Methodenartikel

Sex Verschillen in Mouse hippocampus Astrocytes na

13.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53695

⸱

25 oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

In dit artikel

Samenvatting

Astrocyten een van de belangrijkste belangrijkste spelers in het centrale zenuwstelsel (CNS). Hier worden we melding van een praktische methode van gesekst hippocampus astrocyten cultuur protocol om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de astrocyt functie in de mannelijke en vrouwelijke pasgeboren pups na in-vitro ischemie te bestuderen.

Samenvatting

Astrogliosis na hypoxie / ischemie (HI) -gerelateerde hersenletsel speelt een rol bij verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij pasgeborenen. Recente klinische studies geven aan dat de ernst van hersenletsel lijken geslacht afhankelijk zijn, en dat de mannelijke pasgeborenen zijn vatbaarder voor de effecten van HI-gerelateerde hersenletsel, hetgeen leidt tot ernstige neurologische gevolgen dan bij vrouwen met vergelijkbare hersenletsel. De ontwikkeling van betrouwbare methoden voor het isoleren en te onderhouden sterk verrijkte populaties gesekst hippocampus astrocyten is essentieel voor de cellulaire basis van geslacht verschillen in de pathologische gevolgen van neonatale HI begrijpen. In deze studie beschrijven we een methode waarbij seksespecifieke hippocampale astrocyt culturen die zijn onderworpen aan een model van in vitro ischemie, zuurstof glucose ontbering, gevolgd door reoxygenatie. Latere reactieve astrogliosis werd onderzocht door immunostaining voor de Glial Fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en S100B. Deze methode verschaft een bruikbaar instrument om de rol van mannelijke en vrouwelijke hippocampus astrocyten na neonatale HI bestuderen afzonderlijk.

Inleiding

Astrocyten een van de belangrijkste belangrijkste spelers in het centrale zenuwstelsel (CNS). Groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal wijst erop dat de rol van de astrocyten zijn meer dan het verstrekken van neuronale ondersteuning. In feite kan de rol van astrocyten onder fysiologische omstandigheden zeer complex zijn, zoals geleiden van de migratie van de ontwikkeling axonen 1, reguleren CNS bloedstroom 2, de pH homeostase van de synaptische interstitiële vloeistof 3, en die aan de bloedhersenbarrière 4 en 5 synaptische transmissie. Onder pathologische omstandigheden, astrocyten reageren op verwonding met een proces genaamd reactieve astrogliose waarbij de morfologie, aantal, plaats, topografie (ten opzichte afstand van lozing) en functie van de astrocyten kan veranderen in een heterogene wijze 6,7. Astrogliosis waargenomen na neonatale hypoxische ischemische encefalopathie misschien bijdragen tot de morbiditeit en mortaliteit van neonaten 8.

Recente klinische en experimentele studies geven aan dat de ernst van hersenletsel blijkt sex-afhankelijke zijn en dat de mannelijke pasgeborenen zijn vatbaarder voor de effecten van hypoxie / ischemie (HI) -gerelateerde hersenletsel, hetgeen leidt tot ernstige neurologische resultaten in vergelijking met vrouwen met vergelijkbare hersenletsel 9-11. Hoewel de lokalisatie van het letsel is afhankelijk van de zwangerschapsduur en de duur en de ernst van de belediging, hippocampus is een van de meest bewerkstelligd gebieden in het CNS na term neonatale HI en verhoogde hippocampale astrogliosis is bevestigd door opregulatie van de Glial Fibrillaire zuur eiwit (GFAP) 3 d na de neonatale HI 7,10,12,13. Sekseverschillen in de astrocyt functie werden getoond in zowel pasgeborenen en volwassenen knaagdieren na cerebrale ischemie 14,15. Bovendien mannelijke astrocytic gevoeligheid voor in vitro ischemie werd aangetoond door verhoogde cell overlijden in vergelijking met vrouwelijke corticale astrocyten in de cultuur 16.

