Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo's
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gen-silencing- en overexpressietechnieken zijn essentieel voor de identificatie van genen die betrokken zijn bij embryonale ontwikkeling. Directe modificatie van doelgenen in pre-implantatie embryo's biedt een manier om de onderliggende mechanismen van genen te bestuderen die betrokken zijn bij, bijvoorbeeld, cellulaire differentiatie naar het trofoblast (TE) en de innerlijke cell mass (ICM). Hier beschrijven we een protocol dat de rol van neogenin onderzoekt als een authentieke receptor voor initiële celbestemmingsbepaling in pre-implantatie muis-embryo's. Eerst bespreken we de experimentele manipulaties die werden gebruikt om gain en loss of neogenin-functie te produceren door micro-injectie van neogenin cDNA en shRNA; de effectiviteit van deze aanpak werd bevestigd door een sterke correlatie tussen de paarsgewijze expressieniveaus van ofwel rood fluorescerend proteïne (RFP) of groen fluorescerend proteïne (GFP) en de immunocytochemische kwantificering van neogenin-expressie. Ten tweede leidt overexpressie van neogenin in pre-implantatie muis-embryo's tot normale ICM-ontwikkeling terwijl neogenin knockdown ervoor zorgt dat de ICM abnormaal ontwikkelt, wat impliceert dat neogenin een receptor zou kunnen zijn die extracellulaire signalen doorgeven om blastomeren naar vroege celbestemmingen te leiden. Gezien het succes van dit gedetailleerde protocol bij het onderzoeken van de functie van een nieuwe embryonale ontwikkelingsstadium-specifieke receptor, stellen we voor dat het potentieel heeft om te helpen bij het onderzoeken en identificeren van andere stadium-specifieke genen tijdens embryogenese.
Inleiding
Preimplantatie embryonale ontwikkeling kan worden onderverdeeld in verschillende afzonderlijke fasen, van de ene cel stadium de morula en blastocyst. Veel bewijs suggereert dat de polariteit en positionele signalen een rol spelen in het begin van lot van de cel bepaling in de kaart spelen trophectoderm (TE) en de binnenste celmassa (ICM). De aard van de signalen, hoe ze worden getransduceerd in cellulaire signalen en de fysiologische contexten waarin zulke signalen kunnen initiëren cellijn differentiatie niet bekend. Deze gedifferentieerde cellen vervolgens aan specialisatie, beginnend op kenmerkende structuren en functies voor embryo vorming en groei van de placenta 1-3 te nemen.
Pre-implantatie embryo's zijn bijzonder vatbaar voor manipulatie door directe injectie van genetisch gemodificeerde materialen zoals siRNA of cDNA doelwit en kan dus worden gebruikt om specifieke doelmoleculen bestuderen. Er is een groeiend besef dat de genetischeanalyse van gewervelde embryo's is van cruciaal belang voor onze kennis van de embryonale ontwikkeling 4. Preciezer van een wildtype gen of een mutante vorm tot een embryo in een geschikte context te bereiken gain of verlies van functie van het gen aanzienlijk vergemakkelijkt de studie van ontwikkeling gereguleerde genen. Verlies- en gain-of-function via micro-injectie van genetisch materiaal in afzonderlijke niet-zoogdieren en zoogdieren embryo begin relatief eenvoudig vanwege hun grote omvang en grote ontvankelijkheid 5. Micro-injectie wordt meestal uitgevoerd met behulp van niet-virale vectoren. Bijzonder voordeel is gehouden met het gemak van het gebruik van niet-virale vectoren in virale vectoren en transgenen. Een snelle verlies- of gain-of-function expressiesysteem in muizenembryo's is ontwikkeld dat ons in staat stelt te ontleden en te begrijpen genfuncties in gewervelde embryologie 6,7.
