Modeling Chemotherapie Resistant Leukemie In Vitro

Samenvatting

Het huidige rapport vat een protocol samen dat kan worden gebruikt om de invloed van de beenmerg-micro-omgevingsniche op leukemiecellen te modelleren, met nadruk op de verrijking van de meest chemoresistente subpopulatie.

Samenvatting

Het is goed gevestigd dat de beenmerg-micro-omgeving een unieke schuilplaats biedt voor hematologische ziekten die zich zowel in dit gebied initieren als voortschrijden. Het model dat in het huidige rapport wordt gepresenteerd, maakt gebruik van humane primaire beenmerg-stromacellen en osteoblasten als twee representatieve celtypen uit de beenmergniche die het tumorcelfenotype beïnvloeden. De in vitro co-cultuurcondities die worden beschreven voor humane leukemiecellen met deze primaire nichecomponenten ondersteunen de generatie van een chemoresistente subpopulatie van tumorcellen die efficiënt uit de cultuur kunnen worden teruggewonnen voor analyse door diverse technieken. Een strikt voedingsschema om voedingsstoffluxen te voorkomen, gevolgd door herstel van de populatie van tumorcellen die zijn gemigreerd onder de aderente beenmerg-stromacellen (BMSC) of osteoblasten (OB) door middel van geltype 10 gekruiste dextran (G10) deeltjes, genereert een "phase dim" (PD) populatie van tumorcellen, en biedt een consistente bron van gezuiverde therapieresistente leukemiecellen. Deze klinisch relevante populatie van tumorcellen kan worden geëvalueerd door standaardmethoden om apoptotische, metabolische en celcyclus-regulatorische paden te onderzoeken, evenals het bieden van een rigoureuzer doelwit om nieuwe therapeutische strategieën te testen voorafgaand aan preklinische onderzoeken gericht op minimale resterende ziekte.

Inleiding

Het algemene doel van de beschreven methode is om een efficiënte, kosteneffectieve in vitro benadering te bieden die de onderzoeking ondersteunt van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de door het beenmerg ondersteunde overleving van leukemiecellen tijdens blootstelling aan chemotherapie. Het is goed gedocumenteerd dat overlevende resterende tumorcellen die na de behandeling aanwezig blijven, bijdragen aan het terugkeren van de ziekte die vaak agressiever is dan die bij diagnose en vaak minder effectief wordt behandeld^1-8. Modellen die leukemiecellen in isolatie omvatten, zoals die beperkt zijn tot het kweken van cellen in alleen media, voor het testen van therapeutische benaderingen, houden geen rekening met deze cruciale signalen, of de heterogeniteit van de ziekte die optreedt als reactie op de beschikbaarheid van niche-afgeleide signalen waarin tumorcelsubpopulaties met zeer specifieke interacties met niche-cellen een verbeterde bescherming verkrijgen. Standaard 2D co-cultuurmodellen die beenmerg-afgeleide stromale cellen en leukemiecellen co-cultiveren, hebben de bijdrage van de beenmergniche enigszins aangepakt en hebben aangetoond dat interactie met cellen van de beenmerg-micro-omgeving hun weerstand tegen chemotherapie verhoogt en hun groeikarakteristieken verandert^9-14. Deze modellen falen echter vaak om de lange termijn overleving van tumorcellen na te bootsen en geven niet nauwkeurig de resultaten weer die geassocieerd zijn met de meest resistente leukemiecelpopulaties die bijdragen aan MRD. In vivo modellen blijven cruciaal en definiëren de 'gold standard' voor het onderzoek van innovatieve therapieën vóór klinische proeven, maar ze worden vaak uitgedaagd door de tijd en kosten die nodig zijn om hypothesen te testen met betrekking tot resistente tumoren en terugval van de ziekte. Daarom zou de ontwikkeling van meer informatieve 2D-modellen van voordeel zijn voor pilootonderzoek om de ontwerp van latere muis-gebaseerde pre-klinische ontwerpen beter te informeren.

