Methodenartikel

Flow-patroon Begeleide Fabrication van High-density Barcode Antibody Microarray

DOI:

10.3791/53644

⸱

6 januari 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een grootschalige multiplex tweedimensionale DNA of antilichaam-array, met potentiële toepassingen in cell signaling studies en biomarker detectie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichaammicroarray als een goed ontwikkelde technologie wordt momenteel uitgedaagd door een paar andere gevestigde of opkomende hoogdoorvoertechnologieën. In dit rapport renoveren we de antilichaammicroarraytechnologie door gebruik te maken van een nieuwe aanpak voor fabricage en door nieuwe functies te introduceren. De fabricage van onze hoog-densiteitsantilichaammicroarray wordt bereikt door middel van loodrecht georiënteerd stroompatronering van enkelstrengs DNA's en daaropvolgende conversie gemedieerd door DNA-antilichaam-conjugaten. Dit protocol beschrijft de kritieke stappen in stroompatronering van DNA, het produceren en zuiveren van DNA-antilichaam-conjugaten, en het beoordelen van de kwaliteit van de gefabriceerde microarray. De uniformiteit en gevoeligheid zijn vergelijkbaar met conventionele microarrays, terwijl onze microarrayfabricage niet de hulp van een arrayprinter vereist en kan worden uitgevoerd in de meeste onderzoekslaboratoria. Het andere grote voordeel is dat de grootte van onze microarray-eenheden 10 keer kleiner is dan die van bedrukte arrays, wat de unieke mogelijkheid biedt om functionele eiwitten van enkele cellen te analyseren wanneer geïnterfacet met generieke microchipontwerpen. Deze barcodetechnologie kan breed worden toegepast in biomarkerdetectie, celsignaleringsstudies, weefselengineering en een verscheidenheid aan klinische toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichaam microarrays zijn op grote schaal gebruikt in proteomics studies decennia de aanwezigheid van gerichte eiwitten, waaronder eiwitten biomarkers 1-3 onderzocht. Hoewel dit gebied die momenteel wordt geconfronteerd met grote uitdagingen van andere high-throughput technologieën zoals massaspectrometrie (MS), is er nog voldoende ruimte voor het nut van antilichaam microarrays, vooral omdat deze apparaten veroorloven eenvoudige interpretatie van de gegevens en gemakkelijke interface met andere testen. De afgelopen jaren is de integratie van microarrays in microchip scaffolds mits het antilichaam microarray een nieuwe kans te gedijen 4-7. Zo heeft de barcode microarray geïntegreerd in een single-cell chip is gebruikt in mobiele communicatie studies 8,9. Deze technologie heeft onderscheidende voordelen boven andere beschikbare microarray technologie. Het beschikt arrayelementen op 10-100 um, veel kleiner dan de typische 150 urn size in gebruikelijke microarray elements. De constructie van kleinere arrayelementen wordt bereikt door systematisch flow patronen benaderingen, en dit geeft aanleiding tot compact microarrays die eencellige uitgescheiden eiwitten en intracellulaire eiwitten kan detecteren. Een ander voordeel is het gebruik van een eenvoudige, instrument set-up. Dit is vooral belangrijk, omdat de meeste laboratoria en kleine bedrijven kunnen niet in staat zijn om toegang te krijgen tot microarray kernfaciliteiten. Dergelijke barcode antilichaam microarrays uitgevoerd met verbeterde doorvoer assay en kunnen worden gebruikt om zeer multiplex assays op enkele cellen terwijl het bereiken van een hoge gevoeligheid en specificiteit vergelijkbaar met die van conventionele sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA 8). Deze technologie heeft talrijke toepassingen gevonden in het opsporen van eiwitten uit glioblastoma 9-11, T-cellen 12 en circulerende tumorcellen 13. Als alternatief, barcode DNA microarrays alleen zijn gebruikt in de nauwkeurige positionering van neuronen en astrocyten voor nabootsening de in vivo assemblage van hersenweefsel 14.