Sekseverschillen starten in de baarmoeder en gaan door tot de dood 17. In het afgelopen decennium is het belang van het opnemen van de seksen in experimentele omstandigheden in celcultuur en in-vivo studies hebben de nadruk van het Institute of Medicine en de NIH om fundamentele kennis te zoeken in de sekseverschillen gezien in fysiologische en pathologische omstandigheden 17,18 . Ontwikkeling van betrouwbare methoden voor het isoleren en populaties gesekst hippocampus astrocyten behouden is essentieel voor de cellulaire basis van geslacht verschillen in de pathologische gevolgen van neonatale HI begrijpen. De huidige studie werd ontworpen om de technieken te verstrekken aan verrijkte seksespecifieke hippocampus astrocyten culturen van pasgeboren muizen te bereiden met het oog op de rol van GFAP-immunoreactieve astrocyten volgende Oxygen / Glucose beroving (OGD) en reoxygenatie (Reox), het induceren beoordelenHI in celcultuur omgeving. Deze techniek kan worden gebruikt om een ​​hypothese met betrekking tot de hippocampus astrocyten neonatale mannen en vrouwen onder normoxische en ischemische aandoeningen testen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbeveling van de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van het National Institute of Health. Het dier protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care en gebruik Comite. Primaire Astrocyte Cultuur protocol dat hier wordt gepresenteerd is overgenomen uit de door Zhang Y 19 et al., En Cengiz P 20 et al protocollen. Met enkele wijzigingen.

