Methodenartikel

Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53655

⸱

3 maart 2016

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn toegewijd aan de definitieve endoderm ter verbetering van downstreamtoepassingen en verdere onderverdelingen.

Samenvatting

De differentiatie mogelijkheden van pluripotente stamcellen zoals embryonale stamcellen (SER) maken voor een potentiële therapeutische toepassing voor celvervangingstherapieën. Terminaal gedifferentieerde celtypen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van verschillende degeneratieve ziekten. In vitro differentiatie van deze cellen aan weefsels van de longen, lever en pancreas vereist in de eerste stap het genereren van definitieve endodermale cellen. Deze stap is snelheidsbepalend voor verdere differentiatie richting terminaal rijpte celtypes zoals insuline producerende beta-cellen, hepatocyten of andere endoderm afgeleide celtypen. Cellen die zich inzetten in de richting van de endoderm afstamming sterk drukken een veelheid van transcriptiefactoren zoals FOXA2, Sox17, HNF1B, leden van de familie GATA, en het oppervlak receptor CXCR4. Echter, differentiatie protocollen zelden 100% efficiënt. Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van een CXCR4 + celpopulatie na differentiatiein het voorste via magnetische microkralen. Deze zuivering bovendien verwijdert cellen ongewenste lijnen. De zachte reiniging methode is snel en betrouwbaar en kunnen worden gebruikt om downstream-toepassingen en differentiaties te verbeteren.

Inleiding

Pluripotente cellen zoals embryonale stamcellen (SER) hebben de mogelijkheid om te differentiëren in vrijwel elk type cel van het menselijk lichaam. Aldus kan in vitro differentiatie protocollen worden gebruikt om verschillende volwassen celtypes zoals cardiomyocyten 1, hepatocyten 2, 3 beta-cellen, long epitheelcellen 4 of 5 neuronale cellen te genereren. Dit maakt SER een waardevol instrument voor de mogelijke behandeling van verschillende degeneratieve ziekten 3.

De in vitro differentiatie van SER richting volwassen weefsels van de longen, lever en pancreas is een pseudo-gastrulatie in cellen die doet denken aan de definitieve endoderm (DE) 6. Aangezien stroomafwaarts differentiatie naar de genoemde somatische celtypen aanzienlijk minder efficiënt wordt een optimale endoderm differentiatie geacht snelheidsbepalende 7. Cellen die zich inzetten in de richting van de endoderm afstamming ondergaan characteristic veranderingen in hun expressie van genen profiel. Pluripotentie meester regulator genen worden naar beneden gereguleerd, terwijl de expressie van andere transcriptiefactoren zoals FOXA2, Sox17, HNF1B, leden van de familie GATA en het oppervlak receptor CXCR4 is sterk opgereguleerd 6, 8, 9. CXCR4 is bekend dat transactivated door SMAD2 / 3, stroomafwaarts van Nodal / TGF-β signalering en Sox17 gevolg van specifieke bindingsplaatsen in het promotorgebied 10. Aldus is een zeer geschikte marker gebruikt in een aantal rapporten 6, 8, 11-13. Deze uitdrukking veranderingen weerspiegelt een pseudo-gastrulatie event, waarbij SER eerste kenmerken van een primitieve streep-achtige celpopulatie te verwerven en vervolgens te plegen in de kiem endoderm laag 6.

Echter, differentiatie protocollen zelden 100% efficiënt als enkele cellen het differentiatieproces kan weerstaan ​​of differentiëren tot andere ongewenste lijnen 14. Deze cellen kunnen negatief Influenvu verdere differentiatie. Bovendien resterende ongedifferentieerde cellen herbergen grote risico's voor later transplantatie experimenten en kan aanleiding geven tot teratomas 15-17 te geven.

Om deze ongewenste cellen vroeg op het oppervlak marker CXCR4 kan worden gebruikt voor het zuiveren van cellen die zijn toegewijd aan het voorste 18 verwijderen. Hier beschrijven we een werkwijze voor de positieve selectie van CXCR4 + cellen uit DE differentiatie culturen. Hierbij wordt het oppervlak marker CXCR4 gebonden door een antilichaam dat dan op zijn beurt bindt aan magnetische microkralen. Anders dan de zware omstandigheden tijdens FACS-sortering, de magnetisch gemerkte DE-achtige cellen kunnen vervolgens eenvoudig worden gezuiverd in een benchtop formaat met behulp van een zachte zuiveringswerkwijze. Dit protocol verschaft een eenvoudige werkwijze voor het verwijderen van celpopulaties die het voorste differentiatieproces tegengegaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Differentiatie van Human ESC naar de Definitive Endoderm