TL-etikettering van embryo's zou zeer de selectie van MICR vergemakkelijkenoinjected of genetisch gemanipuleerde embryo en tegelijkertijd verlenen middel indirect kwantificeren van het expressieniveau van microgeïnjecteerde siRNA of cDNA gebaseerd op fluorescentie-intensiteit 8. Om deze etikettering, fluorescerend eiwit cDNA, GFP of RFP te bereiken, zijn co-geïnjecteerd als ofwel fusieconstructen of afzonderlijk. De fluorescentie-intensiteit van GFP of RFP onthult de mate van expressie van siRNA of vreemd DNA dat verliesgevende zorgen of gain-of-function is bereikt.
Hier presenteren we een micromanipulatie protocol voor verlies- en gain-of-functie techniek die ons toeliet om neogenin identificeren als een receptor die extracellulaire signalen belangrijk in het begin van celdifferentiatie relais in pre-implantatie muizenembryo's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Alle procedures voor het fokken van dieren en zorgen werden uitgevoerd volgens de IACUC reglementen van Sahmyook University, Seoul, Zuid-Korea.
1. superovulatie, Fokkerij en eileider Isolation
- Handhaaf inteelt C57BL / 6 muizen onder de volgende voorwaarden: 22 ± 3 ° C, ~ 60% luchtvochtigheid, 12 uur licht / donker-cyclus, en water en voedsel ad libitum.
- Induceren van superovulatie van 3-5 weken oude vrouwelijke muizen door een intraperitoneale injectie van 5 IU drachtige merrie serum gonadotropin (PMSG) bij 0,1 ml / head gevolgd 48 uur later gevolgd door een intraperitoneale injectie van 5 IE humaan choriongonadotrofine (hCG) bij 0,1 ml /hoofd.
- Onmiddellijk na hCG injectie, paren-superovulatie geïnduceerde vrouwen met seksueel volwassen mannetjes van dezelfde stam door ze in dezelfde kooi nachts.
- De volgende ochtend, bevestigt geslaagde dekking door de aanwezigheid van een paring stekker of vaginale plug op de vrouwelijke geslachtsorganen.
- Sacrifice zwangere vrouwelijke muizenmet CO 2 vergiftiging gevolgd door cervicale dislocatie 18-20 uur na hCG injectie.
- Open de buikholte van het snijden van de huid en de peritoneale laag met fijne schaar.
- Pak de baarmoeder horens met fijne pincet en weg te trekken van de baarmoeder, eileider, eierstok, en vet pad voorzichtig uit de lichaamsholte.
- Snijd het gebied tussen de eileider en de eierstokken met een fijne schaar. Plaats de pincet en snijd de baarmoeder bij de eileider, waardoor ten minste 1 cm van de bovenkant van de baarmoeder gehecht.
- Breng de ampul oviductal een 35 mm petrischaal met M16 medium bij kamertemperatuur. de eileiders uit verschillende muizen bundelen in dezelfde schotel.
- De schaaltjes onder een stereomicroscoop voor het ophalen van embryo.
2. Retrieval en cultuur van de 2-Pronucleaire (2-PN) Embryo's
- Snij het einde van een 30 of 32 G injectienaald, vermalen in een stompe punt, en gebruik het als een blozen naald.
- Gebruikenfijn pincet te glijden het einde van de eileider op het doorspoelen naald. Druk de punt van de naald spoelen tegen de bodem van de schaal om het op zijn plaats houden. Spoel de eileider met ~ 0,1 ml M16 medium aan de 2-PN embryo introductie in een petrischaal.
- Herstellen van de 2-PN embryo's, samen met de omliggende cumulus massa's uit het gespoelde M16 medium onder de stereomicroscoop met een steriele glazen pipet en overbrengen naar een nieuwe petrischaal.
- Distantiëren cumulus cellen van de 2-PN embryo door enzymatische digestie met 1,0 ml 0,1-0,5% hyaluronidase in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
- Beroven embryo's door voorzichtig pipetteren met een glazen pipet en fysieke verwijdering van cumulus cellen.
- Wassen ontdaan embryo driemaal met 30-50 ml vers fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per embryo.
