Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek

Samenvatting

Hier is een protocol om pluripotente stamcellen (PSC) en neurale stamcellen (NSC) te kweken in een gesloten celkweeksysteem dat maximale steriliteit en reproduceerbaarheid mogelijk maakt, waardoor de traditionele bioveiligheidskast en incubator worden vervangen. Deze apparatuur voldoet aan de richtlijnen voor goede klinische fabricagepraktijken (cGMP) en goede laboratoriumpraktijken (cGLP).

Samenvatting

Dit artikel beschrijft hoe een op maat gemaakt, commercieel verkrijgbaar gesloten celkweeksysteem kan worden gebruikt voor fundamenteel en preklinisch onderzoek. Biosafety cabinets (BSC's) en incubators zijn lange tijd de standaard geweest voor het kweken en vermeerderen van cellijnen voor fundamenteel en preklinisch onderzoek. Maar naarmate de focus van veel stamcellaboratoria verschuift van fundamenteel onderzoek naar klinische toepassing, zijn er aanvullende vereisten voor het celkweeksysteem. Alle processen moeten goed gedocumenteerd zijn en uitzonderlijke eisen stellen aan steriliteit en reproduceerbaarheid. In traditionele incubators fluctueren gasconcentraties en temperaturen sterk wanneer de cellen worden verwijderd voor voeding, passagering of andere manipulaties. Dergelijke onderbrekingen dragen bij aan een omgeving die niet voldoet aan de normen voor cGMP en GLP. Deze onderbrekingen moeten worden geminimaliseerd, vooral wanneer cellen voor therapeutische doeleinden worden gebruikt. De motivatie om over te stappen van het standaard BSC- en incubatorsysteem naar een gesloten systeem is dat dergelijke onderbrekingen kunnen worden geminimaliseerd. Gesloten systemen bieden een werkruimte om celculturen te voeden en te manipuleren en ze te onderhouden in een gecontroleerde omgeving waar temperatuur en gasconcentraties consistent zijn. Op deze manier kunnen pluripotente en multipotente stamcellen vanaf het moment van hun afkomst tot aan hun uiteindelijke gebruik in therapie in optimale gezondheid worden gehouden.

Inleiding

Standaard stamcelkweektechnieken lijden aan verschillende omgevingsbeperkingen die onnodige stress op de cellen uitoefenen en de cellen blootstellen aan onaanvaardbare risico's op besmetting. Tot de stress die cellen onder standaard celkweekcondities kunnen ondergaan, behoren plotselinge veranderingen in de niveaus van kooldioxide en zuurstofconcentraties^3,4. Dit gebeurt wanneer de cellen van de incubator naar de bioveiligheidskast en/of microscoop worden verplaatst, wat mogelijk niet optimaal is voor de cellen. Eerdere studies hebben de voordelen bevestigd van het kweken van zowel pluripotente als neurale stamcellen onder hypoxische omstandigheden^4,11, en voor de beste resultaten moeten deze omstandigheden continu zijn. Bovendien zijn de risico's op cellulaire besmetting hoger aangezien de laboratoriumomgeving en het personeel bij bijna elke stap van hun kweek en manipulatie de cellen beïnvloeden. Traditionele schone ruimtes vormen een effectieve methode om de besmettingsrisico's aanzienlijk te verminderen, maar ze zijn duur, hebben een grote voetafdruk en pakken de stressfactoren met betrekking tot kooldioxide en zuurstofconcentraties niet aan.

Een celproductiefaciliteit die zowel besmettingsrisico's als gasconcentraties kan aanpakken en die gekwalificeerd kan worden om aan cGMP-criteria⁹ te voldoen, levert hoge kwaliteit cellen voor zowel fundamenteel wetenschappelijk onderzoek als klinische toepassingen^1,6,7. Een dergelijke celproductiefaciliteit bestaat minimaal uit de volgende componenten: een proceskamer, die dient als verwarmde werkruimte voor het voeren en manipuleren van celculturen; een laminaire stroomkap, voor de initiële sterilisatie van reagentia, buisjes en gereedschappen; twee bufferluchtsluiskamers tussen de kap en de proceskamer; twee celkweekincubatoren die toegankelijk zijn vanuit de proceskamer; een microscoopkamer naast de proceskamer; en ten slotte computersoftware om de omstandigheden binnen deze modules in te stellen en te bewaken. Met behulp van deze basisinfrastructuur kan een breed scala aan taken worden uitgevoerd, zoals standaard voeding en passage van pluripotente stamcellen en multipotente neurale stamcellen, evenals meer gespecialiseerde methoden zoals Sendai-virusgebaseerde herprogrammering, in vitro migratiestudies en differentiatie van neurale stamcellen voor elektrofysiologische karakterisering.

