Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Zeer gevoelige test voor het meten van arenavirus-cel Attachment

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53682

⸱

2 maart 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

In dit artikel

Samenvatting

De eerste stap in de arenavirus levenscyclus is het hechten van virale deeltjes aan gasthercellen. We rapporteren een kwantitatief (q)RT-PCR-gebaseerde test voor ultragevoelige detectie en kwantificering van arenavirus-hechtingsgebeurtenissen.

Samenvatting

Arenavirussen zijn een familie van omhulde RNA-virussen die ernstige menselijke ziekten veroorzaken. De eerste stap in de arenavirus-levenscyclus is het hechten van virale deeltjes aan gastheercellen. Hoewel virus-cel-hechting kan worden gemeten door gebruik te maken van virionen gelabeld met biotin, radioactieve isotopen of fluorescerende kleurstoffen, vereisen deze benaderingen doorgaans hoge multipliciteiten van infectie (MOI) om detectie van gebonden virus mogelijk te maken. We beschrijven een kwantitatief (q)RT-PCR-gebaseerde test die Junin-virusstam Candid 1-hechting meet via kwantificering van virion-verpakt vireel genoom-RNA. Deze test heeft verschillende voordelen, waaronder de extreme gevoeligheid en het vermogen om hechting te meten over een groot dynamisch bereik van MOI's zonder de noodzaak om inputvirus te zuiveren of labelen. Belangrijk is dat deze aanpak eenvoudig kan worden aangepast voor gebruik met andere virussen door gebruik van virusspecifieke qRT-PCR-reagentia. Verder kan deze test worden aangepast om meting van deeltjes-endocytose en genoom-decoating mogelijk te maken. Kortom, we beschrijven een eenvoudige, maar robuuste test voor zeer gevoelige meting van arenavirus-cel-hechting.

Inleiding

Arenavirussen zijn een familie van omhulde, enkelstrengs RNA-virussen die voornamelijk gevoerd knaagdieren aard 1-3. Hoewel deze virussen meestal vast een asymptomatische, aanhoudende infectie bij knaagdieren reservoirs 1,2, kunnen ze ernstige ziekte bij de mens veroorzaken 3. Belangrijke pathogene soorten zijn de Nieuwe Wereld Junin virus (JUNV) 4 en de Oude Wereld Lassa virus 5, waarbij de etiologische agenten van de Argentijnse hemorragische koorts in Zuid-Amerika en Lassa koorts in Afrika, respectievelijk. Lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV), het prototype virus van de familie 6, heeft een wereldwijde verspreiding en is verantwoordelijk voor een aantal ziektetoestanden waaronder aseptische meningitis bij immuuncompetente individuen 6, ernstige aangeboren afwijkingen bij de foetus 7 of hoge letaliteit immunosuppressieve individuen na solide-orgaantransplantatie 8,9. Het ontbreken van Verenigde StatenFood and Drug Administration (FDA) -goedgekeurd vaccins of effectieve antivirale middelen om deze virussen te bestrijden wijst op de absolute noodzaak om nieuwe strategieën voor het therapeutisch deze opkomende / re-opkomende ziekteverwekkers te ontwikkelen.

De arenavirus genoom bestaat uit twee enkelstrengige RNA-segmenten, de grote (L) (~ 7,2 kb) en klein (S) (~ 3,6 kb) segmenten 10. De S-segment codeert het virale nucleoproteïne (NP) en envelop glycoproteïne (GP), terwijl de L-segment codeert voor het virale polymerase (L) en matrix eiwit (Z). De SL en genomische RNA segmenten (vRNA's) worden verpakt in virions 10-12. De eerste stap van arenavirus infectie hechting van virale partikels aan gastheercellen via een interactie tussen de virale huisarts en de bijbehorende gastheercel receptoren die voor JUNV, omvat de menselijke transferrinereceptor 1 (hTfR1) 13,14. Na bevestiging worden JUNV deeltjes in de cel genomen via clathrine-gemedieerde endocytose 15.Deeltjes dan verkeer naar de late endosoom waar de lage pH van dit compartiment het startsein voor de activering van GP 16,17. Eenmaal geactiveerd, de GP-gecodeerde fusiepeptide inserts in de endosomale membraan, het initiëren van fusie tussen de virale en endosomale membranen. Succesvolle combinatie resulteert in het vrijkomen van het virion verpakt vRNA's in het cytoplasma, waar ze dienen als matrijzen voor genomische replicatie en transcriptie. Wanneer voldoende hoeveelheden virale structurele proteïnen en vRNA's worden gegenereerd, nieuwe deeltjes monteren en de knop van de geïnfecteerde cel naar de levenscyclus 18 ronden.

