In sommige incidenties werden de mutanten waargenomen co-lokaliseren met hun cargos 6,10.

De interactie tussen KIF5B en de bijbehorende eiwitten werd eerder bevestigd door de in vivo gist-twee-hybride-assay en biochemische pull-down assays zoals co-immunoprecipitatie en in vitro pull-down assays 13-16. In dit artikel wordt een extra visuele methode met behulp van fluorescentie microscopie beschreven KIF5B lading eiwitten te identificeren. De werkwijze gebruikt een motorless KIF5B mutant die fungeert als een dominant negatieve mutant. Deze aggregaten in het cytoplasma en aggregatie induceert van de ladingen.

De tagging van wild-type en motorloze KIF5B mutant met de fluorescerend eiwit tdTomato 17 in staat stelt hun visualisatie met behulp van fluorescentie microscopie. Het gemerkte KIF5B eiwitten samen worden weergegeven met een kandidaat eiwit gefuseerd met een ander fluorescerend eiwit met spectrale eigenschappen op geschikte wijze van het KIF5B tag. De gemerkte eiwitten worden direct waargenomen in levende cellenonder fluorescentiemicroscopie. Inductie van aggregatie van de kandidaat-eiwit door de motorloze KIF5B mutant zal bevestigen dat de kandidaat-eiwit is een in vivo lading KIF5B. Verder kan de tdTomato hebben KIF5B eiwit alleen tot expressie worden gebracht in de cellen om hun effecten te bestuderen op de lading endogene eiwitten. Later wordt immunofluorescentie microscopie uitgevoerd waarbij de getransfecteerde cellen gefixeerd en gekleurd met een antilichaam tegen het endogene kandidaat eiwit, gevolgd door een geschikt secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorescente kleurstof. In dit geval wordt de kandidaat endogene eiwit op het fysiologisch niveau bestudeerd. Vergelijkbare motorloze mutanten van andere motorische eiwitten kunnen worden bereid om hun lading te identificeren.

Protocol

1. Klonen van de tdTomato gelabeld wild-type en motorloze KIF5B Eiwitten

  1. Versterken de cDNA's voor het humane wildtype en motorless KIF5B eiwitten met de primers in tabel 1, Taq DNA polymerase (5 eenheden 100 ui), dNTP mix (2 mM elk deoxynucleotide) en de 10X buffer gedurende 30 cycli. Elke cyclus omvat een denaturatiestap (95 ° C gedurende 30 sec), een annealing stap (45 ° C gedurende 30 sec) en een extensie stap (72 ° C gedurende 3 min).
  2. Extraheer het geamplificeerde DNA product met een gelijk volume fenol / chloroform (1: 1).
    Let op: Fenol is brandbaar en kan brandwonden veroorzaken. Chloroform is gevaarlijk. Vermijd direct contact met hen en ze gebruiken onder een chemische dampkap. Alternatief kan PCR-producten worden gezuiverd door verscheidene kits.
    1. Spin bij 18.000 xg in een microcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Breng de waterige oplossing naar een nieuwe buis en extraheer met een gelijk volume chloroform.
    2. spinnenbij 18.000 xg in een microcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 0,5 min. Breng de waterige oplossing naar een nieuwe buis.
    3. Meng de waterige oplossing met een tiende volume van 3 M Na-acetaat en twee volumina absolute ethanol.
    4. Spin bij 18.000 xg in een microcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Gooi de waterige oplossing.
    5. Was de DNA pellet met twee volume van 75% ethanol. Gooi de waterige oplossing en de lucht drogen de DNA pellet bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Resuspendeer de DNA pellet in 34 ul water.
  3. Digest de geamplificeerde producten in een eindvolume van 40 pl met restrictie-enzymen SalI (10 eenheden) en BamHI (10 eenheden) en 4 ui van de 10X buffer bij 37 ° C gedurende twee uur. Scheid de verkregen produkten een agarose gel (1,0% bij 100 V) bevattende ethidiumbromide (0,2 ug / ml).
    Opmerking: Ethidiumbromide is een krachtige mutagene stof en kan worden geabsorbeerd door de huid. Daarom is het belangrijk om direct of indirect contact w voorkomenet ethidium bromide.
  4. Knip de juiste banden voor zuivering door kolommen. Weeg de agarose gel dat het DNA-fragment. los het dan in de oplosbuffer (300 gl 0,1 g) bij 37 ° C gedurende ongeveer 20 minuten.
  5. Voeg de resulterende oplossing aan een kolom en draaien in een microcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 5 sec. Gooi het doorstroomkanaal.
  6. Was de kolom met 0,5 ml solubilisatiebuffer uit waarbij de stap 1,5. Was de kolom opnieuw met 0,75 ml wasbuffer door het herhalen van de stap 1.5. Spin de kolom gedurende 2 minuten om zich te ontdoen van de resterende wasbuffer.
  7. Elueer het DNA-fragment met 50 ul water door het herhalen van stap 1.5. Schat de concentratie van het DNA-fragment door het uitvoeren van een hoeveelheid van het tegen een DNA size ladder in een agarose gel (1,0% bij 100 V) bevattende ethidiumbromide (0,2 ug / ml).
  8. Afbinden de gezuiverde producten (ongeveer 100 ng) met de ptdTomato-C1 vector 17 (ongeveer 100 ng) die eerder verteerd met the dezelfde restrictie-enzymen in 10 pi onder toepassing van T4 DNA ligase (2000 eenheden) en 1 pi 10X ligatiebuffer bij kamertemperatuur gedurende 16 uur.
    Opmerking: De wild-type en mutant motorless bevat aminozuren 2-963 en 584-963, respectievelijk. Voorheen werd een grotere motorless KIF5B mutant gebruikt om zijn functie 9 identificeren. Een kleinere motorless KIF5B mutant werd gebruikt voor deze studies zijn expressieniveaus verhogen.

