Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

Summary

Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn toegewijd aan de definitieve endoderm ter verbetering van downstreamtoepassingen en verdere onderverdelingen.

Abstract

De differentiatie mogelijkheden van pluripotente stamcellen zoals embryonale stamcellen (SER) maken voor een potentiële therapeutische toepassing voor celvervangingstherapieën. Terminaal gedifferentieerde celtypen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van verschillende degeneratieve ziekten. In vitro differentiatie van deze cellen aan weefsels van de longen, lever en pancreas vereist in de eerste stap het genereren van definitieve endodermale cellen. Deze stap is snelheidsbepalend voor verdere differentiatie richting terminaal rijpte celtypes zoals insuline producerende beta-cellen, hepatocyten of andere endoderm afgeleide celtypen. Cellen die zich inzetten in de richting van de endoderm afstamming sterk drukken een veelheid van transcriptiefactoren zoals FOXA2, Sox17, HNF1B, leden van de familie GATA, en het oppervlak receptor CXCR4. Echter, differentiatie protocollen zelden 100% efficiënt. Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van een CXCR4 + celpopulatie na differentiatiein het voorste via magnetische microkralen. Deze zuivering bovendien verwijdert cellen ongewenste lijnen. De zachte reiniging methode is snel en betrouwbaar en kunnen worden gebruikt om downstream-toepassingen en differentiaties te verbeteren.

Introduction

Pluripotente cellen zoals embryonale stamcellen (SER) hebben de mogelijkheid om te differentiëren in vrijwel elk type cel van het menselijk lichaam. Aldus kan in vitro differentiatie protocollen worden gebruikt om verschillende volwassen celtypes zoals cardiomyocyten ^1, hepatocyten ^{2, 3} beta-cellen, long epitheelcellen ⁴ of ⁵ neuronale cellen te genereren. Dit maakt SER een waardevol instrument voor de mogelijke behandeling van verschillende degeneratieve ziekten ^3.

De in vitro differentiatie van SER richting volwassen weefsels van de longen, lever en panc....

Protocol

1. Differentiatie van Human ESC naar de Definitive Endoderm

1. Cultiveren menselijke embryonale stamcellen (SER) in een incubator bij 37 ° C en _5% CO2.
2. Bekleed een nieuwe 6-well celcultuur plaat met 1 ml van een basaalmembraan matrix en incubeer de kweek-ware gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor specifieke informatie kunt u zich wenden tot de instructies van de desbetreffende fabrikant.
3. Controleer of de gekweekte menselijke SER 80% -90% samenvloeiing onder de microscoop met behulp van een lage vergroting (bijvoorbeeld 4X) hebben bereikt. Zuig het medium van de holten te zuigen uit het medium met ee....

Results

na differentiatie SER ondergaan drastische veranderingen in gen- en eiwitexpressie. Figuur 1 toont typische merkergenen die kan worden gebruikt om een succesvolle endoderm differentiatie verifiëren. Prime doelstellingen voor een genexpressie analyse GSC, FOXA2 en Sox17. In een relatieve genexpressie analyse vooral FOXA2 en Sox17 worden verhoogd met> 2.000-voudig in vergelijking met ongedifferentieerde SER.......

Discussion

Op dit moment gebruikt differentiatie protocollen zelden tot 100% gedifferentieerde cellen. Om redenen die nog moeten worden aangepakt sommige cellen weerstaan ​​aan de differentiatie proces. Afhankelijk van de efficiëntie van de gebruikte differentiatie protocol en de neiging van het ESC lijn een aantal residuele pluripotente cellen worden vaak waargenomen, zelfs na differentiatie in de definitieve endoderm. Deze resterende cellen kunnen stroomafwaarts differentiaties of verdere analyse, zoals transcriptomics, proteomi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 human embryonic stem cell line	Harvard Department of stem cell & regenerative biology		Suitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell line	ES Cell International		Suitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC culture medium
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	magnetic field
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK inhibitor
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stemcell Technologies	7174	Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately.
MS Columns	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Technologies
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan assay	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R&D Systems	AF1924