Protocol

1. Eerste installatie

1. Instellen van het gas en de temperatuur Concentraties
   1. Met behulp van de software, klikt u op het tabblad "Gast" op de linkerbovenhoek van de grafische interface. Inloggen op het systeem met behulp van een aangewezen gebruikersnaam en wachtwoord. Zorg ervoor dat iedere gebruiker heeft een eigen gebruikersnaam en wachtwoord.
   2. Op een module aan te passen (figuur 1). Binnen het nieuwe venster de huidige instellingen het weergeven, klikt u op de bestaande O ₂ ingestelde waarde onder "Set point" en voer de vereiste O ₂ concentratie voor deze module. Voer 5% O ₂ als pluripotente stamcellen zal worden gekweekt of gemanipuleerd in deze module, en 9% O ₂ als neurale stamcellen zal worden gekweekt of gemanipuleerd. Klik op het groene vinkje om het setpoint te bevestigen.
      Opmerking: Twee modules zijn niet gas verstelbaar: de laminaire kap, en de microscoop kamer. Het gas concentraties in de laminaire stroming kap is sfeervol while die in de microscoop kamer passief onderhouden door de gasconcentraties in de proceskamer.
   3. Herhaal deze stap voor CO _2. Voer een instelling van 5% _CO2 gedurende alle modules behalve de bufferkamers, die op verstelbare O _{2 zijn.}
   4. Bewaken van de huidige gasconcentraties, die worden aangeduid als "proces waarden", om ervoor te zorgen dat ze het nieuwe set punten.
   5. Pas het gas setpunten van alle modules op de juiste waarden. Overeenkomen met de _CO2 en _O2 niveaus van kamers die worden blootgesteld aan elkaar. Bijvoorbeeld, stel de proceskamer tot 5% O ₂ voor het openen van een incubator die cellen groeit 5% O _2. Zet ook tot 5% O ₂ geen bufferkamer die wordt gebruikt om objecten aan de proceskamer tijdens deze periode toe.
   6. Stel de temperatuur van de proceskamer tot 37 ° C met hetzelfde scherm gas aanpassingen. Stel ook de proceskamer floor temperatuur tot 37 ° C.
   7. Klik op de incubatie module banken onder elke incubator. Regel de temperatuur van de banken tot 37 ° C.
2. Werking van bufferkamers
   1. Verzamel alle nodig zijn voor de bepaalde taak (voeding, splitsen, vlekken, etc.) in het begin tot een vertraging in de work flow te voorkomen supplies. Royaal spuiten alle materialen met 70% ethanol en laat ze drogen in de laminaire kap. Niet kolven of platen van cellen sproeien - veeg ze voorzichtig af met een steriel gaasje spons verzadigd met 70% ethanol.
   2. Zorg ervoor dat zowel de buitenste en binnenste deuren van de buffer kamer worden gesloten. Open vervolgens de buitendeur, en plaats de items in.
   3. Sluit de buitendeur. Binnen de software, selecteert u de buffer module, en klik op het tabblad verdunningsfactor. Voer 1 in het logboek factor doos. Klik op te starten.
      Opmerking: A "verdunningsfactor" wordt gedefinieerd te betekenen dat de atmosfeer van de buffer module zalworden geëvacueerd en vervangen door 1 keer met schoon-HEPA gefilterd gas.
   4. Zodra de grafische interface is gestopt met knipperende "verdunningsfactor", opent binnendeur de buffer kamer en breng de materialen in de proceskamer.
      Let op: Zorg ervoor dat de binnenste en buitenste deuren ooit geopend op hetzelfde moment en niet de binnenkant van de deur niet open als de buffer kamer een verdunningsfactor niet heeft ondergaan.
   5. Om items uit de proceskamer te verwijderen, eerst voor zorgen dat de buffer kamer een verdunningsfactor heeft ondergaan. Open vervolgens de binnenkant van de deur, plaats de items in om te worden verwijderd, en sluit de binnendeur. Open vervolgens de buitendeur en verwijder de items.
      Let op: Een verdunningsfactor niet nodig voor het openen van de buitendeur te worden uitgevoerd.

