Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time monitoring van de intracellulaire Bile Acid Dynamics Met behulp van een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde Bile Acid Sensor

9.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53659

⸱

4 januari 2016

 ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

In dit artikel

Samenvatting

We bieden een gedetailleerd protocol om galzuurdynamiek in levende cellen te bestuderen met behulp van een genetisch gecodeerde BAS FRET-sensor. Deze Galzuursensor vertegenwoordigt een uniek hulpmiddel om (regulatie van) galzuurtransport en FXR-activering in een breed scala aan celtypen te bestuderen.

Samenvatting

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is een krachtig hulpmiddel geworden voor het monitoren van eiwitvouwing, -interactie en -lokalisatie in enkele cellen. Biosensors die werken volgens het FRET-principe hebben real-time visualisatie van subcellulaire signaalgebeurtenissen in levende cellen mogelijk gemaakt met hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Hier beschrijven we de toepassing van een genetisch gecodeerde Bile Acid Sensor (BAS) die bestaat uit twee fluoroforen gefuseerd aan het farnesoïde X receptor ligand binding domein (FXR-LBD), waardoor een galzuursensor wordt gevormd die kan worden geactiveerd door een groot aantal galzuur soorten en andere (synthetische) FXR liganden. Deze sensor kan op verschillende cellulaire compartimenten worden gericht, inclusief de kern (NucleoBAS) en cytosol (CytoBAS) om galzuurconcentraties lokaal te meten. Het maakt snelle en eenvoudige kwantificering mogelijk van cellulaire galzuurinstroom, -uitstroom en subcellulaire verdeling van endogene galzuren zonder de noodzaak voor labelen met fluorescente tags of radionuclei. Verder kunnen de BAS FRET sensoren nuttig zijn voor het monitoren van FXR ligand binding. Ten slotte laten we zien dat deze FRET biosensor kan worden gecombineerd met beeldvorming van andere spectraal verschillende fluoroforen. Dit maakt gecombineerde analyse mogelijk van intracellulaire galzuurdynamiek en i) lokalisatie en/of abundantie van eiwitten van belang, of ii) intracellulaire signalering in een enkele cel.

Inleiding

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) wordt veel gebruikt om een beter begrip van cellulaire functies in levende cellen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie 1 te krijgen. In FRET wordt energie uit een aangeslagen donorfluorofoor overgebracht naar een acceptor fluorofoor. FRET efficiëntie is sterk afhankelijk van de afstand tussen de donor en acceptor fluorofoor en de oriëntatie en derhalve gevoelig uitlezing van conformationele veranderingen die de twee fluoroforen beïnvloeden. Dit verschijnsel wordt benut om FRET-gebaseerde biosensoren voor de beeldvorming van kleine moleculen te genereren. Veranderingen in de concentratie kan worden gevolgd zoals toename / afname van de verhouding van de emissie-intensiteit van de acceptor ten opzichte van de donorfluorofoor 2. Bijvoorbeeld, FRET-gebaseerde biosensoren calcium zorgen voor een snelle en stabiele detectie van vrij calcium concentraties in levende cellen 3. Andere voordelen van FRET-gebaseerde biosensoren worden beeldvorming in enkele levende cellen, topvolger non-invasieve, hun vermogen om te worden gericht op verschillende celtypen en cellulaire compartimenten 4.

Vele aspecten van intracellulaire galzuur dynamiek steeds slecht begrepen. Bijvoorbeeld, is er weinig bekend over het mechanisme onderliggende regelgeving van geconjugeerde en niet-geconjugeerde galzuurtransport. Bestaande technieken volgen dit transport gebruik van luciferase gebaseerde reporters, radioactief gemerkte galzuren of fluorescente analogen primair galzuur maken. De laatste vereist modificatie van galzuren, mogelijk waardoor hun eigenschappen. Luciferase gebaseerde reporters hebben een slechte tijd resolutie. Bovendien zijn deze technieken leiden tot verlies van het monster en niet van toepassing voor beeldvorming in enkele cellen. Daarom zou het gunstig zijn methoden die levende cel imaging transportactiviteit toestaan ​​via FRET biosensoren gebruiken, vooral omdat het ook de voordelen van ratiometrische detectie 5, 6. Terwijl varianten van CFP / YFP vorm meest gebruikte FRET paren nieuwe strategieën gebruiken Morange en mCherry dragen zelfassociatie-inducerende mutaties hebben geleid tot een uitbreiding van de FRET toolbox met nieuwe sensoren, waaronder een rood-verschoven galzuur sensor 7.