Dit protocol alleen gericht op de experimentele stappen en opbouw blokken van de tweedimensionale (2D) streepjescode antilichaam microarray die potentiële toepassingen bij de detectie van biomarkers in vloeibare monsters heeft en in enkele cellen. De technologie is gebaseerd op adresseerbare enkelstrengig, eendimensionale (1-D) DNA microarray geconstrueerd met oligonucleotiden die orthogonaal ruimtelijk patroon op glassubstraten. De 1-D wordt gevormd als evenwijdige stromingskanalen worden toegepast in de stroom-patroonvormingsstap en dergelijk patroon weergegeven als discrete banden visueel vergelijkbaar 1-D Universal Product Code (UPC) barcodes. De constructie van een 2-D (n x m) antilichaam matrix - doet denken aan een 2-D Quick Response (QR) matrixcode - dient complexer patroon strategieën, maar maakt de immobilisatie van antilichamen met een hogere dichtheid 8,15. De fabricagevereist twee DNA patroonvormende stappen, de eerste patroon loodrecht op de tweede. De snijpunten van deze twee patronen vormen de n x m elementen van de array. Door strategische keuze van de reeksen van enkelstrengs DNA (ssDNA) gebruikt in flow-patroonvorming, is elk element in een bepaalde rij een specifiek adres toegewezen. Deze ruimtelijke referentie is noodzakelijk onderscheid tussen fluorescentiesignalen op de microarray dia. De ssDNA matrix wordt omgezet in een antilichaam matrix door de integratie van complementaire DNA-antilichaam conjugaten, waarbij een platform genaamd DNA gecodeerde bibliotheek antilichaam (DEAL 16).

Deze video protocol beschrijft de belangrijkste stappen in het creëren van nxm antilichaam-arrays, die onder meer het opstellen van polydimethylsiloxaan (PDMS) barcode mallen, stroom-patroonvorming ssDNA in twee oriëntaties, het voorbereiden van antilichaam-oligonucleotide DEAL conjugaten, en het omzetten van de 3 x 3 DNA-array in een 3x 3 antilichaam array.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Let op: Verschillende chemicaliën die worden gebruikt in dit protocol zijn irriterend en zijn gevaarlijk in geval van contact met de huid. Raadplegen veiligheidsinformatiebladen (VIB) en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen voordat dit protocol. Piranha oplossing die in stap (1.1.1) is zeer corrosief en worden bereid door het peroxide langzaam het zuur onder roeren. Handvat deze oplossing met uiterste voorzichtigheid in een zuurkast. Gebruik de juiste oogbescherming en zuurbestendige handschoenen. Trimethylchloorsilaan (TMCS) is een bijtende, ontvlambare chemische gebruikt in een optionele stap na (1.1.6). Verwerken deze chemische stof in een zuurkast.

Opmerking: Voer de barcode slide fabricage en kritische stroomwerkwijzen-patroon in een schone ruimte van verontreiniging door zwevende deeltjes te minimaliseren. Stofdeeltjes kunnen de havens en microkanalen van PDMS mallen blokkeren en interfereren met de stroom-patronen.