2. Introductie en Feeding Cellen

1. incubator Setup
   1. Plaats 3 Petrischalen in het water pan aan de basis van elke incubator. Vul deze gerechten met sterile water. Niet direct het water pan te vullen. Handhaving van het waterpeil in deze gerechten, zoals ze zijn van cruciaal belang voor het behoud van de relatieve vochtigheid (RH) setpoint in de incubators.
   2. Binnen de grafische interface, klikt u op de incubator. Klik op de bestaande waarde voor de relatieve vochtigheid (RH) onder setpoint en voert 85%. Klik op het groene vinkje om deze waarde te accepteren.
2. Voorbereiding van de Cel productiefaciliteit voor Cells
   1. Als dit niet hebt gedaan, past u de buffer kamers, de proceskamer en een incubator aan het gas reeks punten die nodig zijn voor het type cel worden geïntroduceerd.
   2. Reinig het oppervlak van de proceskamer met steriel gaas en een onbrandbaar desinfectiemiddel. Gebruik geen perazijnzuur zuur gebaseerde ontsmettingsmiddel, als in een gesloten systeem van de sterke, aanhoudende dampen zijn giftig voor zoogdiercellen. In plaats daarvan benzalkonium-chloride gebaseerde producten.
   3. Doorgaan desinfecteren. Reinig de handschoenen en oppervlakken die zijn commolleen aangeraakt, zoals deurklinken. Gebruik het desinfectiemiddel grondig maar met mate, zoals overtollige vloeistof in de proceskamer bijdraagt ​​aan vocht, condensatie en eventuele microbiële groei.
   4. Reinig het oppervlak van de laminaire stroming kap en buffer kamer met 70% ethanol en laat ze drogen. Plaats de kolf of platen bestaande cellen (in ons geval, PSC of NSC's) in de kap en kort veegt het buitenoppervlak met een steriel gaas spons verzadigd met ethanol.
   5. Zet de kolf of plaat in de bufferruimte, en uitvoeren van een verdunningsfactor (stap 1.2.3).
   6. Na voltooiing van de verdunningsfactor, geeft de kolf verplaatsen of plaat naar de juiste incubator. Als incubators aan de achterkant van de proceskamer, trekt een plank uit in de proceskamer voor mobiele plaatsing. Niet onnodig openen van de incubator deuren of voor langere tijd, aangezien lucht de proceskamer is zeer droog vergeleken met die van de incubators, en zal resulteren in een significantevochtverlies in de incubator.
3. Feeding Cell Cultures
   1. Verzamel medium componenten, serologische pipetten, een elektronische pipet, gaas en desinfecterend middel. Ook het verzamelen van een afvalcontainer voor gebruikte celcultuur medium, maar doe het niet vullen met bleekmiddel. Breng de materialen in de proceskamer door middel van een buffer geplaatst zoals beschreven in paragraaf 1.2. Bereid celkweekmedium in de proceskamer, zoals eerder beschreven ^9,10 (zie tabel Materials)
   2. Regelen materialen op zodanige wijze dat een optimale werkruimte mogelijk. Leg geen items niet worden gebruikt in het midden van de proceskamer.
   3. Houd rekening met het medium in evenwicht met de CO ₂ en O ₂ niveaus binnen het systeem aanwezig is door het verlaten van de media container iets afgetopte. Sommige PSC medium fabrikanten geven niet de media te verwarmen bij 37 ° C; indien dit het geval een bufferkamer aan het medium equilibreren. Laat het medium equilibreren 20 minuten.
   4. Verwijder het oude medium uit de putjes met een geschikte stereologische pipet en een elektronische pipet. Voor de PSC's, verwijder alle maar een klein restant van het oude medium, genoeg om uitdroging te voorkomen tijdens het voeren proces. Voor NSCs, verwijder de helft van de oude medium. Pipet het afval in de afvalcontainer.
   5. Plaats de gebruikte pipet terug in de originele verpakking en verplaatsen naar de zijkant van de proceskamer, of naar een aangewezen voor de verwijdering van afval buffer kamer. Met een frisse steriele serologische pipet, voeg vers medium aan kweekplaten cel en leg de platen terug in hun aangewezen incubator.
   6. Aan het einde van het voeden, spray gaas met een ontsmettingsmiddel en het reinigen van de vloer en deurgrepen van de proceskamer grondig. Als er meerdere cellijnen worden gekweekt in het systeem, steriliseren tussen toevoeren elke cellijn. Dit helpt de kans op kruisbesmetting te minimaliseren.
   7. Na voltooiing, afvalstoffen te verwijderenof andere onnodige voorwerpen door één van de bufferkamers.