1. hippocampus Dissection en Astrocyte Cultuur

  1. Bereid alle benodigde reagentia en materialen, waaronder chirurgische schaar, gladde fijne tang, platte tip tang, papieren handdoeken, afvalzak, 70% ethanol en 2 ontleden gerechten (3,5 cm diameter) op ijs gevuld met 2 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) elk . Zorg ervoor dat de chirurgische apparatuur zijn steriele (autoclaaf) voorafgaand aan de procedure en gebruik maken van alle andere materialen (Astrocyte plating medium: DMEM + 5% paard serum +1% penicilline-streptomycine, paardenserum, HBSS, 0,25% trypsine, dekglaasjes, petrischaaltjes, 15/50 ml buizen, T25 flessen, etc.) als pre-steriel.
  2. Zachtjes te houden en spuit het hoofd en de nek van de muis pup met 70% ethanol en onthoofden met een scherpe steriele schaar [Figuur 1 (1)].
  3. Voer een middellijn incisie van posterior naar anterior schedel met een klein schaartje langs de hoofdhuid naar de hersenen [Figuur 1 (2-3)] bloot te leggen.
  4. Snijd de schedel voorzichtig uit de nek naar de neus met een klein schaartje. Snijd vervolgens schedel anterior aan de olfactorische bollen en inferieur aan de kleine hersenen met de schedel van de schedelbasis verbreken.
  5. Voeg een kleine incisie aan de basis van de schedel en gesneden langs de middellijn. Gebruik steriele flat-tip tang om afpellen van de schedel. Verwijder de hersenstam met behulp van een gebogen pincet. Verwijder hersenen uit de schedel en plaats in de eerste ontleden schotel [Figuur 1 (4-9)] 21.
  6. Met behulp van een gebogen pincet, flip de hersenen, zodat het ventrale oppervlak van de hersenen naar boven en dan scheiden beide hemisferen met een scherpe steriele chirurgische mes [Figuur 1 (10,11)]
  7. Trek de hersenhelften en verwijder voorzichtig de uitpuilende middenhersenen en de thalamus weefsel met een steriele flat gebogen tang om de hippocampus, een kleine, zeepaardje-vormige structuur in de mediale temporale kwab [Figuur 1 (12-14)] onthullen.
  8. Verwijder zowel de hippocampus lobben [Figuur 1 (15,16)] en zorgvuldig ontleden de hersenvliezen van de lobben door te trekken met de fijne pincet. Deze stap voorkomt vervuiling van de finale astrocyten cultuur door het meningeale cellen en fibroblasten.
  9. Breng de voorbereide hippocampus lobben in de tweede schotel gevuld met HBSS en terug te sturen op ijs [Figuur 1 (17,18)]. Pool zowel hippocampus lobben van een enkele muis (P0 - P2) voor de bereiding van hippoCampal astrocyt culturen. Dit geeft de astrocyt juiste dichtheid. Mince hippocampus lobben met een scherp steriel chirurgisch mes (ongeveer 4 keer).
  10. Aspireren van HBSS schotel met een steriel uiteinde bevestigd aan een 1 ml pipet en voeg 3 ml 0,25% trypsine, mengen, overbrengen naar een 15 ml steriele conische buis en incubeer het weefsel bij 37 ° C gedurende 20 minuten onder zacht schudden.
  11. Centrifugebuis bij 300 g gedurende 5 min. Zuig supernatant voorzichtig met een steriele glazen pipet verbonden met een vacuüm lijn. Voeg 10 ml astrocyten plating medium en vermaal (20 - 30 maal) met behulp van een brand gepolijst glas pipet totdat stukken weefsel te homogeniseren.
  12. Centrifugebuis bij 300 g gedurende 5 min. Zuig supernatant en voeg 2 ml vers voorverwarmde astrocyten plating media. Passeren cellen door een 70 urn zeef (cel zeef) in een nieuwe 50 ml conische buis.
  13. Plaat gehele celsuspensie op een Poly-D-Lysine / laminine beklede steriele T25 kolf met 3 mlastrocyt uitplaatmedia, dan incubeer de kolf bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
  14. Zuig gehele media op dag- i n-vitro (DIV) 1, 3 en DIV DIV 7, en te vervangen door 2 ml vers astrocyten plating media. Let op de progressie en astrocytaire samenloop onder lichtmicroscoop elke keer bij het vervangen van de astrocyten plating media.
    OPMERKING: Bij DIV 1, alle levensvatbare astrocyten aan het oppervlak van de kweekfles en de dode of stervende cellen die omvatten neuronen drijven in de supernatant. Bij DIV 3, de aangehechte cellen beginnen te verdelen astrocytaire cellaag vormen. Aangezien het ondersteunende omstandigheden cultuur vrijwel verstoken van elke neuronale groei. Bij DIV 7, astrocyten laag ongeveer 80-90% confluent en enkele microglia en oligodendrocyt voorloper cellen aanwezig zijn bovenop de astrocytaire laag.
  15. Zuig de beplating medium uit de fles, voeg 2 ml vers voorverwarmde astrocyten plating medium, spoel eennd verwijderen opnieuw bij DIV 11, toen astrocyten zijn confluent en klaar voor sub kweken.
  16. Voeg 2 ml 0,25% trypsine, zachtjes draaien de kolf een paar keer en zuig trypsine met behulp van een steriele glazen pipet.
  17. Voeg 2 ml 0,25% trypsine en laat de kolf zitten in de weefselkweek kap voor 4-5 min bij RT.
  18. Verwijder de trypsine en houd de kolf bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 10 minuten. Voeg 5 ml voorverwarmde astrocyten plating medium en maak de astrocytaire laag door de kolf tegen de palm van je hand te tikken (3-4 keer), gevolgd door zachte tritureren om volledige onthechting te bereiken en het verzamelen van de astrocyten in een 15 ml conische buis.
  19. Centrifugebuis bij 300 g gedurende 5 minuten, zuig de supernatant en voeg 1 ml vers medium astrocyt plating.
  20. Voeg 10 ul van de celsuspensie een hemocytometer en tel de cellen in de grote centrale gerasterde oppervlak (1 mm 2) met een omgekeerde fase contrast microscoop (10X objectief). Multiply met 10 4 tot het aantal cellen per ml schatten. Een T25 fles zal opleveren ~ 1 x 10 6 totaal gescheiden cellen. Zaad ~ 1 x 10 5 cellen in 2 ml medium astrocyten plateren op een 12 mm diameter poly-D-lysine vooraf beklede glazen dekglaasje in de put van een 24-well kweekplaat.
  21. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Voer OGD / Reox bij DIV 12-14 (deel 2).
  22. Behandel de astrocyten kweken bij DIV 3 met 5 mM L-leucine Methyl Ester (LME) hydrochloride tot DIV 11 als de hippocampus culturen verstoken van microglia gewenst zijn. Na LME incubatie onderworpen aan kweken onder schudden (300 rpm gedurende 1 h) verwijderen verontreinigende microglia.
    OPMERKING: LME een microgliale cytotoxisch middel die uitgebreid is gebruikt als een werkwijze te elimineren prolifererende microglia 22.