Tot de ontdekking van nieuwe strategieën vergemakkelijken het therapeutisch pathogene arenavirussen, heeft onze fractie gericht op de identificatie van gastheer factoren die kritiek zijn voor viruspropagatie, maar overbodig voor de gastheer. In dit verband vaststellen van de precieze fase (n) van de virale levenscyclus worden gecontroleerd door deze gastheerfactoren moet de leidraadontwikkeling van antivirale strategieën. Hierin beschrijven we een kwantitatief (q) RT-PCR gebaseerde bepaling die kan worden gebruikt om arenavirus-celhechting voor de identificatie of geselecteerde gastheer- en / of antivirale moleculen beïnvloeden deze eerste fase van virale ingang 19 meten. Alternatieve benaderingen arenavirus-celhechting te meten hebben gekenmerkt virionen gelabeld met biotine 20, fluorescerende kleurstoffen 21, of radioactieve isotopen 22. Nadelen van deze methoden kan de vereiste grote hoeveelheden toegevoegd virus (bijvoorbeeld hoge multipliciteit van infectie (MOI)), het gebruik van radioactiviteit en / of aanvullende behandelingsstappen aan toegevoegd virus (bijvoorbeeld concentratie en / of het etiket van virus) te bereiden omvatten . Met name het gebruik van hoge MOI maakt het moeilijk om onderscheid te maken productief versus niet-productieve gehechtheid gebeurtenissen 15,23. De qRT-PCR-gebaseerde test die hier beschreven kunnen attachment gebeurtenissen detecteren met behulp van zo weinig als 20 plaque voorming eenheden (PVE) virus, wat zich vertaalt in een MOI van 0,0004 voor een 48-wells plaat. Daarom is de sterke gevoeligheid van de test overwint de behoefte aan hoog traagheidsmoment en virussen etikettering of concentratiestappen. Verder kan de assay i) ingericht om virion endocytose meten en afgifte van virusgenoom in het cytoplasma volgende fusie en ii) aangepast zijn voor andere virussen door de ontwikkeling van virus-specifieke qRT-PCR reagentia (voor voorbeelden zie 24-27).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Let op: Het is essentieel dat de beschreven protocol worden uitgevoerd met strikte pre-PCR-techniek (zie 28 voor een uitstekend overzicht over hoe het opzetten van een pre-PCR laboratorium en hoe experimenten uit te voeren met behulp van een goede pre-PCR-techniek). Het is absoluut noodzakelijk dat alle reagentia en apparatuur zijn vrij van versterkte DNA dat de qPCR doelsequentie en dat er passende controles zijn om een ​​dergelijke besmetting op te sporen. Een overzicht van het protocol wordt weergegeven in figuur 1.

1. Bereid Media en Seed cellen in 48-well platen

  1. Bereid 500 ml compleet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine, en 1% HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethaansulfonzuur) buffer door toevoeging van 50 ml warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en 5 ml van een 100x penicilline-streptomycine en 100x HEPES bufferoplossing een flesje 500 ml DMEM. Deze oplossing kan worden bewaard bij 476, C maanden.
  2. Zaad 2,5 x 10 4 Vero E6-cellen per putje in een 48-well weefselkweekplaat in een eindvolume van 500 pl compleet DMEM. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 10-18 uur.
    1. Zaad de plaat aan het einde van de werkdag. Test elk virus monster in een van beide dubbele of drievoudige putjes.
      Opmerking: Terwijl een 48-well-platform voor deze assay wordt beschreven, moet het mogelijk zijn om de test die voor gebruik in schalen met 96 of 384 putjes.