3. Splitsing Cell Cultures

1. Enzymatische passage van de PSC's of NSC
   1. Verzamel alle items die nodig zijn voor de passage. Dit omvat media, enzym of niet-enzymatische celdissociatiebuffer (deze laatste is slechts NSC), DPBS, platen of flacons, extracellulaire matrix (ECM), conisch en serologische pipetten. Breng ze in het systeem met behulp van een buffer kamer.
   2. Coat verse platen of kolven met ECM, zoals eerder beschreven ^9,10. Sommige ECM's -zoals die afgeleid van muizen sarcoma cellijnen - zijn alleen vloeistof tussen 4 en 15 ° C, dus gebruik een gesteriliseerde koude blok of gel pak ijs op het ECM koud te houden tijdens het werken in de verwarmde proceskamer.
   3. Pipet uit het verbruikte medium van de cultuur en gooi het in de afvalcontainer.
   4. Spoel het goed of de kolf oppervlak met behulp van 1 ml DPBS / goed en gooi de DPBS.
   5. Voeg 1-2ml warm enzym voor elk putje. Slechts zeer dichte culturen vereist 2 ml.
   6. Onmiddellijk naar de cultuur schotel of kolf aan de microscoop kamer, en zorgvuldig te observeren van de cultuur. Let op tekenen van individuele cellen beginnen af ​​te los te maken van de schotel. Wacht niet tot de cellen drijven in suspensie alvorens over te gaan naar de volgende stap.
   7. De terugkeer van de cellen naar de belangrijkste proceskamer. Met een 5 ml serologische pipet wordt 4 ml DPBS per 1 ml enzym en vervolgens krachtig pipet op en neer om de cellen los van het bronoppervlak. Als passeren van meerdere bronnen binnen een meerwandige plaat, voeg de DPBS in elk putje voor loskomen van de cellen van het individu putten.
   8. Breng het enzym en PBS celsuspensie een passende afmetingen conische buis.
   9. Als een centrifuge niet beschikbaar is in de cel productie-installatie, goed af, de conische buis, plaats het in een buffer kamer en sluit de deur gesloten.
   10. Verwijder de conische buis van buffer kamer van de laminaire stroming kant en draaien de cellen bij 100 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   11. Spuit de conische buis met 70% ethanol en breng het in de proceskamer met een bufferkamer en verdunningsfactor.
   12. Pipet uit het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 ml PSC of NSC medium. Als passeren van PSC's, zorg ervoor om ROCK-remmer in het medium bij een concentratie van 10 uM omvatten, zoals eerder beschreven ^9,10.
   13. Tel de cellen met een hemocytometer en bepaal het aantal putjes of platen vereist. Plate PSC's bij 5 x ^04-01 oktober x 10 ⁵ cellen / ^cm2. Splitsing van de NSC's bij een 1: 2 verhouding.
       Opmerking: NSCs vaak klonteren en weerstaan ​​accuraat tellen in een hemocytometer.
   14. Als cryopreservatie van de cellen nodig is, volg dan de juiste protocol ^9,10, maar zorg ervoor dat alle leveringen en het bevriezen van de media zijn van tevoren voorbereid en geplaatst in de proceskamer. DMSO is zeer giftig voor cellen bij 376; C, dus erg snel te werken. Houd de-isopropanol mantel bevriezing container bij kamertemperatuur in de laminaire stroming kap. Zodra de cryopreservatie flesjes worden gevuld en verzegeld, onmiddellijk de flesjes uit de proceskamer te verwijderen door ze door een buffer kamer.
2. Handmatige Passage van PSC
   1. Controleer of de kweek moet worden gepasseerd, zoals eerder beschreven ^8. Als dat zo is, voor te bereiden verse platen of kolven bekleed met extracellulaire matrix. Dan verander het medium geheel.
   2. Reinig de microscoop kamer met steriel gaasje bevochtigd met een sparende hoeveelheid onbrandbaar ontsmettingsmiddel - te veel zal resulteren in meer dan beslaan in de kamer. Reinig de handschoenen, vloeroppervlak, en het podium. Breng een aantal 200 ui of 1.000 III individueel verpakt pipet tips in de kamer.
   3. Breng de plaat van PSC's in de microscoop kamer, verwijder het deksel en plaats het gezicht naar beneden op de vers schoongemaakt vloer. Het verlaten van het deksel omhoog onthult de onderkant directly om luchtstromen en om mogelijke besmetting.
   4. Uitpakken van een pipet tip, en het gebruik van de microscoop om de cultuur te visualiseren, pick afgezien kolonies die goede morfologie met behulp van de punt van de pipet te hebben.
      Opmerking: De pipetpunt kan worden bevestigd aan een pipet of de individuele gebruiker dit comfortabeler vindt.
   5. Plaats het deksel op de plaat, en verplaats de plaat terug naar de proceskamer.
   6. Pipet overtollige ECM van de nieuwe plaat, en de overdracht van het materiaal uit de oude plaat (die de kolonie stukken in suspensie) aan de nieuwe plaat. Als de oude plaat nog steeds koloniën die niet klaar om te worden geplukt bevat, voer het ook.

4. Gespecialiseerde kweektechnieken

1. Sendai Transductie van fibroblasten in PSC
   1. In de cel productiefaciliteit Vouw humane huidfibroblasten ¹ in fibroblast medium met DMEM / F12, 10% FBS en 20 ng / ml FGF2, bij _5% O2. Gebruik de 6-well cultuur dishes bekleed met 0,1% gelatine.
   2. Bereid de cellen worden getransduceerd door ze dissociëren met 1 ml 0,25% trypsine per putje. Inactiveren trypsine met 1 ml fibroblast medium. Spin bij 200 xg, resuspendeer de cellen in 1 ml fibroblast medium en tellen met een hemocytometer.
      1. Resuspendeer 2,0 x 10 ⁵ cellen in 2 ml fibroblast medium en voeg de celsuspensie 1 putje van een met gelatine beklede plaat met 6 putjes (2,1 x 10 ⁴ cellen / cm ^2). Plaats de cellen opnieuw in de incubator.
   3. Wacht 24 uur om de cellen te hechten aan de onderkant van de plaat.
   4. Plaats fibroblast vers medium in de proceskamer (1 ml medium per putje van cellen worden getransduceerd), en laat het equilibreren de gassen.
   5. Steriliseren van een pre-gekoelde koude blok met 70% ethanol en plaats deze in een buffer kamer. Gebruik een gel ice pack met gaten geknipt in waard als commerciële koeltechniek blok is niet beschikbaar.
      Let op: Er zijn 3-4 aparte Sendaivirussen (afhankelijk van de versie van de transductie kit), die snel worden ontdooid, maar hield in het koude blok eenmaal ontdooid.
   6. Dompel de onderste helft van de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 15 seconden (kan de buizen niet onderdompelen), dan geeft de buis buitenkanten met 70% ethanol reinigen. Plaats de buizen op de gesteriliseerde koude blok in de buffer kamer en uitvoeren van een verdunningsfactor.
   7. Werken snel, voegt u de nodige volume van elke Sendai herprogrammering virus aan de in evenwicht gebracht medium ^2. Deze hoeveelheid wordt bepaald door drie variabelen - het aantal cellen, de titer van elk virus en de gewenste multipliciteit van infectie voor elk virus. Raadpleeg de kit handleiding voor de aanbevolen MOI. De formule is:
      
      [(Aantal cellen getransfecteerd) (multipliciteit van infectie) (1000)] / (virustiter) = vereiste gl virus
      