1. De bouw van de One-dimensiol DNA Barcode Slide

  1. Voorbereiding van de SU-8 meester voor de barcode stromingspatronen
    NB: De tekeningen voor de loodrechte stromingspatronen (Figuur 1A-B) worden gemaakt met behulp van een computer-aided design (CAD) software. Deze patronen worden weergegeven op een chromen fotomasker. Transparante gebieden van het masker overeenkomen met de kenmerken van de SU-8 meester.
    1. Schoon een siliciumwafel (100 mm diameter) in een grondig mengsel van 3 H 2 SO 4: 1 30% H 2 O 2 (piranha-oplossing) verhit tot 96 ° C. Was de wafer met gedeïoniseerd water en isopropylalcohol, gevolgd door drogen met stikstof blaaspistool.
    2. Giet ongeveer 4 ml SU-8 2025 fotolak van de wafel. Gebruik een programmeerbare spin coater om uniform over de fotoresist op de wafel voor 10 sec bij 500 tpm, vervolgens 30 seconden bij 3000 tpm. Hierdoor ontstaat een fotolaklaag met een dikte van ~ 25 urn. Geleidelijk toestaan ​​spinnen te vertragen voor het stoppen - dit is bij Maintain een gelijkmatige bekleding op het oppervlak van de wafer.
    3. Bak de beklede wafer op een kookplaat gedurende 1 min bij 65 ° C, vervolgens gedurende 5 min bij 95 ° C. Deze stap maakt de coating te stollen. Koel af tot kamertemperatuur 5 min.
    4. Plaats het chroom masker (figuur 1C) van de fotoresist bekleding. Expose het masker mogelijkheden tot bijna-UV-licht (350-400 nm, belichtingsenergie 150-160 mJ / cm2) gedurende 20 sec.
      Opmerking: Het ontwerp op de chromen masker bevat 20 kanalen, die elk zijn 20 micrometer breed met 50 um toonhoogte. De kanalen worden wikkeling van het ene uiteinde van de patroon naar de andere kant. Alles bij elkaar de 20 kanalen omvatten een rechthoek met een lengte van ~ 40 mm en een breedte van ~ 20 mm. Elk kanaal wordt geflankeerd door twee cirkelvormige elementen die overeenkomen met een inlaat en een uitlaat. In- en uitgangen zijn onderling uitwisselbaar.
    5. Bak de belichte wafer op een verwarmingsplaat gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Koel geleidelijk KT.
    6. Dompel de wafer in SU-8 developer met agitatiegedurende 5 min. Was de wafer met een kleine portie verse SU-8 ontwikkelaar, gevolgd door isopropylalcohol. Drogen van de wafel met een stikstof blaaspistool. Hard-bak de wafer op 200 ° C gedurende 30 min verwarmingsplaat en laat de wafer geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur.
      Opmerking: Ontwikkeling kan worden verricht voor een langere tijd worden uitgevoerd als een witte film wordt waargenomen na het wassen in deze stap.
      Optioneel: silaniseren de SU-8 meester door blootstelling aan damp trimethylchloorsilaan in een afgesloten petrischaal gedurende 10 min.
  2. Voorbereiding van de PDMS barcode mal
    1. Combineer 40,0 g siliconenelastomeer basis met 4,0 g verharder. Roer het prepolymeer mengsel krachtig gedurende 10 min. Ontgas gedurende 20 min onder vacuum.
      Let op: Als algemene regel, gebruik maken van een 10: 1 (basis: verharder) massaverhouding.
    2. Giet het prepolymeer in een petrischaal met een silicium wafer met de SU-8 meester van de barcode patroon. De hoogte van het PDMS mengsel moet ongeveer 7,5 mm of meer zijn. Ontgas het mengsel in de Petri schotel voor een tweede keer om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen, daarna bakken het mengsel gedurende 1 uur bij 75 ° C om PDMS uitharden.
      Opmerking: Het is belangrijk om voldoende dikte van de plaat PDMS handhaven op ~ 7,5 mm of hoger voorkomen toevoegen van te veel spanning op de PDMS-glas binding bij het inbrengen van pennen / buizen door gaten in de PDMS mal in stap (1.3.3.1)
    3. Met behulp van een scalpel, zorgvuldig snijd rond het gebied van de PDMS plaat dat de barcode mal functies bevat en schil de plaat van de wafel.