2. immunofluorescentiemicroscopie

  1. Voor levende cellen of indirecte fluorescentie beeldvorming met vergroting op of onder 40X, zaad 0,2-0.300.000 HeLa-cellen in 1 ml compleet medium [Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS)] in elk putje van een zes-well plaat. Groeien bij 37 ° C met 5% CO2.
  2. Voor indirecte immunofluorescentie studies met vergrotingen boven 40X, wassen dekglaasjes (18 mm x 18 mm; 1,5 dikte) in absolute ethanol kort en air-droog ze inde putjes van een zes-well plaat, in een bioveiligheid kast om besmetting te voorkomen.
    1. Zaad 0,2-0.300.000 cellen in 1 ml compleet DMEM medium in elk putje van zes-putjes plaat.
  3. Bereiding van transfectie Complex
    1. De volgende dag in een bio kast Verdun 0,6 ug (totaal) van het expressieplasmide voor tdTomato-gelabeld wild-type of motorless KIF5B in aanwezigheid of afwezigheid van een expressieplasmide voor een lading kandidaat eiwit (pTagCFP-c-MYC 5 ) met 0,1 ml transfectie medium in een 1,6 ml microcentrifugebuis.
      Opmerking: De vector pTagCFP-c-MYC drukt de TagCFP-tag c-MYC.
    2. Voeg 1,8 gl van het transfectie reagens 0,1 ml transfectiemedium een ​​andere 1,6 ml microcentrifugebuis. Typisch, bereiden een master mix van verdunde transfectiereagens genoeg voor 12 monsters.
    3. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Voeg 0,1 ml van de verdunde transfectiereagens de verdunde 0,1 ml DNA. Mix de inhoud door het omkeren van de buizen. Spin de buizen gedurende 5 seconden in een microcentrifuge.
    5. Incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Wassen van Cellen
    1. Was de gezaaide cellen driemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende de incubatietijd voor de vorming van de transfectie complex.
    2. Vervang het medium van de geënte cellen in elk putje met 0,8 ml voorverwarmde transfectiemedium. Zet de platen in de incubator bij 37 ° C.
  5. Transfectie van cellen
    1. Na incubatie van 45 minuten, voeg 0,2 ml van de DNA / transfectiereagens complex (bereid in stap 2,3) toegevoegd aan elk putje van de plaat.
    2. Schommel de 6 wells plaat zachtjes gedurende 5 seconden, voordat ze worden teruggebracht naar de incubator bij 37 ° C.
    3. Na 6-8 uur, vervang het medium met de volledige DMEM medium.
  6. Voor live-cell fluorescentie beeldvorming 18
    1. Na nog eens 16 uur incubatie eent 37 ° C, voeg het DNA intercalerende Hoechst 33342 vlek aan het medium tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM.
      Opmerking: Hoechst 33342 is een cel-permeabele, DNA intercalerende kleurstof die de celkernen vlekken.
    2. Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 10 min in de incubator bij 37 ° C alvorens ze te bestuderen voor de expressie van fluorescerende eiwitten door fluorescentiemicroscopie met behulp van een 40X objectief. Het filter sets voor DAPI, GVB, FITC en Cy3 zijn (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) en (Ex545 nm / Em605 nm), respectievelijk.
      Let op: Als de achtergrond is hoog als gevolg van auto-fluorescentie van de volledige DMEM medium, wordt medium zonder fenolrood gebruikt.