   8. Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de put (s) van cellen te herprogrammeren. Voor elk putje, voeg 1 ml van de medium met de virussen. Schud de plaat, dat evenwel niet tot media morsen, en plaats de plaat terug in de 5% O ₂ incubator.
   9. Na 2 uur zachtjes weer rocken de plaat en herhalen na nog eens 2 uur.
   10. Na 24 uur (dag 1 post-transductie), voeden de put met 1 ml pluripotente stamcellen medium. Herhaal dit op dag 2, maar medium niet uit de put.
   11. Op dag 3 en 4, veranderen de helft van het medium.
   12. Op dag 5 en daarbuiten, verander de hele medium.
   13. Wanneer kolonies verschijnen vlekken de kweek met steriele antilichamen te bevestigen dat de kolonies inderdaad pluripotent, zoals hiervoor ² beschreven. Zoals met voedingscellen zorgen dat de PSC medium dat de antilichamen is geëquilibreerd met de gassen in de cel productiefaciliteit.
       Opmerking: In een succesvolle herprogrammering, moet iPSC kolonies aanwezig zijn ongeveer twee weken na de transductie ^1.
   14. Wanneer de kolonies groot gegroeidgenoeg is, gebruik maken van de microscoop om te markeren en mechanisch passage ze op een ECM-gecoate plaat, zoals beschreven in paragraaf 3.2.
   15. Vouw de kolonies handmatig of enzymatisch, zoals eerder beschreven ^9,10.

5. Opruimen na dagelijks gebruik

1. Plaats alle afvalstoffen, met inbegrip van het afval fles vloeistof, in een steriele buffer kamer. Wrijf het oppervlak van de bewerkingskamer en alle gebieden die in contact zijn gekomen door levert met steriel gaas en onbrandbaar desinfectiemiddel.
2. Verwijder alle vaste afvalstoffen uit de buffer kamer en gooi in de daarvoor bestemde afvalbak.
3. Gooi vloeibaar afval in een geschikte afvalcontainer, of gewoon mengen met bleekwater en giet in de afvoer. Maak de afvalcontainer met zeep en een borstel. Steriliseer de container met 70% ethanol en zet het terug naar de proceskamer via een bufferkamer.
   Opmerking: Het is niet aan te raden om bleekmiddel te gebruiken inde afvalcontainer terwijl deze in het systeem, zoals bleekwater rook kan circuleren en schaden celculturen.
4. Om hygiënische overwegingen, vegen van het voorste plastic oppervlak van het systeem bewerkingskamer met 70% ethanol. Dit helpt schoon te maken uit het zweet en de huid oliën uit het voorhoofd van de gebruiker.
5. Als er condensatie heeft opgebouwd in de proceskamer, lopen een verdunningsfactor om de condensatie te wissen. Laat minstens 1 uur om dit te voltooien.

6. Routine Niet-dagelijkse taken

1. Vul het water gerechten in het celcultuur incubators met steriel, gedestilleerd water als dat nodig is. Bovenkant van de gerechten ten minste eenmaal per week. Toch zal de verdampingssnelheid fluctueren afhankelijk van hoe vaak de incubator deuren worden geopend, het vloeistofvolume in kweken, en de incubator instellingen.
2. Een keer per maand, opnieuw te kalibreren de O ₂ en CO ₂ instellingen in alle kamers. Dit vereist het gebruik van SPAN (kalibratie) gas, dat contains bekende concentraties niveaus van O ₂ en CO ₂ als een standaard referentie. Zorg ervoor dat er voldoende SPAN gastoevoer voordat kalibratie. Het systeem maakt gebruik van specifieke gas sensoren, gelegen in elke module, om gasconcentraties te detecteren; Zo is het gebruik van hoge kwaliteit SPAN gassen zodat de sensoren betrouwbaar op accurate gasconcentraties.
3. Vervang de handschoenen in de proceskamer en microscoop kamer regelmatig. Vervang de handschoenen om de 2 maanden, ongeacht hoe vaak het systeem wordt gebruikt. Voor de installatie, steriliseren de nieuwe handschoenen met een ontsmettingsmiddel. Voer een verdunningsfactor van de proceskamer nadat de handschoenen zijn vervangen.
   Opmerking: Wanneer gespannen over de uiteinden van het systeem, nitril hebben de neiging om gaten in omgevingen fysieke belasting en warmte ontwikkelen. Dit is normaal en onvermijdelijk slijtage.
4. Verander de spuit filters in alle kamers om de 6 maanden.
5. Vervang of was thij voorfilter op de laminaire stroming kap zodra het begint zijn vuil.
6. Raadpleeg de documenten van de fabrikant regelmatig voor informatie over de vervanging van de belangrijkste onderdelen.

