Methodenartikel

Flow-patroon Begeleide Fabrication van High-density Barcode Antibody Microarray

DOI:

10.3791/53644

⸱

6 januari 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een grootschalige multiplex tweedimensionale DNA of antilichaam-array, met potentiële toepassingen in cell signaling studies en biomarker detectie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichaammicroarray als een goed ontwikkelde technologie wordt momenteel uitgedaagd door een paar andere gevestigde of opkomende hoogdoorvoertechnologieën. In dit rapport renoveren we de antilichaammicroarraytechnologie door gebruik te maken van een nieuwe aanpak voor fabricage en door nieuwe functies te introduceren. De fabricage van onze hoog-densiteitsantilichaammicroarray wordt bereikt door middel van loodrecht georiënteerd stroompatronering van enkelstrengs DNA's en daaropvolgende conversie gemedieerd door DNA-antilichaam-conjugaten. Dit protocol beschrijft de kritieke stappen in stroompatronering van DNA, het produceren en zuiveren van DNA-antilichaam-conjugaten, en het beoordelen van de kwaliteit van de gefabriceerde microarray. De uniformiteit en gevoeligheid zijn vergelijkbaar met conventionele microarrays, terwijl onze microarrayfabricage niet de hulp van een arrayprinter vereist en kan worden uitgevoerd in de meeste onderzoekslaboratoria. Het andere grote voordeel is dat de grootte van onze microarray-eenheden 10 keer kleiner is dan die van bedrukte arrays, wat de unieke mogelijkheid biedt om functionele eiwitten van enkele cellen te analyseren wanneer geïnterfacet met generieke microchipontwerpen. Deze barcodetechnologie kan breed worden toegepast in biomarkerdetectie, celsignaleringsstudies, weefselengineering en een verscheidenheid aan klinische toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichaam microarrays zijn op grote schaal gebruikt in proteomics studies decennia de aanwezigheid van gerichte eiwitten, waaronder eiwitten biomarkers 1-3 onderzocht. Hoewel dit gebied die momenteel wordt geconfronteerd met grote uitdagingen van andere high-throughput technologieën zoals massaspectrometrie (MS), is er nog voldoende ruimte voor het nut van antilichaam microarrays, vooral omdat deze apparaten veroorloven eenvoudige interpretatie van de gegevens en gemakkelijke interface met andere testen. De afgelopen jaren is de integratie van microarrays in microchip scaffolds mits het antilichaam microarray een nieuwe kans te gedijen 4-7. Zo....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Let op: Verschillende chemicaliën die worden gebruikt in dit protocol zijn irriterend en zijn gevaarlijk in geval van contact met de huid. Raadplegen veiligheidsinformatiebladen (VIB) en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen voordat dit protocol. Piranha oplossing die in stap (1.1.1) is zeer corrosief en worden bereid door het peroxide langzaam het zuur onder roeren. Handvat deze oplossing met uiterste voorzichtigheid in een zuurkast. Gebruik de juiste oogbescherming en zuurbestendige handschoenen. Trimethylchloorsilaan (TMCS) is een bijtende, ontvlambare chemische gebruikt in een optionele stap na (1.1.6). Verwerken deze chemische stof in een zuurkast. <....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwerpen voor de PDMS mallen (figuur 1A-1B) werden getekend met behulp van een CAD-programma (AutoCAD). Twee ontwerpen getoond functie kanalen voor doorstroming patronen, een horizontale en een verticale. De links en rechts delen van elk ontwerp zijn symmetrisch; een van hen zou kunnen zijn inlaten of uitlaten. Elk van 20 kanalen wikkelen van één uiteinde tot aan het andere uiteinde. Elk ontwerp wordt gedrukt op een chromen fotomasker (figuur 1C). De.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stromingspatroon ontwerp is de eerste cruciale stap in het vervaardigen van de 2-D microarray. Twee overlappende DNA patronen op een glassubstraat te genereren, moet het kanaal kenmerken van het eerste ontwerp loodrecht op die van de tweede (Figuur 1A-B) zijn. De ontwerpen ook rekening met de downstream-toepassingen van de microarray. Bij enkele cel analyse wordt de microarray gebruikt om eiwitten van enkelvoudige cellen ingesloten in microkamers detecteren daarom kanaal afmetingen verenigbaar .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de startup-fondsen van SUNY Albany en de toegang tot de faciliteiten van het University at Albany Cancer Research Center graag erkennen.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sylgard 184 silicone elastomer baseDow Corning3097366-1004
Sylgard 184 silicone elastomer curing agentDow Corning3097358-1004
SU-8 2025 fotoresistMicroChemY111069
Siliconen wafers University Wafers452
Poly-L-lysine gecoate glazen plaatjesThermo ScientificC40-5257-M20
OligonucleotidenIntegrated DNA Technologies*Op maat besteld bij Integrated DNA Technologies, zie Tabel 2.
Poly-L-lysine kleefstof stockoplossingNewcomer Supply1339
Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat  (BS3)Thermo Scientific21585
1x Fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4Quality Biological114-058-101
Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) SysteemGE (Amersham Pharmacia) 18-1112-41
Superose 6 10/300 GL kolomGE Healthcare Life Sciences17-5172-01
Capture antilichamendiversendiversen*De antilichaam selectie is afhankelijk van de toepassing
Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)SolulinkS-1002
Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)SolulinkS-1004
N,N-dimethylformamideSigma-Aldrich227056
Citroenzuur, watervrijAcros42356
NatriumhydroxideFisher ScientificS318
Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCOEMD MilliporeUFC201024
Spin coaterLaurell TechnologiesWS-650-MZ
Biopsie punch met plunjer (1,0 mm diameter)Ted Pella, Inc.15110-10
Diamant graveerstift (Style 60)SPI supplies6004
TrimethylchlorosilaanSigma Aldrich92361

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
  2. Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
  3. Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Ya....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flow PatterningAntibody MicroarrayDNA Antibody ConjugatesPDMS Mold FabricationSingle Cell AnalysisSU 8 MasterPerpendicular Flow PatternMicroarray ValidationBiomarker DetectionCell Signaling Studies

Gerelateerde artikelen