We eerder een genetisch gecodeerde FRET galzuur sensor (BAS), dat bestaat uit een donor fluorofoor (cerulean) en een acceptor fluorofoor (citroengeel) die zijn gefuseerd met farnesoid X receptor (FXR) ligandbindingsdomein (FXR-LBD) en een peptide dat een LXXLL-motief 8. Dit peptide associeert met de FXR-LBD in een galzuur-afhankelijke wijze. Bij FXR activering, zal de afstand tussen citrien en cerulean veranderen als gevolg van een conformationele verandering. In zoogdiercellijnen, FXR activatie resulteert in een duidelijk detecteerbare stijging van de citroengeel / cerulean verhouding, terwijl de gezuiverde sensor werkt in de tegengestelde richting leidt tot een verminderde FRET verhouding van FXR activatie. Deze sensor (CytoBAS)zorgt voor de opvolging van cytosolische galzuur dynamiek. Door carboxyluiteinde toevoeging van subcellulaire targeting motieven, kan het BAS construct gericht naar de kern (NucleoBAS) en peroxisomen (PeroxiBAS), waardoor metingen van galzuur concentraties in verschillende cellulaire compartimenten. Hoewel de toevoeging van de peroxisomale targeting motief niet responsiviteit afbreuk aan galzuren leverde celpermeabel FXR-liganden induceerde enige FRET veranderingen PeroxiBAS binnen peroxisomen 8. Aangezien de aard van deze discrepantie is niet bekend, het protocol hieronder is gericht op CytoBAS en NucleoBAS.

Het gebruik van deze genetisch gecodeerde FRET sensor werd onlangs aangetoond in cellen die de hepatische galzuur transporters Na + / taurocholaat co-transporterende polypeptide (NTCP) en organische opgeloste stof transporter alpha / beta (OSTαβ) 8. NTCP is het belangrijkste lever galzuren importeur en OSTαβ is een basolaterale intestinale galacid transporter dat zowel kan functioneren als een importeur en exporteur afhankelijk van de elektrochemische galzuurconcentratie gradiënt 9, 10. Recente gegevens toonden aan dat bij galzuur transport door NTCP en / of OSTαβ, robuuste en snelle responsen in FRET verhouding als gevolg van ligand-FXR-LBD interactie kan worden waargenomen.

Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor methoden om FRET te meten, zoals confocale microscopische analyse en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), markeert kritische stappen, aan te pakken en potentiële problemen te bespreken alternatieve methoden. Met deze genetisch gecodeerde FRET sensor, kunnen galzuur interactie met FXR-LBD gekwantificeerd en gecontroleerd direct in levende cellen en verschaft een snelle en eenvoudige wijze van galzuur transport en dynamiek visualiseren in real-time. Zoogdierlijke expressieplasmiden die coderen CytoBAS NucleoBAS en zijn commercieel verkrijgbaar. Daarom kan deze biosensor verder bijdragen aan debegrip van galzuur transporters of verbindingen die FXR activeert en een dieper inzicht in galzuur biologie en signalering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Tijdelijke transfectie

Opmerking: CytoBAS en NucleoBAS (Zie Materialen tabel) worden met succes toegepast in verschillende celtypes, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK en HEK293T cellen). De belangrijkste vereiste voor de sensor is dat moet worden uitgedrukt, waarbij het coderende DNA aan de cel voeren.