    4. Maak de randen van de plaat met de gewenste vorm van de barcode PDMS mal bereiken. Punch 20 holes (1.0-mm diameter) door de mal met behulp van een biopsie punch met plunjer. Zorg ervoor dat de gaten zijn uitgelijnd met de cirkelvormige kenmerken van de barcode patroon. Deze gaten dienen als de in- en uitlaten.
  3. Eén-dimensionale patronen van poly-L-lysine (PLL)
    1. Verwijder alle stof op het oppervlak van een poly-L-lysine beklede glazen dia via een stikstof- blaaspistool. Attach de PDMS mal om de schone glasplaatje. Ervoor zorgen dat de randen van de matrijs en de schuif zijn uitgelijnd.
    2. Bak gedurende 1,5 uur bij 75 ° C om de binding tussen de PDMS mal en de PLL-beklede slide versterken. Bereid ondertussen 20 stukken flexibele polyethyleen buis (3- tot 4-inch stukken met een binnendiameter van 0,5 mm en een buitendiameter van 1,5 mm).
      Opmerking: Het aantal buisstukken overeen met het aantal inlaten in het PDMS barcode mal. De buis dient voor het koppelen van de kanalen op de barcode PDMS mal om een ​​stikstofgas tank voorzien van een drukregelaar.
    3. Aan één uiteinde van elk stuk buis, voeg een roestvrijstalen holle pen (1 mm diameter). Zuig steriel gefiltreerd poly-L-lysine oplossing door de pen, tot ten minste 1 cm van de slang wordt gevuld met de oplossing.
      1. Bevestig de pinnen (aangesloten op-oplossing gevulde buizen) aan de inlaten van de PDMS barcode mal (figuur 1E). Het andere uiteinde van de buizeneen druk geregelde stikstof tank set-up. Laat de oplossing door de mal met behulp van een drukgebied van 0,5-1 psi gedurende tenminste 6 uur.
        Opmerking: Zie stap (1.3.3) voor alle stroom-patronen procedures.
  4. Eén-dimensionale patronen van ssDNA 14
    Opmerking: De fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die in latere stappen wordt bereid uit 137 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4 en 2 mM KH 2PO 4. De pH van de buffer is 7,4.
    1. Bereid 2 mM bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) oplossing in PBS. Bereid 300 uM oplossingen A, B en C ssDNA (5'-amine gemodificeerde, 80 nucleotiden) in PBS of ultrazuiver water.
      Opmerking: Gebruik de BS3 oplossing binnen ongeveer 30 minuten na de bereiding omdat de N-hydroxysuccinimide ester gemakkelijk ondergaat hydrolyse.
    2. Combineer 2,5 pl 300 pM A, B of C ssDNA met 2,5 pi 2 mM bis (sulfosuccinimidyl) suberaat in PBS voor elk kanaal. A, B en C DNA wordt aangeduid kanalen 1, 2 en 3, respectievelijk. Deze volgorde wordt ook toegepast op de resterende sets van 3 kanalen (Figuur 2A).
    3. Voer stap (1.3.3). Deze keer, zuig het 5-ul BS3 / DNA-oplossingen door middel van roestvrij stalen pennen en in de polyethyleen buis, dan stel de PDMS mal om de stikstof bron. Laat de BS3 / DNA oplossing door de barcode matrijs gedurende ongeveer 40 minuten of totdat de kanalen worden gevuld.
    4. De stroom stoppen zodra alle kanalen zijn gevuld, dan incubeer de BS3 / DNA-oplossing in de barcode bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Sta niet toe dat de oplossing te drogen. Bak de PDMS mal met bijgevoegde barcode glijbaan voor 1 uur bij 75 ° C.
      Opmerking: Om de afstelling in de daaropvolgende doorstroming patroonvormende stappen te vergemakkelijken, kunnen de randen van het kanaal patroon op de barcode dia worden geschetst. Dit gebeurt door voorzichtig krassen glazen oppervlak met diamant Scribe uitlijning markers genereren aan de onderzijde van het glaasje. Alignment in latere fasen van het protocol kan worden gecontroleerd onder een microscoop.
    5. Verwijder de PDMS mal van de barcode dia. Was de dia voorzichtig met 0,01% SDS keer en drie keer met ultrapuur water.
      1. Droog de barcode dia met behulp van een microscoop dia spinner. Bewaar de barcode dia in een schone 50 ml centrifugebuis voor later gebruik.