2. Carry Out Virus-cel Attachment

Opmerking: Het virus gebruikt in dit protocol, JUNV stam Spontaan # 1 (C # 1), is met succes gebruikt als een levend verzwakt vaccin voor de preventie van de ziekte JUNV 29. JUNV C # 1 was afgeleid van de virulente stam JUNV XJ via seriële passage zowel in vivo als in vitro en verschilt van de parentale stam door XJ 12 aminozuren 30. Because JUNV C # 1 is een bioveiligheidsniveau (BSL) -2-rated ziekteverwekker, moet het werk beschreven voor dit gedeelte worden uitgevoerd met de juiste BSL-2 praktijken 31. Dit omvat het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld bescherming van de ogen, laboratoriumjas, dubbele handschoenen), een klasse II bioveiligheid kast, en zorgt ervoor dat alle institutionele opleiding en goedkeuringen nodig is om veilig te behandelen dit organisme hebben ontvangen.

  1. Verdun de JUNV C # 1 monster (s) te testen om de gewenste PVE of focus eenheden in ijskoud compleet DMEM en op te slaan op het ijs pas klaar om elk putje toe te voegen.
    Opmerking: Als alternatief voor het uitvoeren van de bindingsstudies met virus verdund in compleet DMEM, gebruikt een minimaal medium dat PBS met een verminderde serumconcentratie (2%) en een geschikte buffer te gaan of serum interferentie met virusbinding kan veroorzaken. Vergelijkbare attachment protocollen voor alternatieve virussen hebben het gebruik van RPMI 1640 medium zonder bicarbo gemeldnate bevattende 0,2% runderserumalbumine, 10 mM (2- (morfolino) ethaansulfonzuur), en 10 mM HEPES, pH 6,8 32. Deze binding media kunnen superieur zijn om pH-veranderingen die kunnen optreden wanneer de media van de CO 2 -Milieu van de incubator wordt verwijderd te voorkomen.
    1. Wordt geënt in wells met PVE, variërend van 200 tot 2.000 tot niet-productieve attachment gebeurtenissen beperken. Zoals getoond in figuur 2, deze test is het opsporen van hechting gebruik zo weinig als 20 PFU (of zoveel als 2 x 10 6 PFU).
    2. Maak een master mix van het virus voor inenting op cellen. Elk virus monster wordt geïnoculeerd duplo putjes in een volume van 50 pl per putje. Als dus de toevoeging van 2000 PVE virus per putje gewenst, verdund 4800 PVE in een totaal volume van 120 pl ijskoud compleet DMEM.
      1. Om te controleren voor de specificiteit van de test, gebruik maken van een aangepast paar van de Chinese hamster ovarium cellijnen die ofwel niet uitdrukken TfR1 (TRVb) of expruk hTfR1 (TRVb-1) als JUNV gehechtheid aan deze cellen moeten worden verminderd of niet, respectievelijk 13,33. Alternatief, behandel cellen met een protease, zoals proteïnase K tot arenavirus bevestiging 34 of ingang 35 te voorkomen. Oplosbare hTfR1 of het monoklonale antilichaam ch128.1, dat specifiek is voor hTfR1, kan ook worden beschouwd als ze bekend om de toegang van JUNV in cellen 13,36 blokkeren. Bovendien, voorbehandeling van cellen met gratis mannose 14 of incubatie van deeltjes met JUNV-specifieke neutraliserende antilichamen 37 kunnen virus toegang te belemmeren.
      2. Let echter op dat deze laatste reagentia en benaderingen, ondanks het blokkeren JUNV binnenkomst, zijn niet bevestigd tot bevestiging te blokkeren, hoewel dit een waarschijnlijke verklaring. De hier beschreven protocol kan worden gebruikt om formeel bepalen of deze verschillende benaderingen effect virion bevestiging.
  2. Verwijder platen uit de 37 ° C incubatorplaatsen hetzij in een 4 ° C koelkast of op ijs gedurende 15 min om het vermogen van de cellen uitgeplaat endocytose uitvoeren remmen.
  3. Vervolgens zuig het volledige DMEM uit elk putje en snel wassen elk putje wordt tweemaal telkens met 100 ul ijskoude PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) pH 7,4. Voeg vervolgens 50 pl van het verdunde pre-virus monsters (bereid in stap 2,1) aan de geschikte putjes.
  4. Wikkel de plaat in plastic folie en onmiddellijk te plaatsen ofwel terug op het ijs of in een 4 ° C koelkast gedurende 1 tot 1,5 uur om het virus gehechtheid aan optreden. Houd de plaat, wassen buffer, en virusmonsters koud bij 4 ° C gedurende deze stap.
  5. Na de voltooiing van de 4 ° C incuberen, zuig het virus inoculum en was elk putje 3 maal met 200 ul ijskoude PBS.