  1. Oogst cellen uit een 80% confluente 25 cm2 kolf. Verdun de cellen in compleet cultuurmedium geschikt voor de specifieke cellijn (10% FBS, 1% L-glutamine, 1% pen / strep voor U2OS en Huh7 cellen).
  2. Plaat cellen op de gewenste dichtheid in een steriele 8 goed chambered dekking van glas (0,8 cm 2). Streven naar een sub-confluente (60-80% samenvloeiing) laag van cellen op de dag van het experiment, hoewel dit niet essentieel.
  3. Voeg compleet cultuurmedium tot een eindvolume van 400 pl per putje. Laat cellen hechten gedurende 24 uur.
  4. Bereid de transfectie mix in een steriele buis door toevoeging van 0,5 ug NucleoBASof CytoBAS DNA tot 100 ul kweekmedium (serum / antibioticum gratis). Vortex goed. Voeg een transfectiereagens en meng door vortexen. Transfectiereagentia dat een optimale efficiëntie te geven zijn celtype afhankelijk en kunnen voorafgaande testen nodig.
    1. Gebruik bijvoorbeeld 2,5 pl 1 mg / ml polyethyleenimine (PEI) en incubeer de DNA / PEI meng gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Voeg de transfectie mengsel in druppeltjes om de cellen en meng door voorzichtig schudden van de wells plaat met de hand. Voeg 100 ul van het mengsel naar een goed van ~ 9,6 cm 2. Gebruik 10 ul van het transfectiemengsel individuele beeldvormende detector voor tijdelijk getransfecteerde cellen.
    Opmerking: Na 24-48 uur wordt de cellen galzuur sensor expressie en kan worden gebruikt voor experimenten.

2. Stabiele Transfectie

  1. Oogst cellen uit een 80% confluente 25 cm2 kolf. Verdun pellet in compleet cultuurmedium geschikt voor de specifieke cellijn (10% foetaal Serum, 1% L-glutamine, 1% pen / strep voor U2OS en Huh7 cellen) tot een concentratie van 150.000 cellen per ml en voeg ongeveer 300.000 cellen per putje in een 6-well kweekplaat (2 ml eindvolume).
  2. Laat cellen hechten gedurende 24 uur.
  3. Bereid de transfectie mix in een steriele buis door het toevoegen van 0,5 ug CytoBAS of NucleoBAS DNA (Zie Materialen tabel) tot 100 pi kweekmedium (serum / antibioticum gratis). Vortex goed. Voeg een transfectiereagens en meng door vortexen.
    1. Gebruik bijvoorbeeld 2,5 pl 1 mg / ml polyethyleenimine (PEI) en incubeer de DNA / PEI meng gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Voeg 100 ul van de transfectie mengsel in druppeltjes om de cellen en meng door voorzichtig schudden van de wells plaat met de hand. Omvatten altijd ongetransfecteerde controle bij het creëren van een stabiele cellijn.
  5. Kweek cellen O / N bij 37 ° C, 5% CO2.
  6. Trypsinize cellen volgens het protocol van de fabrikant (Incubeer de cellen bij 37 ° C wi 1,5 ml voorverwarmde trypsine per 25 cm 2 celkweek) en draaien ze neer op 250 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 13 ml compleet cultuurmedium. Verdeel cellen over verschillende 10 cm diameter cultuur gerechten: 0,5 ml (lage dichtheid), 1,5 ml (medium density), en 4,5 ml (hoge dichtheid). Doe hetzelfde voor de resterende 6,5 ml.
  7. Voeg kweekmedium tot een eindvolume van 10 ml. Voor U2OS cellen gebruiken 800 ug / ml G418 voor plasmiden met neomycineresistentiecassette zoals CytoBAS en NucleoBAS constructen te selecteren op positieve cellen. Deze concentraties celtype afhankelijk en kan worden bepaald door het selecteren van de laagste antibioticum (G418) concentratie wanneer getransfecteerde cellen stierven binnen 2 tot 10 dagen (800 ug / ml G418 voor U2OS cellen).
  8. Vernieuwen het kweekmedium met de juiste antibiotica (G418) om de 72 uur, tot de niet-getransfecteerde cellen zijn dood.
  9. Onderzoek de cultuur plaat onder de microscoop met een 20X doelstellingpositieve kolonies (fluorescentie kan worden gecontroleerd met behulp van de meeste filter sets gebruikt voor groen, cyaan of geel fluorescentie).
  10. Markeren de positieve kolonies die geïsoleerd liggen uit andere kolonies met een pen aan de buitenkant bodem van de cultuur schotel.
  11. Was de plaat tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en zuig het. Rond 15 steriel klonen cilinders en dompel ze in steriele siliconen. Solliciteer ze rond de geselecteerde kolonies door licht te drukken tegen de petrischaal en zorg ervoor dat niet meer dan een kolonie is opgenomen in het klonen ring.
  12. Pipetteer 20 ul voorverwarmde trypsine (1x, 0,25%) in de klonering cilinder en incubeer bij 37 ° C totdat de meeste cellen zijn afgerond (observeren met een microscoop).
  13. Voeg 150 ul kweekmedium met serum en het geschikte antibioticum (10% FBS en 800 ug / ml G418 voor U2OS en Huh7 cellen) in de klonering cilinder en pipet op en neer meerdere malen om de cellen te resuspenderen en overbrengen in een 96-well plaat. Vernieuwen medium na 4-24 uur en laat cellen samenvloeiing groeien in de komende dagen (37 ° C, 5% CO 2 voor U2OS en Huh7 cellen).
  14. Vernieuwen medium met antibiotica om de 3 of 4 dagen. Wanneer de cellen zijn gegroeid confluent, overbrengen naar een groter goed plaat. Herhaal deze stap totdat de kweek is groot genoeg voor experimenten. Cryopreserve enkele flacons voor back-up. Cryopreservatie medium bestaat uit 20% FBS en 20% DMSO in medium (DMEM) zonder supplementen.
    Opmerking: Nu, de cellijn is monoklonale en beschouwd stabiel voor het uitdrukken van de Bile Acid Sensor. De helft van de concentratie van het antibioticum G418 (400 ug / ml) is nu voldoende is om expressie in de stabiele cellijn te handhaven.