2. Validatie van de One-dimensionale patroon op de Barcode Slide

Opmerking: Deze valideringsprotocol kan ook worden aangepast voor toepassing bij het beoordelen van de kwaliteit van de daaropvolgende stroming patroonvorming stappen.

  1. Het blokkeren van de schuif
    1. Bereid 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS. Filter deze oplossing door een 0,45 pm spuitfilter voor gebruik. Met behulp van een gel-lading-punt toepassing 50 ui 1% BSA oplossing ene rand van de barcode dia.
    2. Incubeer de 1% BSA solution gedurende 1 uur bij KT.
  2. Incubatie met Cyanine 3 (Cy3) geconjugeerd complementair DNA
    1. Bereid een cocktail van A ', B' en C 'oligonucleotiden Cy3 geconjugeerd aan één uiteinde. De sequenties van A ', B' en C 'zijn complementair aan die van de A, B en C, respectievelijk. De werkconcentratie van de Cy3-DNA 0,05 uM in 0,1% BSA.
    2. Verwijder de BSA oplossing van de glijbaan door pipetteren, breng 30 pl van de cocktail DNA-oplossing op dezelfde rand van de schuif. Incubeer de Cy3-DNA cocktail op de glijbaan bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Voer deze incubatie stap in het donker naar de Cy3 groep te beschermen tegen fotobleken.
  3. Analyse van fluorescentie-intensiteit
    1. Pipet de Cy3-DNA-cocktail en was de glijbaan in 1% BSA, PBS, en tenslotte in verdunde PBS (1 part PBS met 50 delen ultrapuur water). Droog de dia met een spinner.
    2. Let op de fluorescentie (Figuur 2B) met een fluorescentiemicroscoop of een microarray scanner. Bij gebruik van een microarray scanner, de laser emissie golflengte 532 nm, de pixelgrootte van 5 micron, fotomultiplicatorbuis (PMT) versterking bij 450 en vermogen bij 15%.

3. Fabricage van de 2-dimensionale (3x3) DNA Array 14

  1. Voorbereiding van de PDMS barcode mal
    1. Voer procedure (1,1) naar een andere SU-8 meester te construeren, maar deze keer gebruik een chroommasker met een stromingspatroon loodrecht op die van het eerste ontwerp. Voeren procedure (1.2) om een ​​nieuwe PDMS mal te bouwen met de loodrechte patroon.
  2. Tweedimensionale stroom patroonvorming van ssDNA
    1. Voor een 3 x 3 matrix, bereiden 150 uM voorraad oplossingen van A'-i, B'-ii, C'-iii, A'-iv, B'-v, C'-vi, A'-vii, B'-viii en C'-ix DNA in 3% BSA / PBS. Deze oligonucleotiden dienen als "overbruggende reeksen" (Figuur 2A). Combineer de oligonucleotide oplossingen (oplossingen 1-3) zodanig dat de werkende concentratie 50 pM per oligonucleotide. Gebruik de geleider verschaft in Tabel 1.
    2. Flow 3% BSA / PBS blockingbuffer in alle 20 kanalen voor 1 uur bij 0,5-1 psi.
    3. Flow Oplossingen 1, 2 en 3 in kanalen 1, 2 en 3, respectievelijk. Volg deze volgorde voor de volgende sets van 3 kanalen. Stroom wordt normaal gesproken in ongeveer 40 minuten. Incubeer de DNA oplossingen op kamertemperatuur gedurende 2 uur om het DNA te hybridiseren.
    4. Flow 3% BSA / PBS blockingbuffer in alle 20 kanalen voor 1 uur bij 0,5-1 psi tot gehybridiseerde DNA te verwijderen. Verwijder de PDMS plaat, en was de verkregen DNA microarray dia door dompelen het glaasje in 3% BSA / PBS eens en PBS twee keer, gevolgd door PBS verdund (1 deel PBS en 50 delen ultrapuur water). Dry de dia met behulp van een microscoop dia spinner.
    5. Voer een tweede validatie stap (figuur 2C), vergelijkbaar met die in hoofdstuk 2. Gebruik oligonucleotiden i 'te ix' die Cy3-geconjugeerd. Bewaar de 3 x 3 matrix dia in een 50 ml centrifugebuis voor later gebruik.
      Opmerking: Het DNA microarray kan bij kamertemperatuur worden bewaard in een exsiccator maanden.