7. Reiniging van het systeem

1. Bij een vervuild gebeurtenis die de meeste celkweken, bewegen alle overlevende celculturen uit het systeem, of (indien mogelijk) in een incubator onaangetast.
2. Schakel het gas controle voor alle kamers met uitzondering van onaangetast incubators.
3. Verwijder het flexibele voorpaneel van het apparaat en verwijder de rekken van roestvrij staal uit de getroffen celkweek incubator. Verwijder ook het water pan.
4. Autoclaaf de incubator planken en water pan en leg ze terug in de incubator. Veeg de binnenzijde van de incubator met 70% ethanol. Laat het ethanol verdampen, en sluit de deur incubator.
5. Veeg de oppervlakken van het proces en microscoop kamer met 70% ethanol. Vervang het voorpaneel van het apparaat.
6. Veeg de binnenzijde van de inrichting, met inbegrip van de getroffen incubator, onbrandbaar desinfectiemiddel. Laat de deur van de getroffen incubator geopend, en uitvoeren van een verdunningsfactor op de proceskamer. Zorg ervoor dat de microscoop kamer deuren ook open.
7. Voor routine-reiniging van de celcultuur incubators, ervoor te zorgen dat de couveuse en proceskamer op dezelfde atmosferische instellingen. Open de deur incubator en plaats alle celcultuurschalen op het oppervlak van de proceskamer.
8. Veeg de incubator rekken en inwendige oppervlakken met niet-brandbare ontsmettingsmiddel. Laat het ontsmettingsmiddel te verdampen, en verplaats de celculturen terug naar de incubator. Werk zo snel mogelijk uitdroging van de celkweken voorkomen.

Resultaten

Dit manuscript beschrijft in detail een cel productiefaciliteit, en de unieke aspecten van het kweken van cellen in een gesloten systeem. Het grootste deel van de cel productiefaciliteit omvat een op maat gemaakte, gesloten, celcultuur inrichting die weinig ruimte nodig heeft en kunnen eenvoudig worden ondergebracht in een 6 x 7,5 m ² kamer (figuur 2). Op geen enkel moment zijn de cellen in het apparaat blootgesteld aan laboratorium personeel of omgeving. Het apparaat bestaat uit meerdere modules: een proceskamer, een laminaire stroming kap, 2 buffering luchtsluis kamers tussen de kap en de proceskamer twee celcultuur incubators, en een microscoop kamer naast de proceskamer (figuur 3). Het systeem wordt bestuurd door software waarmee omgevingsvariabelen worden gecontroleerd en gevolgd (figuur 1). De computer waarop deze software is op een noodvoeding. Gassen worden ingevoerd in the systeem een reeks verdeelstukken voor zuurstof, stikstof en kooldioxide (figuur 4). Gassen voor het apparaat worden geleverd door spruitstuk systemen die twee sets van de tanks hebben elk - een actieve set en een reserve set. Wanneer de actieve set naar beneden wordt getrokken, schakelt het spruitstuk automatisch over naar de ingestelde reserve en het personeel orde vervanging tanks. Het vermogen is op een back-up generator systeem.

Pluripotent en neurale stamcellen kunnen worden gekweekt in hypoxische omstandigheden in deze faciliteit gebruik eerder ontwikkelde protocollen ^9, waarbij de extra complicaties die inherent zijn aan de nieuwe apparatuur. Pluripotente stamcellen kunnen worden afgeleid met Sendaivirus met behulp pluripotentie specifieke antilichamen volledig getransfecteerde kolonies, die vervolgens worden geïsoleerd en geëxpandeerd identificeren. (Figuur 5A en B) Uit deze iPSCs, neurale stamcellen en neuronen kunnen worden afgeleid met dubbele SMAD inhibitie en hun fenotype geverifieerd usi ng NSC-specifieke antilichamen (Figuur 5C en D).

Figuur 1. Grafische interface voor de Cell Production Facility. (A) De grafische weergave van de CPF is het standaard scherm en past de CAD-tekening in figuur 3. Een klik van de muis over de Buffer Module 1 (2F in figuur 1) opent zijn bedieningsscherm (B), waarin O ₂ waarden worden ingesteld op de bewerkingskamer overeenkomen (3 in figuur 3). Evenzo klikken op de proceskamer of Incubator 1 brengt hun regelschermen (C en D respectievelijk), waarbij waarden worden gewijzigd of gecontroleerd zoals dat. rGebruik = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. De Cell Production Facility. (A) Het systeem blijkt uit een front rechts uitzicht. Let op de kracht en de gasaansluitingen in het plafond en de kar met de microscoop accessoires en computer aan de rechterkant. (B) De laminaire stroming kap met de toegangspanelen buffermodules gezien rechts. (C) Het proces kamer met de twee incubators (zwarte deuren) gezien op de achterzijde. (D) Een mening door de rechterkant van het systeem met de microscoop en monitor met de deuren naar de buffer kamers gezien in de verte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 3. Een CAD-tekening van het Cell productiefaciliteit. Alle punten in het toestel eerst schoongeveegd met alcohol en lucht in de laminaire stroming kap gedroogd (1). Items worden dan overgebracht naar de passende sfeer in het voorste buffer module (2F) alvorens te worden doorgegeven aan de UCPC module of behandelingskamer (3). Cellen worden gekweekt in de twee incubatoren (4, 5). Live cell kleuring, kolonie plukken, de beoordeling van de algemene cellulaire morfologie en migratie analyse vindt plaats in de UPC-module, of Microscope Kamer (6). Ten slotte, afval verlaat het systeem via de achterste buffer module (2R). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. < / P>