3. Lentivirale Transduction

Opmerking: Sommige cellijnen zijn moeilijk geacht transfecteren met meer traditionele werkwijzen zoals polyethyleenimine (PEI) methode. Virale transductie van cellen is een efficiënt alternatief instrument fof gen-aflevering en stabiele transgenexpressie.

  1. Oogst cellen uit een 80% confluente 25 cm2 kolf. Verdun de cellen in compleet cultuurmedium geschikt voor de specifieke cellijn (10% FBS, 1% L-glutamine, 1% pen / strep voor U2OS en Huh7 cellen) en voeg ongeveer 200.000 cellen per putje in een 6-well kweekplaat.
  2. Voeg kweekmedium tot een eindvolume van 2 ml per putje. Laat cellen hechten gedurende 24 uur.
  3. Voeren virale transducties door incubatie cellen voor 4-6 uur met 500 pi CytoBAS lentivirus medium (op aanvraag) die gevuld tot een totaal bedrag van met volledig kweekmedium 1 ml met 10 ug / ml diethylaminoethyl (DEAE) -dextran of een andere lentivirale transductie enhancer. Vergeet niet om een ​​goed met niet getransduceerde controle cellen bevatten.
  4. Verwijder medium en voeg 2 ml compleet kweekmedium dat het gewenste antibioticum (500 ug / ml hygromycine). Gebruik een lentivirale construct voor CytoBAS transductie die voorziens hygromycine resistentie aan cellen. Groeien cellen onder gewenste omstandigheden.
  5. Vernieuwen medium met (500 ug / ml hygromycine) antibiotica om de 3 dagen en de splitsing van de cellen bij 80% confluent, totdat alle negatieve controle cellen zijn dood (duurt ongeveer 1-2 weken voor de meeste cellijnen). De cellijn wordt nu beschouwd als stabiel voor het uitdrukken van de Bile Acid Sensor.
    1. Of gebruik cellen voor experimenten 1-3 dagen na virale transductie. Als levend virus aanwezig zou kunnen zijn, vereist dit FRET-uitlezing apparatuur in ruimtes met de juiste veiligheidsniveau.
  6. Als alternatief voor de snelle isolatie van stabiele cellijnen te voeren fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
    1. Oogst cellen uit confluente 160 cm2 kolf.
    2. Verdun de cellen in kweekmedium Leibovitz (L-15 medium) met <5% serum tot een concentratie van maximaal 5 x 10 6 cellen per ml
    3. Voor het verzamelen van de gesorteerde cellen, vul FACS buizen met 1 ml van de collectie medium (L-15 medium + 1,5% pen / strep, 1% L-glut en 20% serum).
    4. Soort cellen voor citrien (520-580 nm) of cerulean (450-520 nm), enthousiast met 405 laser.
    5. Na het sorteren ongeveer 500.000 cellen, spin down-cellen (5 min, 250 x g) en resuspendeer ze in 5 ml normale compleet kweekmedium (10% FBS, 250 ug / ml Hygromycine voor U2OS en Huh7 CytoBAS cellen) en de plaat ze in een T25 cultuur kolf. Kweek de cellen onder gewenste omstandigheden (37 ° C, 5% CO2 gedurende U2OS en Huh7 cellen).

4. Live-cell imaging van de Bile Acid Sensor

Opmerking: Cellen die galzuur transporters kunnen gekweekt in medium met 1-10% houtskool gefiltreerd serum dat lipofiele stoffen te verwijderen. Normaal serum bevat vaak galzuren die kunnen leiden tot intracellulaire accumulatie galzuur en verzadiging van de Bile Acid sensor.