3. Voor indirecte immunofluorescentie Studies

  1. Bereiding paraformaldehyde oplossing
    1. Weeg paraformaldehyde poeder (4 g per 100 ml PBS) en voeg deze toe aan PBS.
      Let op: Paraformaldehyde is een brandbare vaste stof en een mogelijke kanker Hazard. Het irriteert de ogen, de ademhalingswegen en de huid. Daarom is het belangrijk om contact met of inhalatie paraformaldehyde voorkomen.
    2. Voeg NaOH aan de oplossing (150 pi 10 N NaOH / 100 ml).
    3. Bewaar de oplossing bij 37-42 ° C gedurende 2-3 uur met af en toe schudden.
    4. Breng de pH op 7,0 door toevoeging van ijsazijn aan de oplossing (ongeveer 75 pl / 100 ml) na paraformaldehyde poeder wordt opgelost.
  2. Doeleiwitten kleuring
    1. Na verdere incubatie gedurende 16 uur bij 37 ° C, was de getransfecteerde cellen bij kamertemperatuur keer met PBS door zwenken de zes-well plaat gedurende 5 sec.
    2. Fixeer de cellen met 1 ml vers bereide 4% paraformaldehyde oplossing per well. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    3. Was de cellen met PBS eens door zwenken gedurende 5 sec de zes-well plaat. Gooi de oplossing.
    4. Incubeer de cellen met 1 ml 0,1% Triton X-100 (in PBS) bij kamertemperatuur gedurende 30 min. de detergent Triton X-100 wordt de celmembraan permeabel toegang van antilichamen om hun intracellulaire doelwitten mogelijk.
    5. Was de cellen met PBS viermaal door zwenken zes-well plaat gedurende 5 seconden per keer. Gooi de oplossing na elke wasbeurt.
    6. Incubeer de cellen met 1 ml primaire antilichamen (c-MYC konijn antilichaam of p53 muizenantilichaam; 0,1 ug / ml) in 10% FBS in PBS oplossing bij kamertemperatuur door tuimelen gedurende 4 uur.
    7. Was met PBS vier keer door zwenken de zes-well plaat gedurende 5 seconden per keer. Gooi de oplossing na elke wasbeurt.
    8. Incuberen met 1 ml van fluorescente kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen (Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijn of anti-muis IgG antilichaam; 0,5 ug / ml) in 10% FBS in PBS bij kamertemperatuur in het donker door tuimelen gedurende 2 uur.
    9. Was met PBS vier keer door zwenken de zes-well plaat gedurende 5 seconden per keer. Gooi de oplossing na elke wasbeurt.
  3. Nucleaire kleuring en Montage
    1. Incubeer de cellen met 1 ml DNA intercalerende kleurstof 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0,5 gg / ml) in PBS bij kamertemperatuur in het donker voor 10 min. Ga verder met stap 3.4 als er geen dekking glazen worden gebruikt.
      Opmerking: DAPI is een DNA intercalerende kleurstof die de celkernen vlekken.
    2. Toepassen 10 ul van bevestigingsoplossing op elk objectglaasje. Monteer elk deksel glas over de montage-oplossing op een microscoopglaasje.
    3. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker overnacht.
    4. Sluit de randen van het deksel glazen met nagellak. Plaats in het donker in een zuurkast 's nachts naar de nagellak dampen te verwijderen.
  4. Fluorescentiemicroscopie 19
    1. De volgende dag, onderzoekt de cellen door fluorescentiemicroscopie met behulp van een 40X objectief. Het filter sets voor DAPI, GVB, FITC en Cy3 zijn (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) en (Ex545 nm / Em605 nm), respectievelijk.

