Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Samenvatting

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Samenvatting

Ons laboratorium heeft onlangs aangetoond dat natuurlijke killer (NK) cellen in staat zijn het uitroeien orthotopically geïmplanteerde muizen GL26 en rat CNS-1 maligne glioom kort na intracraniale enting als de kankercellen deficiënt zijn weergegeven in hun expressie van de β-galactoside-bindende lectine galectine -1 (gal-1). Meer recent werk toont nu dat een bevolking van Gr-1 ⁺ / CD11b ⁺ myeloïde cellen is cruciaal voor dit effect. Om een ​​beter inzicht in de mechanismen waarmee NK- en myeloïde cellen samen om gal-1-deficiënte tumor afstoting verlenen we hebben een uitgebreid protocol voor de isolatie en analyse van glioma-infiltrerende perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) ontwikkeld. De werkwijze wordt hier aangetoond door PBMC infiltratie in de tumor micro-omgeving van gal-1-expressie GL26 gliomen met die rendered gal-1-deficiënte via shRNA knockdown. Het protocol begint met een beschrijving van hoe de cultuur en voor te bereiden GL26 ceLLS voor enting in de syngene C57BL / 6J muis hersenen. Het verklaart vervolgens de stappen die betrokken zijn bij de isolatie en flowcytometrische analyse van glioom infiltreren PBMC's uit het begin van de hersenen tumor micro. De werkwijze is aanpasbaar aan een aantal in vivo experimentele modellen waarin temporele gegevens immune infiltratie in de hersenen vereist. De werkwijze is gevoelig en zeer reproduceerbare, zoals glioom-infiltrerende PBMCs worden geïsoleerd uit intracraniale tumoren 24 uur na tumor implantatie met gelijke waargenomen vanaf tijdstip afgestemd tumoren gedurende onafhankelijke experimenten celtellingen hoogte. Eén experimentalist kan de werkwijze van hersenen oogst tot cytometrische analyse van glioma infiltrerende PBMCs stromen ongeveer 4-6 uur afhankelijk van het aantal te analyseren monsters. Alternatieve glioma modellen en / of cel-specifieke detectie antilichamen kunnen eveneens worden gebruikt ter beoordeling van experimentalisten om de infiltratie van een aantal andere immun beoordelene celtypen van belang, zonder de noodzaak voor wijziging van de algemene procedure.

Inleiding

Gliomen zijn een klasse van neuro hersenkanker voortvloeien uit getransformeerde glia binnen het centrale zenuwstelsel (CZS). Van alle gliomen, World Health Organization (WHO) graad IV glioma of glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende en dodelijke ^1. GBM is zeer ongevoelig is voor de huidige standaard-of-care bestaat uit tumorresectie zoveel mogelijk gevolgd door bestraling plus gelijktijdige en adjuvante chemotherapie met temozolomide ^2. Deze dodelijke vormen van kanker dragen een sombere prognose slechts 15-18 maanden van overleving vanaf het moment van de initiële diagnose slechts 5% van de patiënten overleven van de ziekte na 5 jaar ^....

Protocol

Let op: Lees de gehele protocol voor het uitvoeren van experimenten. Goedkeuring voor het gebruik van gewervelde dieren van de juiste institutionele commissie over het gebruik en het welzijn van dieren moeten voorafgaand aan de procedure worden verkregen.

1. Bereiding van tumorcellen voor Intracranial Engraftment

1. Werken in een klasse II biologische veiligheid kabinet, beginnen met de voorbereiding van GL26-Cit-NT / gal1i celcultuurmedia door aanvulling van een fles van 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% steriel gefiltreerd hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS ), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penic....

Resultaten

De volgende gating strategie wordt gebruikt voor een typisch experiment: FSC-A vs. SSC-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. count → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. tellen. Gates geplaatst Gr-1 ⁺ / CD11b ⁺ myeloïde cellen en NK1.1 ⁺ NK-cellen worden vervolgens gestratificeerd op basis GzmB expressie (Figuur 5A). Backgating die cellen geïdentificeerd als NK1.1 ⁺ NK-cellen en Gr-1 ⁺ / CD11b ⁺ myeloïde cellen in onze experimenten op FSC.......