3. Viral RNA Extraction

  1. Zuiver viraal RNA uit JUNV C # 1 deeltjes aan de monolagen met de commerciële kit (bijv RNeasy Mini kit) according het protocol van de fabrikant. Specifically, volg dan de "zuivering van totaal RNA van dierlijke cellen gebruik makend van spin-technologie protocol" op pagina's 23-28 in de RNeasy Mini Handbook (4e editie, april 2006) met de onderstaande wijzigingen.
    1. Lyseren de cellen zoals aangegeven in stap 1B door het direct toevoegen van 350 ui lysisbuffer RLT aan elk putje. Meng de buffer verscheidene keren cellysis te garanderen. Merk op dat cellen lyseren gemakkelijk in deze buffer en volledige lysis kan worden gecontroleerd door het bekijken putjes onder een omgekeerde microscoop.
    2. Het verkregen cellysaat de kit kolom (stap 3a) en volg de rest van het protocol zoals beschreven. Op dit moment is het virus geneutraliseerd door de lysis buffer zodat de resterende stappen van het protocol kan worden gedaan buiten de klasse II bioveiligheid kast verschaft de kit buizen werden niet besmet met infectieus virus.
    3. Voeg de optionele stap 9 van het protocol van de fabrikant, die een additional centrifugeren van de spin kolom om eventuele overdracht van Buffer RPE te elimineren.
    4. In de laatste stap protocol van de fabrikant (stap 10), elueren de gezuiverde RNA van de spin kolom met 30 ul nuclease-vrij DDH 2 O. RNA opslag bij -80 ° C op dit punt of direct gebruik in de qRT-PCR assay. Afbraak van gezuiverd viraal RNA monsters voorkomen nucleasen Gebruik nuclease-vrije reagentia en materialen en houden ontdooide RNA-monsters op ijs.
      Opmerking: Buffers RLT en RW1 bevatten guanidinezout en mag niet worden vermengd met bleekwater. Buffer RW1 bevat ethanol.