Het 2D in vitro model dat in dit rapport wordt gepresenteerd, mist de complexiteit van de ware in vivo micro-omgeving, maar biedt een kosteneffectieve en reproduceerbare manier om tumorinteracties met de micro-omgeving te onderzoeken die zich specifiek leent voor verrijking van de chemo-resistente subpopulatie van tumorcellen. Dit onderscheid is waardevol omdat evaluatie van de volledige populatie van tumorcellen het fenotype van een kleine groep therapieresistente tumorcellen kan maskeren die het belangrijkste doelwit vormen. Een extra voordeel is de schaalbaarheid van het model om te passen bij de analyse van belang. Bulkculturen kunnen worden opgezet voor die analyses die een aanzienlijk herstel van tumorcellen vereisen, terwijl kleinschalige co-culturen in multi-well platen kunnen worden gebruikt voor PCR-gebaseerde analyses of microscopie-gebaseerde evaluaties.

Op basis van deze behoefte ontwikkelden we een in vitro model om de heterogeniteit van de ziekte aan te pakken die kenmerkend is voor B-lijnage acute lymfatische leukemie (ALL). We tonen aan dat ALL-cellen, die veel kenmerken gemeen hebben met hun gezonde tegenhangers, zich lokaliseren in verschillende compartimenten van BMSC of OB co-cultuur. Drie populaties van tumorcellen worden gegenereerd die verschillende fenotypes hebben die waardevol zijn voor onderzoek naar therapeutische respons. Specifiek, we tonen aan dat (ALL) cellen die worden teruggevonden uit de 'phase dim' (PD) populatie van co-cultuur consistent refracair zijn voor therapie met een overleving die benadert tumorcellen die niet zijn blootgesteld aan cytotoxische middelen. Deze ALL-cellen, afkomstig uit gevestigde cellijnen of primaire patiëntenmonsters, migreren onderheen aderente stromale cellen of osteoblastlagen maar kunnen worden gevangen na trypsinisatie van culturen en scheiding van celtypen door gebruik van gel type 10 gekruiste dextran (G10) deeltjeskolommen¹⁵.

Hier presenteren we een opstelling van een 2D co-cultuur die kan worden gebruikt om interacties tussen beenmerg-micro-omgeving stromale cellen (BMSC/OB) en leukemiecellen te modelleren. Van bijzonder belang is de waarneming dat leukemiecellen drie ruimtelijke subpopulaties vormen ten opzichte van de stromale celmonolaag en dat de PD populatie een chemotherapie-resistente tumorpopulatie vertegenwoordigt vanwege zijn interactie met de BMSC of OB. Verder tonen we hoe effectief de leukemiecelpopulaties kunnen worden geïsoleerd door G10 kolommen. Opmerkelijk is dat we hebben gevonden dat isolatie van deze subpopulaties downstream-analyse van de meest resistente PD-populatie mogelijk maakt om potentiële weerstandsmodi te bepalen die aan deze cellen worden toegekend vanwege hun interactie met de beenmerg-micro-omgeving stromale cellen of osteoblasten. Technieken die we downstream van dit co-cultuur en isolatiemodel hebben gebruikt, omvatten flowcytometrische evaluatie, proteomische analyse en gerichte eiwitexpressievaardigheden, evenals recent ontwikkelde laserablatie elektrospray ionisatie (LAESI) en Seahorse-analyse om metabolische profielen te evalueren. Door gebruik van dit model in combinatie met de bovenstaande technieken hebben we gevonden dat de PD-populatie van leukemiecellen een chemotherapie-resistente fenotype heeft die uniek is in vergelijking met leukemiecellen gekweekt in alleen media of die teruggevonden zijn uit de andere subpopulaties in dezelfde co-cultuur. Als zodanig leent dit model zich voor een meer rigoureuze evaluatie om strategieën te testen die zich richten op de meest chemotherapie-resistente leukemiecellen die hun resistente fenotype verkrijgen door interactie met de beenmerg-micro-omgeving.