  1. Cultiveren menselijke embryonale stamcellen (SER) in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Bekleed een nieuwe 6-well celcultuur plaat met 1 ml van een basaalmembraan matrix en incubeer de kweek-ware gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor specifieke informatie kunt u zich wenden tot de instructies van de desbetreffende fabrikant.
  3. Controleer of de gekweekte menselijke SER 80% -90% samenvloeiing onder de microscoop met behulp van een lage vergroting (bijvoorbeeld 4X) hebben bereikt. Zuig het medium van de holten te zuigen uit het medium met een steriele glazen Pasteur pipet. Was de cellen eenmaal met fosfaat- gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing. Voor deze, voeg 2 ml PBS aan elk putje zachtjes schudden de plaat en zuigen uit de oplossing om de dode cellen en celresten te verwijderen.
  4. Voeg 1 ml enzym-vrije passage reagens voor zachte dissociatie van celgroepen. Incubeer de cellen bij 37 ° C eend 5% CO2 totdat de cellen vertonen duidelijke tekenen van verstoring in kleine clusters.
    OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de gebruikte reagens. Voor de in de sectie materialen genoemd enzym-vrije passage oplossing incubatietijd is ongeveer 7 minuten.
  5. Voeg 1 ml DMEM / F-12 medium en verstoren de resterende celaggregaten in enkele cellen door op en neer pipetteren met een 1 ml pipet tip. Gebruik de cellen van het oppervlak te spoelen en breng de cellen in een centrifugebuis. Alle elementen ophalen, wassen elk putje met 1 ml DMEM / F-12 medium en voeg het medium aan de centrifugebuis.
  6. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 ml ES celcultuur medium dat 10 uM Rho-kinase (ROCK) remmer.
  7. Tel de cellen onder de microscoop met een hemocytometer en zaden 150.000 - 400.000 cellen per 6 putjes of andere plaatindeling, afhankelijk van de ES cellijn. gebruik cultuur medium dat 10 pM ROCK inhibitor apoptose en kweek bij 37 ° C en 5% CO 2 voorkomen dat de cellen in een incubator.
  8. Ongeveer 24 uur na het zaaien aspireren het medium met een steriele glazen Pasteur pipet en voeg 2 ml primitieve streep inductie medium.
    LET OP: Dit medium bevat finale concentraties van 1% glutamine, 0,2% FCS, 5 uM CHIR-99021 en 50 ng / ml activine A in Advanced RPMI-1640-medium. Gewoonlijk gebruiken 2 ml medium voor kweken in 6-well platen.
  9. 48 uur na het zaaien, vervang dan de middellange tot inductie medium endoderm. Cultiveren van de cellen in dit medium een ​​48 uur dagelijkse mediumverversing.
    LET OP: Dit medium bestaat uit 1% glutamine, 0,2% FCS en 50 ng / ml activine A in Advanced RPMI-1640-medium. Cellen die zich inzetten in de richting van de definitieve endoderm drukken de oppervlakte marker CXCR4. De kleuring van CXCR4 kan worden gebruikt om het aantal DE-voorbestemde cellen te kwantificeren.
2. Kleuring van CXCR4 + Definitive Endoderm Cellen voor Flowcytometrieanalyse