4. qRT-PCR Meting van virale genoom

  1. Om JUNV C # 1 S segment RNA omgezet in cDNA voor daaropvolgende qPCR, bloot het virale RNA (opgewekt in stap 3.1.4) tot kamertemperatuur in een totaal volume van 50 pl.
    1. Het opzetten van de RT-reactie, eerst een master mix met elk van de volgende reagentia per reactie: 6,75 pi nuclease-vrij DDH 2 O, 5 ui van een 2 pM voorraad van de RT-primer S 2098- 2075- aan (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), dat complementair is aan het gebied NP van de S segment genomisch RNA, 5 gl 10X PCR-buffer II, 11 pi van een 25 mM MgCl2-oplossing, 1,25 pl (62,5 eenheden) van RT enzym, 1 gl (0,4 eenheden) RNase inhibitor, en 10 gl van een 500 uM dNTP voorraad.
      Opmerking: In de loop van arenavirus replicatie, zijn 4 virus S segment RNA species gegenereerd: een volledige lengte genomisch RNA (vRNA), een volle lengte antigenoom RNA (vcRNA) (die het omgekeerde complement van het vRNA) en twee subgenomische mRNAs codeert de NP en GP-genen, respectievelijk. De RT-primer Hier worden specifiek is voor alleen de S segment vRNA, maar niet de vcRNA, NP mRNA of mRNA GP.
    2. Meng de RT master mix en aliquot 40 pi in afzonderlijke 0,2 ml PCR-buizen. Voeg 10 ul van viraal RNA aan elke buis. Omvatten i) een no-template controle buis (bv. Voeg 10 ul nuclease-vrij DDH 2 O tot 40 pi van de master mix) en ii) een niet RT enzymcontrole (bijv voeg 10 ul van een bekende positieve viraal RNA monster 40 pi Master Mix die niet ontvangen elke RT enzym) te screenen op besmetting van de RT reagentia met geamplificeerd DNA dat het virale doelsequentie. Omvatten RNA geëxtraheerd uit geïnfecteerde cellen met de volledige RT master mix te controleren voor assay specificiteit in aanwezigheid van cellulair RNA.
    3. Bovendien zijn een bekende positieve viraal RNA staal voor het werkelijke master mix de kwaliteit van de RT reagentia te controleren. Merk op dat het volume van de RT-reactie om 25 gl kan zonodig verlaagd.
  2. Het aldus RT buizen naar de volgende cyclingcondities: 25 ° C gedurende 10 min, 48 ° C gedurende 30 min, en 95 ° C gedurende 5 minuten. Merk op dat monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C op dit moment of gedurende één nacht in de thermocycler door toevoeging van een 4 ° C stap.
  3. Perform qPCR in een totaal volume van 25 pl.
    1. Wordt qPCR Master Mix door het volgende te combineren: 2,5 pl (van 9 pM voorraad) van elk van de voorwaartse PCR primer S1937 + tot 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') en reverse PCR primer S 2001- 1982- tot (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 pl (van een 2 pM voorraad) van de qPCR probe S 1960+ tot 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 ') en 12,5 pl van de universele 2X qPCR master mengen. Merk op dat de voorwaartse primer hier vermeld, dat specifiek is voor JUNV C # 1 verschilt met 1 nt van het oorspronkelijk gerapporteerde primersequentie 38, waarbij de virulente stam JUNV Romero richt.
    2. Meng de oplossing en voeg dan 20 ul aan elk qPCR ook. Voeg 5 ul van elke RT-reactie aan de juiste putjes qPCR. Gedrag qPCR in drievoud voor elk getest monster. Merk op dat het reactievolume PCR kunnen worden gereduceerd tot slechts 12,5 pl indien nodig.
      Opmerking: De software die hoort bijde qPCR machine absolute kopie aantal JUNV C # 1 S segment genomisch RNA te genereren door de waarde van elk onbekend monster te vergelijken met een serie standaard verdunningen van plasmide dat codeert voor het JUNV C # 1 NP-gen, die het voorwerp van de qPCR primer en probe set. De qPCR assay kan alleen kwantificering van waarden die binnen het bereik van de standaardkromme vallen. Daarom bevatten de volgende hoeveelheden plasmide (in triplo putjes): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 en 5 x 10 7 kopieën per putje.
  4. Laad de qPCR plaat in de thermocycler en voer de volgende reactieomstandigheden: 95 ° C gedurende 10 minuten en 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min.
    1. Verzamelen en analyseren van de hoeveelheid van viraal RNA in elk monster te bepalen volgens het protocol van de fabrikant.
  5. Een standaardcurve stellen door de nieuw gezuiverde monster van plasmide dat het qPCR teerkrijgen volgorde, eerst het plasmide aantal kopieën in deze oplossing te bepalen.
    1. Bereken het molecuulgewicht van het plasmide. Indien de sequentie van het gehele plasmide bekend, berekenen aan de hand van de volgende formule: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Herinner het totale aantal van een bepaalde nucleotidesequentie vinden op elke streng van het dubbelstrengs plasmide bevatten.
    2. Als de grootte van het plasmide is bekend, maar de exacte sequentie niet Bereken het MW onder de veronderstelling dat elke dsDNA basenpaar heeft een MW van 600.
      Opmerking: De pCAGGS-JUNV C # 1 NP plasmide hier gebruikt heeft een MW van 4,2 x 10 6.
    3. Zodra het MW van het plasmide werd bepaald, berekenen hoeveel kopieën per ul in de voorraad plasmide oplossing.
    4. Allereerst wordt de totale ug plasmide in de oplossing, deze vervolgens omzetten in mol plasmide (bijvoorbeeld als 69 pg plasmide zijn opgenomen in 300 pl water, daarna 6,9 x 10 -5 g plasmide * 1 mol / 4,2 x 10 6 g plasmide = 1,6 x 10 -11 mol plasmide), die kan worden omgezet nummer over (bijvoorbeeld 1,6 x 10 -11 mol plasmide * 6,022 x 10 23 moleculen / mol = 9,8 x 10 12 moleculen (of kopieën)).
    5. Verdeel de totale kopieën van plasmide in het plasmide oplossing door het volume van die oplossing om kopieën per ul te krijgen (bijvoorbeeld 9,8 x 10 12 kopieën / 300 pi = 3,28 x 10 10 exemplaren).