Figuur 4. Bronnen van gassen en adapter. (A) Het CO ₂ spruitstuk een 4 x 4 opstelling zoals levert alle incubators van het laboratorium. (B) De O ₂ spruitstuk is een 2 x 2 opstelling en levert alleen de cel productiefaciliteit. Stikstof het systeem wordt opgewekt in een verdamper (C, net onder het teken van de uitgang) bevestigd aan een vloeibare stikstof verdeelstuk (naar rechts) die vult ook automatisch cryofreezers (linksonder). Het verdeelstuk is een 2 x 2 opstelling wordt geleverd door twee paar 160 L vloeibare stikstof tanks. _{CO2, O2} en _N2 worden vanuit het plafond tot tijdens onderbrekingen (D). Huisvacuüm wordt ook geleverd op deze locatie. Gezien net achter de gasvoorziening tijdens onderbrekingen zijn een paar van stroomkabels die stroom te leveren aan het systeem.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. pluripotente stamcellen Afgeleid in hypoxie met Sendai-virus. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenclatuur gevonden in Stover et al. ^9), fase contrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs live gekleurd met AF-594-gelabelde Tra-1-60, 1: 100 verdunning in de media. Alle iPSCs werden getransduceerd in de cel productiefaciliteit in 5% O ₂ met Sendai-virus. (C) Fase contrast van SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-afgeleide NSCs, geteeld op 5% O ₂ in de kamer dia's. Cellen werden vervolgens gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gekleurd met anti-humaan Nestin primair antilichaam en Alex-488 secundair antilichaam. Alle schaal bars liggen op 1001; m. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Cellen gekweekt binnen de CPF zie geen veranderingen in zuurstof of kooldioxide-concentraties als ze van incubator aan de verwerking van kamer naar kamer microscoop en terug. Het is essentieel dat de omstandigheden in elke kamer zijn aangepast aan de specifieke incubator waarin de cellen worden gehouden voordat de cellen uit de incubator verwijderd. De lucht binnen de inrichting continu HEPA-gefiltreerd en is aanpasbaar met betrekking tot zuurstof en kooldioxide concentraties. Cellen kunnen worden gekweekt bij standaardconcentraties voor PSC of NSC, 5% en 9%, respectievelijk; of andere concentraties kunnen worden gekozen voor verschillende celtypen of voor specifieke experimenten. Aldus is de inrichting voorzien van een constante bron van medische kwaliteit zuurstof, kooldioxide en stikstof (figuur 4). Alle drie van deze gassen worden door gas-specifieke spruitstukken die de constante levering garanderen. De inrichting is tevens voorzien van een ijkgas mengsel bestaande uit10% (± 0,01%) kooldioxide in zuurstof. De manifold systemen bevinden zich buiten de cel productie-installatie en de gassen worden doorgesluisd naar de faciliteit door het plafond. De kalibratie gas is ondergebracht binnen de faciliteit. De inrichting is bovendien voorzien huisvacuüm, ook door het plafond. Met behulp van een elektronisch bewakingssysteem en draadloze eenheden verzenden, worden de output druk van alle spruitstukken voortdurend bewaakt. In het geval dat enige druk valt buiten het bereik, zijn de cel productiefaciliteit operators automatisch gebeld en een dergelijke melding dat passende maatregelen kunnen worden genomen.

De kracht eisen van het apparaat wordt voldaan door zes dedicated 120 V circuits afdalen van het plafond en verbonden met back-up generatoren van het ziekenhuis om een ​​constante aanvoer te verzekeren. De werking van het apparaat wordt geregeld via software op een pc-computer wordt aangedreven door middel van een noodvoeding. Deze kracht en computer regelingenzorgen dat het systeem functioneert onophoudelijk zelfs bij een openbare stroom systeemfout. De software besturen van de inrichting een gebruikersvriendelijke grafische interface (figuur 1) die zorgt voor de besturing van zuurstof en kooldioxide concentratie en temperatuur, vochtigheid en kamerdruk. De waarden van deze parameters worden continu geregistreerd op een doorlopend verslag van alle apparatuur parameters. Deze data back-up naar een externe server elke nacht om hun integriteit te beschermen. De computer en de software kan op afstand worden benaderd door administratieve gebruikers in staat om te beoordelen en / of te wijzigen parameter. Bovendien kan de computer en software afstand toegankelijk, waardoor interactieve parameters van apparaten en probleemoplossing lokale gebruikers. Een extra verzendende eenheid alarm is aangesloten op het apparaat zoals die cel productiefaciliteit exploitanten in kennis worden gesteld van een out-of-range toestand van het apparaat. De toegang op afstand capabilities laten inloggen en de beoordeling van de specifieke kenmerken van de out-of-range conditie.

De inrichting is ontworpen als een modulair systeem zowel macro- en micro zin. Individuele celkweek modules, zoals incubatoren en behandelingskamers, kan worden aangepast met betrekking tot hun afmetingen en eisen en in hun indeling ten opzichte van elkaar. Bovendien, de meeste van de functies van de afzonderlijke modules zelf modulair zodat individuele atmosferische gas controllers, bijvoorbeeld, kan gemakkelijk worden vervangen zonder significante verstoring van het systeem.

Gespecialiseerde behandelingskamers, zoals een voor microscopische visualisatie en manipulatie van celkweken, worden gemakkelijk aangepast aan het systeem. Zowel fase-contrast en fluorescentie microscoop in het systeem (figuur 6), zodat de cellen levend kan worden gekleurd, en kolonies kunnen op dezelfde atmosferische omstandigheden worden ontleed als in thij incubators. Routeren van kabels door afgedichte dichtingsringen in de zijwanden van de bewerkingskamer laat apparatuur zoals voedingen en computers buiten de inrichting worden gehouden, gewoonlijk op een kar (figuur 6).