Resultaten

Exogeen uitgedrukt wildtype KIF5B verscheen homogeen in het cytoplasma, terwijl c-MYC voornamelijk verscheen in de nucleus (figuur 1A). De motorloze KIF5B mutant gevormde aggregaten in het cytoplasma (Figuur 1A). Aggregatie van de motorloze KIF5B veroorzaakte de aggregatie van c-MYC. Het percentage cellen die geaggregeerd TagCFP gemerkte c-MYC in de cellen die wildtype KIF5B laag was. Het was echter significant hoger wanneer de motorloze KIF5B werd mede tot expressie gebracht (Figuur 1A). De waargenomen co-lokalisatie van mutante KIF5B met c-MYC (Figuur 1) suggereert dat KIF5B regelt de subcellulaire localisatie van c-myc en c-MYC is een lading van kinesine-1. Negatieve controles waarin alleen constructen werden tot expressie gebracht worden in het onderste paneel van Figuur 1A. De resultaten tonen dat er geen significante doorbloedingen fluorescentie EMISSIESn. De motorless KIF5B ook geïnduceerde aggregatie van het endogene c-MYC (Figuur 1B) en de transcriptiefactor p53 (Figuur 2), wat aangeeft dat c-MYC en p53 zijn zowel de ladingen van kinesine-1 en KIF5B regelt de subcellulaire lokalisatie van beide endogene eiwitten. Samen met de resultaten die de kinesine-1 remmer Bengaals lacton (RBL) 20 induceert vorming van hoog molecuulgewicht voor zowel c-MYC en p53 5, p53 waarschijnlijk een lading van kinesine-1. Het is interessant dat de nucleaire transcriptiefactor p53, zoals c-MYC, ook die uit de kern naar het cytoplasma voor proteasomale afbraak 21,22. De beweging van transcriptiefactoren door KIF5B lijkt specifiek te zijn omdat de expressie van de mutant motorloze KIF5B beïnvloedde de subcellulaire lokalisatie c-Fos of te doen aggregeren (figuur 3). De bovenstaande gegevens tonen dat de method werkzaam in deze publicatie maakt het mogelijk om hoge specificiteit identificatie van kinesine-1 ladingen. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast op andere motor eiwitten ook.

figure-results-1
Figuur 1: Expressie van de motorloze KIF5B mutant induceert c-MYC aggregatie in het cytoplasma (A) HeLa-cellen werden getransfecteerd met tdTomato-gelabeld wild-type (WT) KIF5B (rood) en TagCFP gemerkte c-MYC (blauw).. tdTomato gemerkte WT KIF5B verscheen voornamelijk in het cytoplasma, terwijl TagCFP gemerkte c-MYC verscheen voornamelijk in de kern. Echter, de tdTomato-tag motorloze KIF5B mutant (rood) gevormd draadvormige of puntvormige aggregaten in het cytoplasma. Expressie van de motorloze KIF5B veroorzaakte de aggregatie van c-MYC. De mutant KIF5B en c-MYC co-gelokaliseerde samen (pink). Percentages van cellen (%) aangeeft aggregaten CFP-c-MYC (%) getoond. De resultaten worden weergegeven alsgemiddelde ± SD (N = 3). Negatieve controles met expressie van tdTomato-gemerkte eiwitten of KIF5B TagCFP gemerkte c-MYC met lege vectoren (V) wordt in het onderste paneel. (B) Vergelijkbare resultaten werden verkregen met het endogene c-MYC (groen) wanneer tdTomato gemerkte WT of motorless KIF5B eiwitten (rood) hadden. De tdTomato gemerkte motorless KIF5B mutant gevormde aggregaten in het cytoplasma en geïnduceerde aggregatie van het endogene c-MYC. Beide soorten aggregaten gecolokaliseerd samen in het cytoplasma (oranje). De kernen werden gekleurd met de kleurstof Hoechst 33342 of DAPI. Schaalbalk; 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Expressie van de motorloze KIF5B mutant induceert endogene p53 aggregatie in tHij cytoplasma. In HeLa-cellen, exogene-tdTomato gelabeld wild-type (WT) KIF5B (rood) verscheen voornamelijk in het cytoplasma, terwijl de endogene p53 (groen) verscheen voornamelijk in de kern. In tegenstelling, de tdTomato gemerkte motorless KIF5B mutant (rood) gevormde aggregaten in het cytoplasma. Expressie van de motorloze KIF5B geïnduceerde aggregatie van p53, wat resulteert in de co-lokalisatie van KIF5B en p53 in het cytoplasma (geel). Het experiment werd driemaal uitgevoerd. De kernen werden gekleurd met de kleurstof DAPI. Schaalbalk; 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3:. Expressie van de motorloze KIF5B mutant niet aggregatie van c-Fos induceren in het cytoplasma tdTomato-gelabeld wild-type (WT) KIF5B (rood) verschenenvoornamelijk in het cytoplasma van HeLa-cellen, terwijl EGFP-c-Fos (groen) verscheen voornamelijk in de kern. Integendeel, de tdTomato gemerkte motorless KIF5B mutant (rood) gevormde aggregaten in het cytoplasma. Expressie van de motorloze KIF5B heeft de aggregatie van c-Fos opwekken. Het experiment werd vier maal uitgevoerd. De kernen van de cellen werden gekleurd met de kleurstof DAPI. Schaalbalk; 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