Protocol

1. Geavanceerde Voorbereiding

1. Het voorbereiden van dextran G10 deeltjes.
   1. Bereid G10 suspensie door toevoeging van 50 ml 1 x PBS tot 10 g G10 deeltjes. Meng door omkeren en laat G10 om zich te vestigen van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° CO / N.
   2. De dag van de G10 scheidingskolom, aspireren PBS vaste G10 deeltjes en voeg 50 ml vers PBS. Meng door inversie. Tweemaal herhalen, toevoegen van 50 ml verse PBS vaste deeltjes G10 en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
2. Het kweken van BMSC en OB.
   1. Handhaven zowel BMSC of OB bij 37 ° C in 6% CO ₂ en gekweekt op 10 cm weefselkweekplaten tot 90% confluentie bereikt.
   2. Trypsinize BMSC of OB cellen en split 1: 2 op nieuwe cm platen 10. De cellen worden gekweekt tot deze normen tot leukemische nodig voor co-kweken.

2. het opzetten en onderhouden Co-cultuur

1. Voeg 5-20 x ¹⁰ 6 leukemische cellen in 10 ml van tumorspecifieke voedingsbodems op een 80% -90% confluent BMSC of OB plaat.
   OPMERKING: Ons laboratorium stelt co-kweken bij 37 ° C in 5% O ₂ beter herinnerd aan beenmergmicromilieu waarvan is aangetoond dat varieert van 1% tot 7% ^16-18. Echter, het handhaven co-culturen in deze zuurstofspanning is niet kritisch voor het vaststellen van de drie leukemische subpopulaties en is ter beoordeling van het lab.
2. Elke 4 ^{e dag} verwijder alle maar 1 ml van de media (inclusief leukemische cellen in suspensie) en te vervangen door 9 ml verse leukemische kweekmedium. Bij het verwijderen van 9 ml van media van de plaat, wees niet naar de BMSC of OB hechtende laag verstoren.
   1. Verwijder media door het kantelen plaat aan de zijkant en zuig media in de hoek van de plaat. Bovendien, wanneer het toevoegen van verse media, zorg ervoor dat druppelsgewijs in de hoek van de plaat tegen de zijwand toe te voegen aan een minimale verstoring van de BMSC of OB hechtende laag te verzekeren.
3. Na de ^12e dag van co-cultuur spoel leukemische cellen van BMSC of OB laag pipetteren kweekmedia van schotel en neer zachtjes over de schotel ongeveer 5 tot 10 maal en verzamel in 15 ml conische buis. Reseed op nieuwe 80% -90% confluent BMSC of OB plaat zoals beschreven in stap 2.1.
   OPMERKING: De zachte spoelen van de co-kweek zoals beschreven in stap 2.3 en PB S zal leukemische cellen te verwijderen zonder verstoring van de BMSC of OB monolaag. Dit laat alleen tumorcellen worden overgebracht naar de eerste co-kweekplaat. Deze 12 daagse cyclus kan zo vaak worden herhaald als nodig is gebaseerd op de gebruikersbehoeften.

3. Voorbereiding G10 Bead Columns

LET OP: Als steriele downstream analyse of het kweken is vereist volgende G10 kolom voor de scheiding van de volgende stappen met behulp van steriele techniek moet worden uitgevoerd en G10 kolommen worden ingesteld in een steriele biologische kap.