4. Omzetting van de 3 x 3 DNA Array in een antilichaam Array

  1. Bereiding van antilichaam-oligonucleotide (DEAL) conjugaten
    1. Bereid oplossingen van 200 mM succinimidyl-4-formylbenzoaat (S-4FB) en 40 mM succinimidyl-6-hydrazinonicotinamide (HYNIC-S) in watervrij N, N-dimethylformamide (DMF).
    2. Bereid tot 7 afzonderlijke oplossingen van invangantilichamen (1 mg / ml) in PBS.
      Opmerking: Als het antilichaam voorraad oplossingen bevatten natriumazide bacteriostat, voeren buffer uitwisseling met PBS gebruik makend van spin ontzouten columns met 7 kDa moleculair gewicht cut-off (MWCO).
    3. Maak afzonderlijke 400 pM oplossingen van i, ii, iii, iv, v, vi, vii en DNA. Wijs elke vangantilichaam één oligonucleotidensequentie. Combineer 40 pi van 400 pM DNA met 12,25 pi DMF in microcentrifugebuisjes en spin down om grondig te mengen.
      1. Aan elk DNA / DMF oplossing, voeg 2,3 pl 200 mM S-4FB in DMF. Voor elke 100 ug invangantilichaam, voeg 2,25 gl 40 mM S-HYNIC in DMF.
    4. Incubeer de antilichaam / S-HYNIC en DNA / S-4FB oplossingen voor 4 uur bij KT.
    5. Ter voorbereiding van het antilichaam-DNA koppelingsreactie Bereid nieuwe spin ontzouten kolommen (een voor elke DNA-oplossing en een voor elk antilichaam) door wassen met citraatbuffer bij pH 6.
    6. Na 4 uur incubatie uitvoeren buffer ruil voor elk antilichaam / S-HYNIC en DNA / S-4FB oplossing. Combineer de S-4FB geconjugeerd i, ii, iii, iv, v, vi en oligonucleotiden vii 'met het antilichaam-S-HYNIC conjugaten. Incubeer het mengsel gedurende 2 uur bij KT.
    7. Incubeer het reactiemengsel O / N bij 4 ° C.
  2. Zuivering van antilichaam-oligonucleotide (DEAL) conjugaten
    Opmerking: Om het antilichaam-oligonucleotide conjugaten zuiveren, voeren snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) op een standaard FPLC systeem uitgerust met een GL kolom Superose 6 10/300.
    1. Stel de golflengte van de UV-detector van het FPLC systeem 280 nm. Gebruik isocratische stroming van PBS (pH 7,4) bij 0,3 ml / min aan het antilichaam-oligonucleotide conjugaten te scheiden van de overmaat S-4FB-DNA.
    2. Verzamel de fracties die het conjugaat en concentreer de fracties met een volume van 150 ui middels rotatie filters met een 10 kDa MWCO.
  3. Tweedimensionale patroonvorming van antilichamen
    1. Bereid een andere PDMS mal met microkamers of micro-putten onsing fabricage procedures in stap (1,2). De PDMS mal kan microliter bevatten nanoliter putten voor immunoassays.
      Opmerking: Voor algemene biomarker detectie in vloeibare monsters, wordt een PDMS mal met meerdere putten gekruist met de array glijbaan. De kenmerken van de PDMS mal afhankelijk van het onderzochte systeem. Zo kan de detectie van eiwitten van eencellige experimenten worden uitgevoerd met een PDMS mal bevattende microkamers met 0,15-nl volumes.
    2. (Optioneel) Onderwerp de PDMS mal om plasma reiniging (18 W) 1,5 min om zijn patroon oppervlak hydrofiel te maken. Vóór plasmareiniging, met plakband alle andere oppervlakken die direct worden gebonden aan de 3 x 3 matrix glijblok.
      Opmerking: Stap (4.3.2) is optioneel, maar wordt gewoonlijk uitgevoerd wanneer de PDMS mal bestemd voor gebruik bij één cel experimenten.
    3. Mate de PDMS mal met de 3 x 3 serie dia, blokkeren dan de dia met 1% BSA in PBS. Incubeer gedurende 1 uur bij KT. Meanwhile, bereiden een cocktail (200 ul eindvolume) antilichaam-oligonucleotide conjugaten. De werkconcentratie van elk conjugaat 10 ug / ml in 1% BSA / PBS.
    4. Voeg de antilichaam-oligonucleotide cocktail, vervolgens incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C om de rest van de oligonucleotide conjugaten te hybridiseren met specifieke vlekken op de 3 x 3 arrays, waardoor het DNA-matrix omzetten van een antilichaam array.
    5. Herhaal stap (3.2.4) te reinigen en droog de glijbaan. De hoogste gevoeligheid kan worden bereikt als het antilichaam matrix direct wordt gebruikt. Langdurige opslag kan leiden tot verlies van gevoeligheid.
  4. Detectie van eiwitten
    1. Reconstrueren recombinante eiwitten of bereiden een gefilterde cel monster.
    2. Mate de microarray met een op maat ontworpen chip en blokkeren het oppervlak met 3% BSA in PBS gedurende 1 uur. Verwijder vervolgens de BSA oplossing en monsters passen en incubeer 2 uur.