2. OGD / Reox Treatment

  1. Aspireren media van dekglaasje met aanhangend astrocyten cultuur (DIV 12-14) en spoel 3 keerdoor voorzichtig draaien van de 24-well kweekplaat met het dekglaasje een paar keer met 1 ml isotone OGD oplossing (pH 7,4) bevattende (in mM): 0 glucose, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2PO 4, 1,27 CaCl2 en 0,81 MgSO4.
  2. Voeg 0,2 ml OGD oplossing goed op het dekglaasje te bedekken en incubeer gedurende 2 uur in een hypoxische incubator met 94% N2, 1% O2 en 5% CO2. Meng met een rondschudapparaat (50 rpm) voor de eerste 30 minuten van hypoxie om de gasuitwisseling te bevorderen.
  3. Incubeer normoxische controlecellen gedurende 2 h in 5% CO2 en atmosferische lucht in een buffer identiek aan de OGD oplossing behalve de toevoeging van 5,5 mM glucose.
  4. Voor Reox, aspireren OGD-oplossing en voeg 2 ml astrocyten plating medium. Incuberen in 5% CO2 en atmosferische lucht bij 37 ° C gedurende 5 uur.

3. Immunocytochemisch kleuring

  1. Zuig het kweekmedium met een steriele glazen pipet bevestigd aan een vacuümleiding en snel spoel dekglaasje eenmaal door toevoeging van 1 ml 0,1 M Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) (154 mM NaCl, 16 mM Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) naar de bron. Aspireren en voeg 2 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Aspireren en voeg 1 ml van 0,1 M TBS en plaats op een schommelende schudder gedurende 2 min. Herhaal dit 3 keer. Voeg 1 ml blokkeeroplossing (10% geit serum, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 in 0,1 M TBS) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C op een rocking shaker.
  3. Aspireren blokkeeroplossing en voeg primair monoklonaal anti-GFAP-antilichaam (0,2 ml van een 1: 500 verdunning in blokkeeroplossing) en konijn polyklonaal anti-S100B (1: 500) of konijn polyklonaal anti-HIF1α (1: 200) gedurende 60 min bij 37 ° C op een rocking shaker.
  4. Alternatief zijn enkele astrocyten geïncubeerd met konijn polyklonaal anti-IBA1 (1: 200) en muis maaoclonal anti-MAP2 op toegang tot cultuur zuiverheid.
  5. Zuig primair antilichaam en spoel dekglaasje door het toevoegen van 1 ml 0,1 M TBS en het in een rockende shaker gedurende 2 minuten en vervolgens aspireren. Herhaal dit twee keer.
  6. Voeg 0,2 ml van een 1: 200 verdunning van het secundaire geit anti-konijn-488 geconjugeerd anti-muis 568-geconjugeerde antilichamen in blokkeeroplossing gedurende 60 minuten bij 37 ° C op een rocking shaker.
  7. Zuig secundair antilichaam en spoel dekglaasje door het toevoegen van 1 ml 0,1 M TBS en leg ze op een rockende shaker gedurende 2 minuten en vervolgens aspireren. Herhaal dit twee keer.
  8. Verwijder dekglaasje uit goed en droog door het plaatsen op een dia geplaatst op een dia-droger. Mount dekglaasje op een nieuwe dia door het omkeren op een enkele druppel Vectashield hardset montage medium met DAPI (1,5 ng / ul).
  9. Afbeelding dekglaasjes op een confocale microscoop met behulp van 20x droog of 60X olie doelstelling. Acquire beelden (512 x 512) voor DAPI (405 nm ex / 450 nm em) en fluorochroom 488 tag GFAP antilichaam (488 nm ex / 515 nmem). Houd acquisitie parameters constant binnen de 20X en 60X groepen.