De behandelingskamers in de cel productiefaciliteit heeft een ander patroon dan conventionele luchtstroom BSC. In conventionele BSC, de luchtstroom naar beneden stroomt vanuit een centrale uitlaat en splitst in twee aparte stromen, die vervolgens door twee verschillende luchtinlaten zijn genomen in het voorste en achterste gedeelte van de vloer van het kabinet. Daarentegen heeft de CPF een enkele opening in het voorste gedeelte van het plafond. Lucht naar beneden stroomt en naar de achterkant van de kamer, waar het dan omhoog in een luchtinlaatopening getekend. Hoewel de CPF inherent zeer schoon, unieke luchtstroom patroon betekent dat technici hun techniek om het risico op verontreiniging te verminderen enigszins aanpassen. Net als bij een conventionele BSC, een laboratoriumarbeider should Vermijd het plaatsen van hun handen stroomopwaarts open celkweek platen en media flessen. Echter, de richting die stroomopwaarts is veranderd in de CPF

De cel productiefaciliteit laboratorium zelf is vrij standaard en is uitgerust met een -20 ° C vriezer, een -80 ° C vriezer, een 4 ° C koelkast, een centrifuge en een waterbad. Het laboratorium heeft ook een wastafel met voet controles voor gemakkelijk hands-free bediening. Om dit laboratorium een ​​functionele klinische cel productiefaciliteit worden echter verschillende andere wijzigingen moeten blijven mogelijk. Ten eerste moet de inrichting zelf worden opgewaardeerd tot het vermogen om vluchtige organische stoffen, deeltjes en concentraties van chloordioxide dat wordt gebruikt voor decontaminatie gaten te houden. Ten tweede kan een bewerkingskamer met een FACS-machine worden gehuisvest en verbonden met de rest van de inrichting via een buffer module. Dit zal zorgen voor celsortering en zuivering van transplantable celpopulaties onder de juiste omstandigheden. Ten slotte moet de gehele inrichting worden opgenomen binnen een zachte wand clean room. Dit zorgt voor een International Organization for Standardization (ISO) klasse 8 omgeving voor het apparaat ^5.

De hoge steriliteit en computergestuurde karakter van het CPF maakt het een ideaal systeem voor toekomstige toepassingen met cellen gebaseerde therapie en goede productieprocessen. Het risico op besmetting is sterk afgezwakt, maar nog belangrijker, zijn de voorwaarden van de cel expansie automatisch geregistreerd en gearchiveerd door het computersysteem. Afwijkingen in gasconcentraties, temperatuur, vochtigheid, en alle gebeurtenissen van de toegang tot het systeem worden streng gedocumenteerd. Dit kan enorm helpen bij het onderzoeken van problemen met de productkwaliteit. Er zijn echter nog steeds beperkingen. Het gebruik van elke en alle reagentia en benodigdheden (bv media componenten, pipetten, platen) moet afzonderlijk worden gedocumenteerd. Toevoegenitionally, er een veelheid van mogelijke problemen (waaronder veel vormen van menselijke fout) die kan ontstaan ​​die niets met de variabelen gedocumenteerd door de CPF toezichtsysteem zijn. Dus de noodzaak van hoog opgeleid personeel en uitgebreide handmatige documentatie van taken blijft bestaan.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Uitrusting
Xvivo Systeem	Biospherix	op maat gemaakt
Xvivo Software	Biospherix	versie i.o.2.1.2.1
O2 Manifold	Amico	P-M2H-C3-S-U-OXY
CO2 Manifold	Amico	M2H-C3-D-U-CO2
N2 Manifold	Western Innovator	CTM75-7-2-2-BM
Microscoop met DP21 camera en fluorescentie	Olympus Corporation	CKX41
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia
DMEM/F12 Glutamax	Life Technologies	10565-018
StemPro hESC Supplement	Life Technologies	A100006-01
Accutase	Millipore	SCR005
Fosfaat-gebufferd Natrium	Hyclone	9236
Fibroblast Groei Factor 2	R&D Systems	AFL233
Dimethyl sulfaat	Protide	PP1130
Hank's-based Celdissociatie Buffer	Life Technologies	13150-016
2-Mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Epidermale Groei Factor	R&D Systems	AFL236
Oct-3/4 Antilichaam	Millipore	AB3209
TRA-1-60 Antilichaam	Millipore	MAB4260
SSEA4 Antilichaam	Millipore	MAB4304
BIT-9500 Serum Supplement	Stemcell Technologies	9500
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Consumptieve Benodigdheden
2 ml Serologische pipet	VWR	89130-894
5 ml Serologische pipet	Olympus Plastics	12-102
10 ml Serologische pipet	Olympus Plastics	12-104
25 ml Serologische pipet	Olympus Plastics	12-106
50 ml Serologische pipet	Olympus Plastics	12-107
6-well plate	Corning	353046
12-well plate	Corning	353043
T25 fles	TPP	90026
T-75 fles	TPP	90076
20 µl pipet tips	Eppendorf	22491130
200 µl pipet tips	Eppendorf	22491148
1.000 pipet tips	Eppendorf	22491156
Cryovials	Thermo Scientific	5000.102
70% ethanol	BDH	BDH1164-4LP
Sanimaster 4	Ecolab	65332960
Bleekmiddel	Clorox	A714239