gemeenschappelijke reverse primer 5'-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 '
wild-type KIF5B voorwaartse primer AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT 5'-3 '
motorloze KIF5B voorwaartse primer AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC 5'-3 '

Tabel 1: Primer sequenties voor het klonen van de wild-type en motorloze KIF5B eiwitten.

Discussie

De beschreven werkwijze maakt gebruik van de eigenschappen van de motorloze KIF5B mutant die het vermogen om te bewegen langs de microtubules mist, maar het vermogen behoudt om dimeren met het wildtype KIF5B vormen en daardoor kan de tetramere eiwitten te interageren met dezelfde lading eiwitten als de wild-type KIF5B. Motorloze KIF5B daarom fungeert als een dominant negatieve mutant en formulieren mislocalized aggregaten met zijn lading. Deze methode is bewezen dat de kinesine-1 lading c-MYC identificeren (Figuur 1) 5. In dit artikel werd dezelfde motorloze KIF5B mutant gebruikt om p53 te identificeren als een potentiële lading van kinesine-1 (Figuur 2). Hieruit blijkt dat de methode haalbaar om andere ladingen identificeren van kinesine-1. Bovendien wordt de specificiteit van de mutant door het ontbreken van een effect van de mutant op de negatieve controle-eiwit c-Fos (figuur 3).

In dit protocol, de tdTomato-gelabeld wild-type of motorless KIF5B eiwit tezamen tot expressie gebracht met een ander fluorescent eiwit gelabeld kandidaat lading eiwit. In dit geval, levende cellen fluorescentie microscopie en imaging worden uitgevoerd. De vorming van de aggregaten kunnen worden opgespoord door time-lapse imaging. Als alternatief wordt het tdTomato-gelabeld eiwit alleen tot expressie gebracht en de kandidaat lading eiwit op de fysiologische niveaus wordt gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie microscopie met behulp van specifieke antilichamen. De fluorescerende eiwit tdTomato gekozen voor de helderheid en fotostabiliteit 17. Als de achtergrond is hoog als gevolg van auto-fluorescentie van de volledige DMEM medium, wordt medium zonder fenolrood gebruikt.

De motorloze KIF5B mutant vormt dimeren met het wild-type KIF5B stoichiometrisch. Daarom is het essentieel om voldoende motorless KIF5B mutant tot expressie dimeren met de wildtype tegenhanger vormen om de functie te remmen en aggregaten. Om dit probleem aan te pakken, optimalisatie van de exprsessieschijven van de motorloze mutant essentieel. Het wordt bereikt door een kleine motorless mutant die de dimerisatie domein. Bovendien, optimalisatie van de geschikte transfectiereagens en protocol is ook noodzakelijk. De duur van incubatie van HeLa cellen met het DNA / transfectiereagens werd geoptimaliseerd in HeLa cellen voor expressie van exogene eiwitten en cellevensvatbaarheid. De incubatieduur kan moeten worden geoptimaliseerd voor andere cellijnen.

Voor vergrotingen tussen 4X 40X, zijn geen dekking bril nodig. Cellen kunnen direct worden onderzocht in de putjes. Derhalve, in dit geval, het protocol is goedkoop en gemakkelijk. Voor vergrotingen boven 40X worden cellen gekweekt op dekglaasjes in de putten en na kleuring, worden op microscoop dia's voor onderzoek op grond van olie-immersie doelstellingen bevestigd.