4. Geslacht Bepaling Met behulp van PCR

  1. Warmte pup teen of vinger teennagelknipsels bij 95 ° C gedurende 45 min in 50 mM NaOH en geneutraliseerd met een gelijk volume 1 M Tris, pH 6,8.
  2. Voeg 1 ul van de geëxtraheerde DNA-oplossing aan 19 ul van het volgende mengsel: 5 pmol primers voor Myog en Sry genen, 1 x reactiebuffer, 0,2 mM elk deoxynucleotide en 8 U Taq polymerase.
  3. Gebruik primers sequenties; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' en Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Voer de volgende PCR-protocol: 95 ° C gedurende 3 min daarna 30 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 s, hybridisatie bij 58 ° C gedurende 15 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min. Na deze 30 cycli, de reactie een afsluitend 72 ° C verlenging gedurende 1 min.
  5. aparte PCR elektroforetisch producten op ethidiumbromide-bevattende 2% agarosegel en zichtbaar onder UV-belichting. (Figuur 2A.) LET OP! Ethidiumbromide is een potentieel kankerverwekkend is en moet zorgvuldig worden behandeld en afgevoerd volgens de geldende voorschriften instelling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Inzicht in de rol van gesekst astrocyten functies onder fysiologische of pathofysiologische omstandigheden zijn enorm opgehelderd door het kweken van deze cellen onder in vitro omstandigheden. Het belangrijke aspect van het uitvoeren gesekst kweken is het geslacht van de muis pup vaststellen vóór het gebruik. We bepaalden het geslacht van de muis genetisch door PCR en door visuele inspectie (figuur 2) 16. De methodologie van geslachtsbepaling met behu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Met het oog op de sekseverschillen in de eigenschappen en de functie van astrocyten onder fysiologische en pathologische omstandigheden te bestuderen, de voorbereiding van gesekst primaire astrocyten in celkweek is een belangrijk instrument om te gebruiken. In de huidige studie rapporteren we een zeer efficiënte en een reproduceerbare methode om de cultuur van een sterk verrijkt homogene populatie van gesekst hippocampus astrocyten van pasgeboren (P0-P2) C57BL / 6 (wild type) of K19F (GFAP null) muis pups in-vitro.<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen van de auteurs hebben concurrerende of tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Het Clinical and Translational Science Award-programma van NCATS UL1 TR0000427 en KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 aan de UW ICTR van NIH/NCATS en fondsen van het Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 van NINDS (Cengiz P) en NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We willen Albee Messing, PhD, bedanken voor het verstrekken van de GFAP knockout-muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Astrocyte culture media
DMEM, high glucosecellgro10-013-CV
Horse SerumGibco26050-070Finale Concentratie: 10%
Penicillin-StreptomycinCellgro 30-002-CIFinale Concentratie: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochlorideAldrichL1002-25GFinale Concentratie: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSSLife Technologies14170-088
Trypsincellgro25-050-CIFinale Concentratie: 0,25%
Overig
70% (vol/vol) ethanolRoth9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm ronde dekglasjes Corning354087
WaterSigmaW3500Cell-culture kwaliteit
PBScellgro21-040-CVCell-culture kwaliteit
0,05% Trypsin-EDTA Life Technologies25300-062
70 μm Steriele cel zeef Fisher scientific22363548
3,5 cm Petri schaalBD Falcon353001
15 mL Falcon buisBD Falcon352096
50 mL Falcon buisBD Falcon352070
Pincet, fijn Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
Pincet, platte puntKLS Martin12-120-11
13 cm chirurgische schaarAesculapBC-140-R
Confocale MicroscoopNikonA1RSi 
CentrifugeEppendorf5805000.0175804R
Orbitale ShakerThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
Anti-IBA1Wako019-19741Konijn monoklonaal
Anti-MAP2SigmaM2320Muis monoklonaal
Anti-HIF1alphaabcamab179483Konijn monoklonaal
Anti-S100BSigmaHPA015768Konijn polyklonaal
Anti-GFAP (cocktail)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Konijn IgG)Vector LabsPK-6101Bevat 4 Reagentia 
Goat Anti Konijn Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
Goat Anti Muis Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004

Referenties

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294(2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282(2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zuurstof en glucoseprivatieastrocytenkweekreactieve astroglioseGFAP expressieS100B expressieneonatale hersenschadeimmunofluorescentiekleuring

Gerelateerde artikelen