Discussie

Dit protocol beschrijft een robuuste en reproduceerbare werkwijze voor het isoleren en flowcytometrische analyse van PBMC die de vroege muizenhersenen tumor micro geïnfiltreerd. Glioom celsuspensies worden gegenereerd in een concentratie die door de experimentator die stereotactisch worden geënt in het striatum van de hersenen van muizen. Muizen worden vervolgens gedood op vooraf bepaalde tijdstippen gespecificeerd door het experimentele ontwerp en hun hersenen worden geoogst en verwerkt tot glioma infiltreren PBMCs die.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco’s Modification of Eagles Medium	Gibco	12430-054	met 4,5 g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES en fenolrood
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline	Gibco	14190-144	zonder calciumchloride of magnesiumchloride
Fetal bovine serum	Omega Scientific Inc.	FB-11
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	10.000 U/ml Penicillin; 10.000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM
G418 sulfate	Omega Scientific Inc.	GN-04
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P8833	van Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternatief	Thermo Scientific	SV30030.01	in DPBS met EDTA
Phase contrast hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	0,1 mm diep
Trypan blauw kleurstof	Gibco	15250-061
Steriele 0,9% NaCl injectie, USP	Hospira	NDC: 0409-4888	10 ml flacons
0,6 ml conische polypropyleenmi microtubes	Genesee Scientific	22-272
Atipamezole hydrochloride injectie	Orion Pharma	NDC: 52483-6298	5 mg/ml oplossing
Ketamine hydrochloride injectie	Fort Dodge	NDC: 0409-2051	100 mg/ml oplossing
Dexmedetomidine hydrochloride injectie	Zoetis	NDC: 54771-2805	0,5 mg/ml oplossing
Xylazine hydrochloride injectie	Lloyd	NDC: 61311-481	100 mg/ml oplossing
Carprofen injectie	Pfizer	NDC: 61106-8501	50 mg/ml oplossing
Buprenorfine hydrochloride injectie	Reckitt Benckiser	NDC: 12496-0757	0,3 mg/ml ampullen
1 ml tuberculine spuiten	Covidien	8881501400
26G x ½ (0,45 mm x 13 mm) spuitnaalden	BD	305111
Chirurgische knipschaar	3M	9661
Providoon-jood oplossing	Aplicare	82-217	NDC: 52380-1905
Steriele petrolatum oogzalf	Dechra	NDC: 17033-211
70% isopropylalcohol preparaatkussentjes	Kendall	6818
Steriele gaas	Covidien	8044	niet geweven, 4" x 4", 4-laags
1,7 ml conische polypropyleen microtubes	Genesee Scientific	22-281
Muis stereotactische frame	Stoelting	51730
Chirurgische lamp	Philips Burton	CS316W	Coolspot II variabele schijnwerper
Gebogen dissectietang	Ted Pella Inc.	5431
Colibri retractoren	FST	17000-03
Snoerloze precisie boormachine	Dremel	1100-01	Stylus model; 7,2-Volt Lithium-Ion met dockingstation
Graveermes	Dremel	105	1/32" of 0,8 mm bitsdiameter
Microliter spuit	Hamilton	75	Hamilton Microliter Spuiten 700-serie; 5 μl volume
Microliter spuitnaalden	Hamilton	7762-06	33 G, kleine hub RN NDL, 1,5 inch, puntstijl 3, 6/PK
Ethilon 3-0 zwarte monofilament nylon hechtdraad	Ethicon	1663
Magneet roerlat	VWR	74950-296	7,9 mm diameter x 50 mm lengte (5/16" diameter x 2" lengte)
1 L glazen schroefdop opslagfles	Corning	1395	Type 1, Klasse A borosilicaatglas
Heparine natrium	Sagent	NDC: 25021-400	1.000 U/ml oplossing
Peristaltiekpomp	Cole Parmer Instruments Group	77200-60	Master Flex Easy Load II console drive
gecomprimeerd carbogen (95% O2 / 5% CO2)	beschikbaar bij lokale verkoper	N/A	A-type, grote cilinder
20 G x 1 ½" aluminium hub stompe naalden	Kendall	8881202363	0,9 mm x 38,1 mm
Polyurethaan ijsemmer	Fisherbrand	02-591-45	Capaciteit: 0,152 oz. (4,5L)
Collageenase (Type I-S)	Sigma Aldrich	C1639	van Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I	Worthington Biochemical Corp.	LS002007	>2.000 Kunitz units per mg drooggewicht
Antistatische polystyreen hexagonale weegschalen	Ted Pella Inc.	20157-3	top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume
Roestvrijstalen enkele blad scheermesjes	Garvey	40475
Botrongeurs	FST	16001-15
Hemostat	FST	13014-14
Grote dissectiescharen	Ted Pella Inc.	1316
Kleine dissectiescharen	FST	14094-11
Stompe uiteinden tang	Ted Pella Inc.	13250
7 ml glazen Dounce weefselmol