  1. Voor de laatste 24 uur, maar ten minste 1 uur vóór het verzamelen van cellen toe 10 pM ROCK inhibitor aan het kweekmedium.
  2. Coat de celkweek-software die wordt gebruikt voor het opnieuw enten met een basaalmembraan matrix, dat wil zeggen 12-well platen voor qPCR analyse of kamer objectglaasjes voor immunofluorescentie kleuring. Incubeer de platen of dia gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Zuig het medium met een steriele glazen Pasteur pipet uit de putjes van de gedifferentieerde cellen gebruikt voor het kleuren en / of sorteren.
  4. Voeg 1 ml enzym-vrije passage reagens voor de zachte dissociatie van celgroepen. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 totdat de cellen vertonen duidelijke tekenen van verstoring in kleine clusters.
    OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de gebruikte reagens. Voor de in de genoemde materialen enzymvrije passages oplossingALS Sectie, incubatietijd is ongeveer 7 min.
  5. Voeg 1 ml DMEM / F-12 medium en verstoren overige celaggregaten in enkele cellen door op en neer pipetteren met een 1 ml tip. Gebruik de cellen van het oppervlak te spoelen en breng de cellen in een centrifugebuis. Alle elementen ophalen, wassen elk putje met 1 ml DMEM / F-12 medium w / o FCS en voeg het medium aan de centrifugebuis.
  6. Tel de cellen onder de microscoop met een hemocytometer. Cellen van drie putjes van een 6-wells plaat zou leiden tot 10-15 x 10 6 cellen na drie dagen van differentiatie. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g.
    Opmerking: Het exacte aantal verkregen cellen zal afhangen van de pluripotente cellijn die voor de differentiatie.
  7. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in PEB-buffer die 10 uM ROCK inhibitor. Met 100 ul van deze buffer tot 10 7 cellen. Voeg de 10 pM ROCK-remmer op de dag van staining. Gebruik deze buffer voor alle downstream-toepassingen (aangeduid als PEB buffer + RI).
    OPMERKING: PEB buffer bevat 0,5% BSA en 2 mM EDTA in PBS. Als er meer cellen worden gekleurd, aan te passen aan de buffer volume dienovereenkomstig.
  8. Voeg 10 ul van een CXCR4-APC antilichaam per 10 7 cellen in 100 ul, dit komt ongeveer overeen met een verdunning van 1:10.
    Opmerking: het gebruik van een APC-gekoppelde antilichaam niet verplicht. In plaats daarvan kan worden vervangen, afhankelijk van de gebruikte microkralen. Als er meer cellen worden gekleurd dienovereenkomstig aan te passen het volume antilichaam.
  9. Meng door voorzichtig omkeren van de buis met de vingers en incuberen bij 4 ° C in een koelkast gedurende 15 minuten. Resuspendeer de cellen met 1-2 ml PEB-buffer. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g.
  10. Zuig het supernatant met een steriele glazen Pasteur pipet en resuspendeer de celpellet in 80 pi per PEB 10 7 cellen en voeg 20 ul anti-APC microbolletjes.
    NOTITIE: Als er meer cellen worden gekleurd, pas de micro-bead volume dienovereenkomstig.
  11. Meng door voorzichtig omkeren van de buis met de vingers en incuberen bij 4 ° C in een koelkast gedurende 15 minuten. Resuspendeer de cellen met 1-2 ml PEB buffer + RI. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Zuig de buffer. Resuspendeer in 500 ui PEB buffer + RI.

3. Magnetische scheiding van CXCR4 + cellen

  1. Plaats een middelgrote magnetische kolom in een magnetisch veld volgens vervaardiging instructies. Pre-spoel de kolom met 500 pi PEB buffer + RI. Breng de gehele celsuspensie op de kolom. Verzamel de stroom door aangezien niet alle cellen zullen binden aan de kolom. Zorg ervoor dat niet om de kolommen te storen voor een optimale ophalen van CXCR4 + cellen.
  2. Was de kolom driemaal met 500 ul buffer PEB + RI. Het verzamelen van de eerste stroom door en deze combineren met de verzamelde cellen uit stap 3.1. Verwijder de magnetische kolom uit het magnetische veld en plaats het in eengeschikt collectie buis. Voeg 1 ml PEB buffer + RI op de kolom. Om elueren de cellen stevig druk de zuiger in de kolom.
  3. Optioneel: Verzamel alle stroming door monsters afzonderlijk gebruiken 20 pi elk van het aantal CXCR4 + cellen met flowcytometrie geanalyseerd. Hun aantal moet afnemen bij iedere wasstap.
    LET OP: Minstens 2 x 10 4 levensvatbare, gated cellen moeten worden geteld voor betrouwbare resultaten.
  4. Herhaal stap 3,1-3,3 met de verzamelde-doorstroming monster uit stap 3.1 en de eerste stroom door monster van stap 3.2 met behulp van een nieuwe kolom. Niet opnieuw gebruik maken van de vorige kolom. Via de plunjer lucht wordt geperst in de kolom, die blokkeert.
  5. Tel de cellen onder de microscoop met een hemocytometer. Afhankelijk van de efficiëntie van de differentiatie tot 6 x 10 6 cellen kunnen eerst worden gesorteerd en een 1 x 10 6 cellen door een tweede kolom bij gebruik 10 7 cellen voor de procedure.
  6. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en van een steriele glazen Pasteur pipet en resuspendeer de cellen in 1 ml endoderm inductie medium uit stap 1.9 met extra 10 pM ROCK inhibitor.
  7. Tel de cellen onder de microscoop met een hemocytometer. Zaad van de cellen met een geschikte dichtheid, dat wil zeggen, ~ 4 x 10 5 cellen per putje van een 12-well plaat (ong. 3,6 cm2 oppervlak) of ~ 1,5 x 10 5 cellen per putje van een 8-well kamer-slide.