Observatie van aggregaten van de motorloze KIF5B eiwit wordt beperkt door de grootte van het cytoplasma. Het is gemakkelijk om de sporenaggregaten in verschillende zoogdiercellen. Echter, is het relatief moeilijk om de aggregaten in neuronale cellen nemen wanneer het volume van het cytoplasma klein rond de kernen en in neurieten.

Het protocol wordt gebruikt om de associatie tussen KIF5B en ladingen naast de in vivo gist twee-hybride en biochemische pull-down assays 13-16 tonen. Al deze tests bepalen de vereniging onder verschillende fysieke omstandigheden en de resultaten daarvan kunnen elkaar aanvullen. Bovendien is het voordeel van deze fluorescentiebepaling boven andere assays is dat de regeling van subcellulaire lokalisatie van de ladingen door KIF5B aantonen (figuren 1 en 2).

Het protocol is niet beperkt tot KIF5B en kan worden gebruikt om ladingen van andere auto eiwitten, te identificeren zoals sommige andere kinesine motoren 3 en sommige van de myosine motoren 23,24 gebruikt bij intracellulair transport van ladingen 3. Deze motor-eiwitten bevatten ook motor domeinen voor beweging langs microtubuli voor kinesine motoren en microfilamenten voor myosine motoren, en opgerold-coil segmenten voor oligomerisatie. Meeste vormen homodimeren 3,23. Daarom kan een soortgelijke strategie te worden aangebracht door het creëren van hun motorless dominant negatieve mutanten hun ladingen identificeren.

Openbaarmakingen

Gratis toegang tot de publicatie en de productie van dit artikel wordt betaald door Roche.

Dankbetuigingen

Roche's Publication Grant dekte de publicatie en productie van de gratis toegang tot dit artikel. De auteur bedankt ook E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip en Sol D. Gloria voor hun steun en kritische lezing van het manuscript.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
absolute ethanol (200 proof)Fisher ScientificBP2818
DAPISigma-AldrichD9542
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Opti-MEM-I (transfectiemedium)Life Technologies51985
ProLong Diamond Antifade MountantLife TechnologiesP36961
formaldehyde, paraFisher ScientificO4042-500
Triton-X100Fisher ScientificBP151-500
X-tremeGENE 9 DNA Transfectie ReagensRoche6365787001
Taq DNA polymeraseLife Technologies10342020
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)Roche12111424
Microscoop dekglasFisher Scientific12-541A
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladderLife TechnologiesSM1333
PureLink Quick Gel Extractie kitLife TechnologiesK210012
BamHINew England BiolabR0136
SalINew England BiolabR0138
T4 DNA ligase New England BiolabM0202T
EthidiumbromideThermo Scientific17898
DMEMLife Technologies11995-065
c-MYC konijnenantilichaamCell Signaling5606
p53 muisantilichaamSanta Cruzsc-126
Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijn IgG antilichaamLife TechnologiesA11008
Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-muis IgG antilichaamLife TechnologiesA11059
fluorescente microscoop Olympus IX71_Fluoview
computersoftware voor beeldvorming cellSens 

Referenties

  1. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
  2. Yu, Y., Feng, Y. M. The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy. Cancer. 116, 5150-5160 (2010).
  3. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).
  4. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  5. Lee, C. M. Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm. Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).
  6. Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles. Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).
  7. Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1. J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).
  8. Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules. Biol Cell. 106, 57-71 (2014).
  9. Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels. Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).
  10. Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3. Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).
  11. Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments. Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).
  12. Zadeh, A. D., et al. Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel. J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).
  13. Su, Y. Y., et al. KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8. J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).
  14. Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B. . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).
  15. Cho, K. I., et al. Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function. Traffic. 8, 1722-1735 (2007).
  16. Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B. Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).
  17. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
  18. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).
  19. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).
  20. Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening. Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).
  21. Zhang, Y., Xiong, Y. Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF. Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).
  22. Michael, D., Oren, M. The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system. Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).
  23. Kneussel, M., Wagner, W. Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics. Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).
  24. Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells. J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Motorloze KIF5B mutanttdTomato labelinglive cell imagingindirecte immunofluorescentiec MYC aggregatiep53 lokalisatiedominant negatieve mutantmoleculaire motoren

Gerelateerde artikelen