1. Pre-warm celkweekmedium tot 37 ° C in een waterbad (~ 30 ml per kolom). Met behulp van een 10 ml wegwerpspuit, te verwijderen en gooi zuiger. Voeg glaswol aan spuit.
2. Met behulp van een pincet, uit elkaar te trekken glaswol in dunne losse strengen. Voeg meerdere lagen licht verpakt glaswol aan de spuit totdat 2/3 van de spuit is gevuld met glaswol.
   NB: De glaswol is van cruciaal belang om te voorkomen dat losse G10 deeltjes van besmetting van de leukemische cellen collectie. Zorg ervoor dat glaswol is genoeg om de G10 deeltjes ondersteunen gepakt, maar niet te dicht op elkaar gepakt in de media stroming door de kolom te blokkeren.
3. Attach 1-weg kraan aan de bovenzijde van de spuit in de gesloten stand.
4. Klem spuit kolom ringstandaard hoog genoeg om een ​​50 ml conische buis (verzamelbuis) onder kraan kan worden geplaatst. Plaats collectie buis onder spuit kolom.
5. Met behulp van een 10 ml pipet toe te voegen, drop-wise, G10 deeltjes opnieuw gesuspendeerd in PBS om de kolom op de top vande glaswol. Voeg meer G10 deeltjes tot een ~ 2 ml pellet (gemeten graduaties op spuit) van G10 deeltjes vormen bovenop de glaswol.
6. Evenwicht van de G10-kolom met voorverwarmde media.
   1. Voeg 2 ml van voorverwarmde media kolom. Open kraan afsluiter langzaam zodat media stroomt uit de kolom druppelsgewijs.
   2. Herhaal stap 3.6.1 tot in totaal 10 ml van voorverwarmde media zijn liep over de kolom.
      OPMERKING: Indien G10 deeltjes worden waargenomen in de stroom door de verzamelbuis, hetzij 1) voeg meer G10 deeltjes behouden ~ 2 ml pellet ervoor te zorgen dat er geen extra G10 deeltjes ontsnappen aan de kolom of 2) vervangen kolom met andere af en herhaal stappen 3.4-3.6.1.
   3. Na de voorverwarmde media afvoerleidingen van de kolom, sluit het kraantje en gooi collectie buis met doorstroming. Voeg een nieuwe collectie buis onder de kolom. Kolom kan nu worden gevuld met medium + celmengsel.
      LET OP: Columnsmoet onmiddellijk worden gebruikt en niet toegestaan ​​om te drogen.

4. Scheiden 3 subpopulaties binnen Co-cultuur

1. Het verzamelen van suspensie (S) tumor subpopulatie.
   1. Aspireren media van co-cultuur plaat met pipet en voorzichtig dezelfde media opnieuw van toepassing op de plaat te spoelen en het verzamelen van media met leukemische cellen in een 15 ml conische buis. De leukemische cellen verzameld zijn de S subpopulatie.
2. Het verzamelen van Phase Bright (PB) tumor subpopulatie.
   1. Voeg 10 ml vers medium terug op co-cultuur plaat. Spoel krachtig door pipetteren toegevoegd media en neer ongeveer 5 keer aan hechtende leukemische cellen, maar niet hard genoeg om aanhangend BMSC / OB component los te verwijderen.
   2. Aspireren met een pipet en het verzamelen van media in een 15 ml conische buis. De verzamelde cellen zijn de PB subpopulatie.
3. Het verzamelen van Phase Dim (PD) tumor subpopulatie.
   1. Spoel de plaat met 1 ml PBS om remove overige media. Trypsinize co-kweekplaat met 3 ml trypsine en omgeving naar 37 ° C incubator gedurende 5 min.
   2. Verwijder plaat uit de incubator en zachtjes tikken zijden van de plaat hechtende BMSC / OB verjagen.
   3. Voeg 1 ml foetaal runderserum (FBS) en de pipet op en neer 3-5 keer uiteen grote celaggregaten breken.
   4. Verzamel media met cellen in een 15 ml conische buis. Deze cellen zijn de ongezuiverde PD subpopulatie met BMSC / OB ook.
4. Centrifuge 3 geïsoleerde subpopulaties bij 400 xg gedurende 7 min. Zuig en gooi supernatant vervolgens afzonderlijk mengen pellets in 1 ml voorverwarmde media. Cellen aanpassen op een G10 kolom worden geladen.

5. Laden Co-cultuur cellen op G10 Column

LET OP: Zorg ervoor dat kraan is volledig afgesloten voor het toevoegen van media met cellen aan G10 kolom. Ook moet elke subpopulatie worden liep over een aparte G10 column dus niet te Inleidinge eventuele afwijking tussen de bevolkingsgroepen in downstream-analyse.

1. Met een 1000 ui pipet 1 ml van elke cel subpopulatie in voorverwarmde media een aparte G10 kolom druppelsgewijs. Zorg ervoor dat de media die de cellen blijft aan de top of binnen G10 pellet. Sta cellen incuberen op G10 pellet gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   LET OP: Afsluiter blijft gesloten voor de duur van incubatie.