  1. FRET metingen met de confocale microscoop
    1. Plaat de cellen stabiel of Transiently uiting van de sensor op de gewenste dichtheid in een steriele 8 goed dekglaasje bodem kamer slide (0,8 cm 2). Groeien cellen in compleet cultuurmedium (met houtskool gefilterd serum) dat op de dag van het experiment confluentie is ongeveer 60-70%.
    2. Was de hechtende cellen in de kamer slide een keer met 200 ul 1x PBS of Leibovitz L-15 kweekmedium.
    3. Aspireren en vervangen door 300 gl Leibovitz L-15 kweekmedium zodat geen CO 2 controle nodig.
      Opmerking: DMEM zonder fenolrood kan ook worden gebruikt, maar vereist CO 2 gebufferde omstandigheden. Het galzuur sensor shows (sommige) pH-gevoeligheid zodanig beogen de pH constant tijdens de dataverzameling houden.
    4. Verdun de verbindingen voor gebruik in de confocale beeldvormende experiment ook L-15 kweekmedium. Rekening mee dat tijdens beeldvorming, betrekkelijk grote hoeveelheden vloeistof in de kamers moeten worden toegevoegd om een ​​snelle vermenging van het monster (50-100 ui) verzekeren,dus zorg 3-5x oplossingen.
    5. Start de imaging software van een confocale microscoop met een 37 ° C incubatiekamer en zet de violette 405 nm laser. Doe een druppel immersie olie op het doel en de plaats van de 8-kamer op de top van het. Voor enkele cel beeldvorming van FRET, gebruik maken van de 63x olie doelstelling. De sensor is met succes gebruikt bij KT, maar celgedrag zouden kunnen worden gewijzigd.
    6. Zet de instellingen van de confocale microscoop goed.
      1. Stel Acquisitie modus: XYT (time-lapse beeldvorming van enkele focal plane).
      2. Acquire beelden bij 20 sec intervallen om verbindingen toe te voegen tussen de overnames zonder te pauzeren het experiment.
      3. Stel spectrale bereik voor emissie-detectie: Cerulean: 450-520 nm; Citrien: 520-580 nm.
    7. Focus op de enkele cel laag met behulp van transilluminatie licht. Start beeldvorming en de z-positie nauwkeuriger regelen. Pas gain en offset voor elk kanaal om het signaal te onderscheiden van de achtergrond, terwijl blijvening ver onder verzadiging voor alle pixels in cellen van belang.
    8. Teken cirkels om het gebied van belang (ROI) te bepalen. Selecteer cellen die vergelijkbare fluorescentie-intensiteit vertonen. Vermijd cellen die duidelijk afwijken van de gemiddelde cel grootte en vorm. Blootstellen van de cellen aan licht van een zo kort mogelijk fotobleken van de sensor te minimaliseren. Het is raadzaam om ROI niet dichtbij de cel perimeter trekken. Dit gebied is het meest gevoelig voor veranderingen in fluorescentie-intensiteit als gevolg van focale drift (cellen bewegen in z-richting) waardoor het moeilijker om veranderingen in fluorescentie verhouding tijdens het experiment te volgen.
    9. Begin metingen met de confocale microscoop. Wacht totdat de cerulean en citrien fluorescentie is stabiel.
    10. Voeg 50-100 ul galzuren of andere verbindingen op gekozen tijdstippen tijdens de meting. De relatief grote hoeveelheden vloeistof (een vijfde tot een derde van het uiteindelijke volume) moeten de vloeistoffen goed te mengen (binnen 10 seconden) zijn zonder schudden / pipetting omhoog en omlaag. Zorg ervoor dat de rand van de 8-well kamer met de pipetpunt niet aan te raken en voeg de vloeistof langzaam, zodat de cellen niet uit de focus. Geen nieuwe verbindingen niet toe te voegen voordat het plateau fase is bereikt. Dit duurt ongeveer 200 sec.