    3. Afwassen van de monsters met behulp 3% BSA in PBS driemaal, eend voeg vervolgens de detectie van antilichamen in een concentratie die door de product-datasheet. Incubeer 2 uur.
    4. Afwassen detectie antilichamen met 3% BSA in PBS driemaal, en voeg vervolgens Cyanine 5 (Cy5) -streptavidin bij 1 ug / ml, gevolgd door incubatie gedurende 1 uur.
    5. Herhaal stap (3.2.4) te reinigen en droog de glijbaan voor het scannen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwerpen voor de PDMS mallen (figuur 1A-1B) werden getekend met behulp van een CAD-programma (AutoCAD). Twee ontwerpen getoond functie kanalen voor doorstroming patronen, een horizontale en een verticale. De links en rechts delen van elk ontwerp zijn symmetrisch; een van hen zou kunnen zijn inlaten of uitlaten. Elk van 20 kanalen wikkelen van één uiteinde tot aan het andere uiteinde. Elk ontwerp wordt gedrukt op een chromen fotomasker (figuur 1C). De...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stromingspatroon ontwerp is de eerste cruciale stap in het vervaardigen van de 2-D microarray. Twee overlappende DNA patronen op een glassubstraat te genereren, moet het kanaal kenmerken van het eerste ontwerp loodrecht op die van de tweede (Figuur 1A-B) zijn. De ontwerpen ook rekening met de downstream-toepassingen van de microarray. Bij enkele cel analyse wordt de microarray gebruikt om eiwitten van enkelvoudige cellen ingesloten in microkamers detecteren daarom kanaal afmetingen verenigbaar ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de startup-fondsen van SUNY Albany en de toegang tot de faciliteiten van het University at Albany Cancer Research Center graag erkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sylgard 184 silicone elastomer baseDow Corning3097366-1004
Sylgard 184 silicone elastomer curing agentDow Corning3097358-1004
SU-8 2025 fotoresistMicroChemY111069
Siliconen wafers University Wafers452
Poly-L-lysine gecoate glazen plaatjesThermo ScientificC40-5257-M20
OligonucleotidenIntegrated DNA Technologies*Op maat besteld bij Integrated DNA Technologies, zie Tabel 2.
Poly-L-lysine kleefstof stockoplossingNewcomer Supply1339
Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat  (BS3)Thermo Scientific21585
1x Fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4Quality Biological114-058-101
Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) SysteemGE (Amersham Pharmacia) 18-1112-41
Superose 6 10/300 GL kolomGE Healthcare Life Sciences17-5172-01
Capture antilichamendiversendiversen*De antilichaam selectie is afhankelijk van de toepassing
Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)SolulinkS-1002
Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)SolulinkS-1004
N,N-dimethylformamideSigma-Aldrich227056
Citroenzuur, watervrijAcros42356
NatriumhydroxideFisher ScientificS318
Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCOEMD MilliporeUFC201024
Spin coaterLaurell TechnologiesWS-650-MZ
Biopsie punch met plunjer (1,0 mm diameter)Ted Pella, Inc.15110-10
Diamant graveerstift (Style 60)SPI supplies6004
TrimethylchlorosilaanSigma Aldrich92361

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
  2. Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
  3. Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
  4. Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
  5. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
  6. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
  7. Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
  8. Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
  9. Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
  10. Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
  11. Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
  13. Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499(2014).
  14. Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
  15. Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
  16. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
  17. Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
  18. Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flow PatterningAntibody MicroarrayDNA Antibody ConjugatesPDMS Mold FabricationSingle Cell AnalysisSU 8 MasterPerpendicular Flow PatternMicroarray ValidationBiomarker DetectionCell Signaling Studies

Gerelateerde artikelen