6. Verzamelen leukemische cellen van G10 kolom

1. Voeg 1-3 ml voorverwarmd medium elke G10 kolom. Open kraan kraan en laat de media langzaam verlaat de kolom druppelsgewijs.
   LET OP: Het is cruciaal om een langzame stroomsnelheid van de kolom of de G10 pellet met BMSC / OB kan wassen van de kolom en vervuilen de geïsoleerde leukemische cellen te handhaven.
2. Doorgaan met voorverwarmde media in kleine stappen (1-2 ml) naar G10 kolom toe te voegen tot een totaal van 15 tot 20 ml heeft doorlopen kolom en is verzameld. Sluiten kraan valve en cap collectie buis.
   LET OP: Als een G10 deeltje pellet wordt gezien op de bodem van de collectie buis, media verwijder voorzichtig uit de buis verlaten G10 deeltje pellet ongestoord en transfer naar nieuwe buis.
3. Centrifugeer media verzameld bij 400 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in buffer die geschikt is voor downstream-applicatie.
4. De cellen zijn nu een zuivere populatie van leukemische cellen vrij van BMSC of OB besmetting en zijn klaar om te worden toegepast op de downstream-applicaties op gebruikersniveau discretie.
   LET OP: leukemie levensvatbaarheid van de cellen dienen ongewijzigd te blijven bij het ​​passeren van cellen via G10 kolommen.

Resultaten

Succesvolle opzet en cultuur van deze co-kweek zal resulteren in de inrichting van 3 subpopulaties van leukemische cellen opzichte van de hechtende BMSC of OB monolaag. Figuur 1 laat zien hoe alle cellen gezaaid in een BMSC monolaag eerste gezicht aangezien slechts enkele populatie van zwevende leukemische cellen. Gedurende 4 dagen leukemische cellen interageren met de BMSC tot 3 ruimtelijke subpopulaties van leukemische cellen vormen (onderbroken (S) fase helder (PB), e...

Discussie

Minimal residual disease (MRD) die bijdraagt ​​aan terugval van de ziekte blijft een belangrijke klinische uitdaging bij de behandeling van agressieve refractaire ALL, evenals een groot aantal andere hematologische maligniteiten zijn. De beenmerg micro-omgeving is de meest voorkomende plaats van de terugval in ALL ^3,8. Als zodanig, modellen die het beenmerg micro-omgeving te modelleren zijn belangrijke instrumenten om hypotheses in verband met leukemie tumorcel overleving en het onderhoud van MRD tijdens bloo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
G10 sephadex kralen	Sigma	G10120	Aangeduid in manuscript als gel type 10 gekruiste dextran deeltjes
10 ml steriele spuit	BD	309604
Glasmaal	Pyrex	3950
1-weg stopkleppen	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml conische centrifugeerbuizen	World Wide Medical Products	41021039	Gebruikt als verzamelbuizen
15 ml conische centrifugeerbuizen	World Wide Medical Products	41021037	Gebruikt voor celcollectie
Fetaal Rundserum	Sigma	F6178
0,05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Celkweekschalen	Greiner Bio-One	664160
Kweekmedia
Osteoblast kweekmedia	PromoCell	C-27001	Voor menselijke osteoblast media
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	Voor tumor media voorbereiding
Cellijnen
Adherente Cellen:
Menselijke Osteoblasten	PromoCell	C-12720	Menselijke osteoblasten werden gekweekt volgens de aanbevelingen van de leverancier’s.
Menselijke Beenmerg Morfologische Cellen	WVU Biospecimen Core		Anonieme primaire menselijke leukemie en beenmerg stromacellen (BMSC) werden verstrekt door het Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core en de West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC culturen werden opgericht zoals eerder beschreven (*)
Leukemie Cellen:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH cellen werden gekweekt volgens de aanbevelingen van de leverancier’s en aanbevolen media.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 werden gekweekt volgens de aanbevelingen van de leverancier’s en aanbevolen media.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruptie van beenmerg stromacelfunctie door etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.