    11. Eindigen elk experiment met de toevoeging van 100 ul GW4064, eind concentratie 5-10 micrometer (sensor verzadigende dosis) en wacht tot de sensor fluorescentie stabiel is.
    12. Sla het experiment en de gegevens exporteren als een AVI-bestand.
    13. Open in ImageJ beide AVI-bestanden (kanaal 00, cerulean, kanaal 01, citroengeel) door het selecteren Plugins> Stapels> Stapel interleaver. Als alternatief, import confocale bestand (bijv .lsm of .lif bestanden) direct in Afbeelding J met behulp van geschikte plug-ins (beschikbaar op http://www.openmicroscopy.org) en ga naar stap 4.1.14.
      1. Voor Stack 1: gebruik Channel 01 (citrien).
      2. Voor Stack 2: gebruik Channel 00 (cerulean).
    14. Klik op Bewerken> Selectie> Addtot manager, om de ROI manager te openen. Controleer de checkbox 'Show All'.
    15. Trek een paar regio's van belang (ROI) voor specifieke cellen met de ovale selectie tool. Ook trekt een cirkel in een gebied buiten de cellen of in een cel die de sensor niet te betuigen aan de achtergrond signaal te bepalen. Het is raadzaam om ROI niet vlakbij de cel perimeter in experimenten trekken wanneer veranderingen in fluorescentie-intensiteit als gevolg van focale drift (cellen bewegen in z-richting) of celmigratie waren duidelijk.
    16. Selecteer één cel. Klik op Plugins> Ratio Profiler. Dit resulteert in 3 schermen: RAW, ratio en Ratio_Profile. De RAW-venster toont de toename van de intensiteit van de citrien (blauwe lijn) en een daling van cerulean (rode lijn) als er FRET. De verhouding venster geeft informatie over de verhouding citroengeel / cerulean, die toeneemt met een toename van FRET. Het venster Ratio_Profile geeft de werkelijke aantallen van fluorescentie-intensiteit gemeten in beide kanalen. Als Microsomgaan setup-specifieke bestanden (bijvoorbeeld .lsm of .lif plaats van AVI) bestanden worden gebruikt het kanaal volgorde kunnen worden teruggedraaid.
    17. Kopieer de gegevens van het raam Ratio_Profile in de spreadsheet bijgevoegd als aanvullende data. Doe hetzelfde voor alle andere cellen (en achtergrond ROI).
      Opmerking: In de online spreadsheet alle gegevens genormaliseerd naar de toestand waarbij BAS maximale activering wordt verwacht. Aangezien GW4064 is de meest potente activator van FXR, wordt de fluorescentieverhouding na incubatie met een overschot van GW4064 ingesteld op 1. Daarom is het belangrijk om alle experimenten eindigen met toevoeging van GW4064. Het voordeel hiervan is dat de gegevens niet langer afhankelijk laserintensiteit of detector versterking en experimenten op verschillende dagen kan gemakkelijker worden vergeleken. Bovendien, in de onderste grafiek van de spreadsheet, een lopend gemiddelde kan worden gebruikt om de curven voor experimentele noise glad. Echter, deze grafiek niet gebruiken bij het analyseren van kinetische gegevens, omdat de lopende AveraGE zal ook glad snel kinetische reacties.
  2. FRET metingen met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)
    1. Verdun alle verbindingen voor de FACS experiment in steriele FACS opname buffer (0,3 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,01% NaN3 en 10 mM D-glucose).
    2. Oogst cellen uit een 80% confluente T-160 cm 2 celkweek kolf gebruikt 5 mM EDTA in PBS. Centrifugeer cellen bij 250 g gedurende 5 min. Was celpellet 2 x in 5 ml FACS-buffer bij kamertemperatuur opname.
    3. Tellen cellen met behulp van de kouter balie of een telkamer.