    6. Verdun deze oplossing adequaat zodat 5 gl volumes op de PCR-plaat kan worden geplaatst om het bereik van kopie-aantallen nodig standaardcurve vast leveren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de gevoeligheid en dynamisch bereik van de qPCR test aan te tonen, werden bekende hoeveelheden van een plasmide dat codeert voor het NP-gen van JUNV C # 1 (range 5-5 x 10 7 exemplaren) onderworpen aan qPCR zoals beschreven in paragraaf 4 van het protocol. De test is gevoelig en betrouwbaar kan detecteren zo weinig als 5 kopieën van het doelnucleïnezuur (figuur 2). Verder is het dynamische bereik van de assay is groot en, zoals getoond in figuur 2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol beschrijven we is eenvoudig en robuust op voorwaarde dat de volgende kritische beschouwingen in acht worden genomen. Ten eerste moet een strikte pre-PCR-techniek worden toegepast (zie 28 voor een uitstekende beoordeling). Het is absoluut noodzakelijk dat alle reagentia en apparatuur zijn vrij van versterkte DNA dat de qPCR doelsequentie en dat er passende controles zijn om een ​​dergelijke besmetting op te sporen. Ten tweede, voor het virus-celhechting deel van het protocol, het virus, cellen en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, en Benjamin King nuttige discussies en de National Institutes of Health voor de ondersteuning van deze studies door middel van subsidies T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB) en P20RR021905 (JB) .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMLife Technologies11965-118
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-163100x
HEPES Buffer SolutionLife Technologies15630-130100x
PBS pH 7.4Life Technologies10010-0231x
Vero E6 cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-1586
Costar 48-well plateCorning3548
RNeasy mini kitQiagen74106do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizerQiagen79654
Taqman Universal PCR Master MixLife Technologies4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl)Life Technologies4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP)Life TechnologiesN808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solutionLife TechnologiesN808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl)Life TechnologiesN808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3’		Integrated DNA Technologies250 nmol DNA oligostandard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’Life Technologies4304971standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’Life Technologies4304971standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’Life Technologies4316033HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL)Life Technologies4346906
StepOnePlus Real-Time PCR SystemLife Technologies4376598or other qPCR instrument

Referenties

  1. Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
  2. Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
  3. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
  4. Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
  5. Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
  6. Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
  7. Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
  8. Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
  9. Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
  10. Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
  11. Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
  12. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043(2015).
  13. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
  14. Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
  15. Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
  16. Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
  17. Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
  18. Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
  19. Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
  20. Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
  21. Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131(2013).
  22. Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
  23. Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183(2007).
  24. Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911(2014).
  25. Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217(2009).
  26. Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
  27. Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
  28. Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14(2007).
  29. Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
  30. Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
  31. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
  32. White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
  33. McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
  34. Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
  35. Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
  36. Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
  37. Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
  38. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
  39. Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
  40. Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Arenavirus-aanhechtingqRT-PCR-assayvirale RNA-kwantificatievirus-celbindingJunin-virus Candid 1Vero E6-cellenRNA-isolatiekitqPCR-detectieveiligheidskastvirale RNA-extractie
Zeer gevoelige test voor het meten van arenavirus-cel Attachment
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.