4. Optioneel: Analyse van gezuiverde Definitive Endoderm Bevolking

  1. Voor immunofluorescentiekleuring zet de gezuiverde cellen uit stap 3,7 ongeveer 24 uur na enten met 4% paraformaldehyde en vlekken definitieve endoderm (DE) en / of pluripotentie marker eiwitten.
    LET OP: Veelgebruikte DE merkers omvatten FOXA2 en Sox17, vaak gebruikt pluripotentie markers omvatten Oct3 / 4, NANOG en SOX2 6, 8.
  2. for RT-qPCR analyse, de oogst van de gezuiverde cellen direct of 24 uur na het zaaien, te extraheren totaal-RNA en reverse transcriberen cDNA uit de uitgepakte totaal-RNA-monsters. Met 10 ng cDNA als matrijs per RT-qPCR reactie (triplo's) bij de expressie van DE en pluripotentie markergenen 6, 8 analyseren.
    LET OP: Veel gebruikte merkergenen worden vermeld in stap 4.1. Cyclusomstandigheden zijn 5 min bij 95 ° C en 40 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 1 minuut bij 60 ° C, gevolgd door smeltcurve analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

na differentiatie SER ondergaan drastische veranderingen in gen- en eiwitexpressie. Figuur 1 toont typische merkergenen die kan worden gebruikt om een succesvolle endoderm differentiatie verifiëren. Prime doelstellingen voor een genexpressie analyse GSC, FOXA2 en Sox17. In een relatieve genexpressie analyse vooral FOXA2 en Sox17 worden verhoogd met> 2.000-voudig in vergelijking met ongedifferentieerde SER...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Op dit moment gebruikt differentiatie protocollen zelden tot 100% gedifferentieerde cellen. Om redenen die nog moeten worden aangepakt sommige cellen weerstaan ​​aan de differentiatie proces. Afhankelijk van de efficiëntie van de gebruikte differentiatie protocol en de neiging van het ESC lijn een aantal residuele pluripotente cellen worden vaak waargenomen, zelfs na differentiatie in de definitieve endoderm. Deze resterende cellen kunnen stroomafwaarts differentiaties of verdere analyse, zoals transcriptomics, proteomi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De bekwame technische bijstand van Jasmin Kresse is dankbaar erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hues8 humane embryonale stamcellenlijnHarvard Department of stem cell & regeneratieve biologieGeschikt celtype voor endoderm generatie
Hes3 humane embryonale stamcellenlijnES Cell InternationalGeschikt en robuust celtype voor endoderm generatie
mTeSR1Stemcell Technologies5850ESC kweekmedium
FCSBiowestS1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4)-APC, humaanMiltenyi Biotec130-098-357
anti-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109magnetisch veld
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ROCK remmer
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activine APeprotech120-14
Gentle Cell Dissociation ReagentStemcell Technologies7174Enzymevrije passageoplossing, alternatief: Trypsin/EDTA
Matrigel*Corning354277bazale membraanmatrix
* los op en bewaar in aliquoten bij -80 °C zoals beschreven in de handleiding van de leverancier. Bij gebruik, ontdooi op ijs, verdun in 25 ml ijskoud knockout DMEM/F-12.
Voeg 1 ml toe aan elke put van een 6-welplate en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
Verwijder de matrigel en gebruik onmiddellijk.
MS ColumnsMiltenyi Biotec30-042-201
MACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Human FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaagtggaggtctggtt		Life Technologies
Human GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan assayApplied BiosystemsHs00751752_s1
Human SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Life Technologies
Human SOX7 REV
tgcgcggccggtacttgtag		Life Technologies
Human POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggagg		Life Technologies
Human POU5F1 REV
ctgcagtgtgggtttcgggca		Life Technologies
Human Nanog FW
ccgagggcagacatcatcc		Life Technologies
Human Nanog REV
ccatccactgccacatcttct		Life Technologies
Human TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		Life Technologies
Human G6PD REV
cga tga tgc ggt tcc agc cta t 		Life Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R&D SystemsAF1924

Referenties

  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
  3. Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet. Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
  4. Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
  5. Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286(2009).
  6. Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
  7. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  8. Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
  9. Kim, P. T., Ong, C. J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).
  10. Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
  11. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  12. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  13. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  14. Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
  15. Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
  16. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29(2011).
  17. Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
  18. Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), 17536(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zuivering van endodermcellenCXCR4 positieve cellenmagnetische kraal separatiedifferentiatie naar definitief endodermflowcytometrie analysecoating met basaalmembraansupplementatie met ROCK inhibitorceloppervlaktemarkerendoderm inductiemedium

Gerelateerde artikelen