    4. Verdun pellet in FACS opnamebuffer tot een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. Pipet op en neer om een ​​homogene suspensie van individuele cellen te creëren. Als cellen zijn moeilijk te splitsen, zet de monsters door een cel zeef vóór sortering aan nozzle verstoppingen te minimaliseren.
    5. Pipet 200 pi cellen per FACS buis en hen te beschermen tegen licht.
    6. Voeg de gewenste concentratie van de verbinding (bv, Galzuren, synthetische FXR liganden transporter inhibitors). Vortex. Incubeer 20-30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden (in het donker).
    7. Ondertussen start de FACS (de lasers hebben tijd nodig om op te warmen).
    8. Stel de flowcytometrie gating parameters van het experiment (zie figuur 3):
      1. Laden rond 100,000-200,000 NucleoBAS of CytoBAS getransfecteerde cellen om de poorten te bepalen.
      2. Stel eerst de FSC en SSC spanningen aan de cellen plot in het midden van het perceel.
      3. Met behulp van de violette laser, pas de cerulean (450/40 nm) spanning en citrien (525/20 nm) spanning en ervoor zorgen dat alle NucleoBAS of CytoBAS positieve cellen worden uitgezet binnen de scatter plot.
      4. Stel de juiste poorten (Poort P1 tot P4 Poort), zie Figuur 4.
        1. Gebruik poort P1 om dode cellen, meestal weergegeven in de linker benedenhoek te sluiten door het selecteren van de belangrijkste bevolking in het midden van het SSC-A / FSC-A plot.
        2. Gebruik poort P2 inhet FSC-H / FSC-A venster duplets uit de analyse te verwijderen. Enkele cellen worden gepresenteerd in een diagonale lijn dan wambuizen.
        3. Poort P3 in de citrien (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) venster kan worden gebruikt om positieve cellen te selecteren voor NucleoBAS / CytoBAS door gating citrien en Cerulean hoge cellen, toonde een populatie diagonaal in de rechterbovenhoek van Het plot.
        4. Trekken poort P4 in de linkerbovenhoek van de bevolking, zo dicht mogelijk en zorg ervoor dat niet meer dan 5% van de cellen binnen deze poort vallen.
      5. Laden sommige ongetransfecteerde cellen (geen expressie van CytoBAS of NucleoBAS) om auto-fluorescentie te bepalen. De ongetransfecteerde bevolking kan zich niet in de poort P3. Pas poort P3 wanneer dat nodig is om auto-fluorescerende cellen uit te sluiten.
    9. Vortex de monsters voordat u de buizen in de FACS. Voor elk monster te meten ten minste 10.000 cellen in de poort P3.
      Opmerking: De Bevolking Hiërarchie venster geeft het aantal gebeurtenissenwordt weergegeven voor elke poort en% van de ouder gate. In gate 4, het% van de ouder bepaalt cellen met verhoogde citrine / cerulean als percentage van NucleoBAS positieve cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De FRET-BAS sensor weergegeven is gebaseerd op de ligand-bindende domein van FXR (LBD-FXR) bevestigd aan twee fluoroforen citrine en cerulean) en een LXXLL-motief. Deze sensor maakt onderzoek naar galzuur transport in levende cellen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie (Figuur 1 A). Mutaties in cerulean en citrien toegepast om de vorming van de intramoleculaire complex (figuur 1 B)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een nieuwe genetisch gecodeerde galzuur sensor voor de controle van de spatiotemporele dynamiek van galzuur transport in levende cellen. Deze biosensor bestaat uit hemelsblauw en citroengeel fluorescente eiwitten die zijn gefuseerd aan FXR-LBD, waardoor een FRET-gebaseerde galzuur sensor (BAS) vormen.

Het galzuur sensor is relatief eenvoudig en gemakkelijk in gebruik wanneer dat algemene ervaring met celkweek en FACS of (con...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door ERC startsubsidies (ERC-2011-StG 280255 en ERC-2013-StG 337479) en door de Nederlandse Organisatie voor Gezondheidsonderzoek en Ontwikkeling (Vidi 91713319).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CytoBAS Addgene62860
NucleoBAS Addgene62861
Dulbecco's modified Eagles media (DMEM)LonzaBE12-614FHoge glucose zonder L-glutamine
Penicillin-Streptomycin (pen/strep)Lonza17-602E
L-glutamine (200mM)Lonza17-605E
Fetal Bovine Serum (FBS)Invitrogen102-70
Trypsin-EDTA (10x)LonzaCC-5012
T-25 celcultuurflaconVWR international392-0253Laminine gecoat
T-175 celcultuurflaconVWR international392-0238Laminine gecoat
6-well plateVWR international734-0229Poly-L-lysine en Laminine gecoat
10 cm schaalVWR international392-0243Laminine gecoat
Diethylaminoethyl (DEAE) - DextranSigma-AldrichD9885
Polyethylenimine (PEI) Brunschwig23966-2
G418 (geneticine) 50 mg/mlInvitrogen10131-027
Hygromycin B, 50 mg/mlInvitrogen10687-010
Kloneringscilinder (6 x 8 mm)Bellco2090-00608
L-15 Leibovitz cultuurmediumInvitrogen21083-027Geen fenol rood
Polystyreen ronde bodembuis (5 ml) Facs buisFalcon BD352008Geen dop, niet-steriel
Falcon 2,063 buizen (5 ml)Falcon BD352063Klikdop, steriel
Nunc Lab-Tek 8 well coverglassThermo scientific155409Steriel
Koolstof gefilterd FBSLife technologies12676011
GW4064Sigma-AldrichG5172
TCDCASigma-AldrichT6260
CDCASigma-AldrichC9377
Overige chemicaliënSigma-Aldrichn.v.t.

Referenties

  1. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
  2. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  3. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  4. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  5. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  6. Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
  7. Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
  8. van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
  9. Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
  10. Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
  11. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170(2011).
  12. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  13. Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

FRET-beeldvorminggenetisch gecodeerde sensorFXR-ligandbindingconfocale microscopielive-cell imagingCerulean Citrine FRETsubcellulaire lokalisatiegalzuurtransport
Real-time monitoring van de intracellulaire Bile Acid Dynamics Met behulp van een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde Bile Acid Sensor
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.