- Incubeer embryo in een 35 mm plastic petrischaal in M16 medium, aangevuld met 10 mg / ml runderserumalbumine (BSA, Fraction V) bij 37 ° C in 5% CO2 in een bevochtigde incubator tot micro-injectie wordt gemaakt, die doorgaans minder dan 4 uur later.
3. Embryo Reverse transcriptie (RT) en Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Vang minimaal 10 embryo's van elke fase tot het blastocyststadium en bundelen ze in 4,0 pl 5x reverse transcriptase vooraf gemengde oplossing bevattende reverse transcriptase, RNase inhibitor, oligo dT primer, willekeurig 6mers, dNTP mengsel en de reactiebuffer in een PCR-buis.
- Add RNase-vrij gedestilleerd H2O tot een totaal volume van 20 pl en de ultrasone trillingen samengevoegd embryo gedurende 30 seconden bij 200 W. Start de RT-reactie direct bij 42 ° C gedurende 1 uur gevolgd door 5 minuten incubatie bij 95 ° C.
- Voor elk 5,0 pl cDNA-oplossing gegenereerd, uitvoeren normale PCR amplificatie met primers voor neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4 of β-actine (primersequenties in tabel 1. PCR bestaat uit 40 cycli van 15 seconden incubatie bij 95 ° C, 30 sec bij annealing temperatuur (Tabel 1), en 30 sec bij 72 ° C.
- Afzonderlijke PCR-producten door elektroforese op een 2% agarosegel en zichtbaar de gel onder UV-licht na kleuring met ethidium bromide.
- Normaliseren doelwitgenexpressie tegen β-actine levels.
4. Immunocytochemie van embryo
- Fix embryo's van elke fase met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door een korte 3 keer wassen met PBS dat 0,01% BSA.
- Doorlaatbaar Celmembranen door incubatie 10 embryo's in 1,0 ml PBS die 0,1% Tween 20 en 0,1% Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Niet-specifieke binding te blokkeren incubeer de gepermeabiliseerde embryo in 1,0 ml PBS aangevuld met 10% normaal geit serum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de geblokkeerde embryo with konijn anti-neogenin antilichamen bij 1: 100 verdunning in PBS met 0,1% BSA gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Na drie wassingen gedurende 30 seconden elk in druppels PBS, incubeer embryo met ofwel Alexa 488-geconjugeerde geit anti-konijn IgG of Alexa 568-geconjugeerde geit anti-konijn IgG bij 1: 500 verdunning in PBS / BSA oplossing overnacht bij 4 ° C .
- Actine filamenten visualiseren, incubeer embryo in 1 ug / ml phalloidin in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Vlekken op de kernen door toevoeging van 5 ml PBS dat 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen embryo driemaal kort in PBS.
- Transfer embryo een glasplaatje en bedek ze met een druppel minerale olie.
- Neem beelden op 1000x met een confocale microscoop met een excitatie van de juiste golflengte.
5. Voorbereiding van de Neogenin-RFP en Neogenin-siRNA GFP plasmiden
- Subkloon cDNA coderend muis neogenin een rode fluorescent eiwit (RFP) bevattende vector, wat resulteerde in neogenin-flag-RFP.
- Subkloneren kleine hairpin RNA targeting neogenin in een Emerald Green Fluorescent Protein (EmGFP) bevattende vector, wat resulteerde in pcDNA-EmGFP-miR-neogenin (figuur 1).
- Amplify zowel neogenin-flag-RFP en pcDNA-EmGFP-miR-neogenin plasmiden en zuiveren ze met conventionele methoden.
- Stel de eindconcentraties van plasmiden ~ 1,0 ug / ml in steriel Tris-EDTA (TE) buffer.
6. Micro-injectie van plasmiden in 2-PN embryo
- Was de blootgelegde 2-PN embryo's een keer kort, met verse M16 media.
- Centrifugeer de 2-PN embryo's gedurende 10 min bij 1000 x g in een tafelblad centrifuge om voor waarneming van de pronuclei.
- Incubeer de embryo's in een micro daling van 20-30 pl M16 media per embryo onder minerale olie bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende een additionale 1-2 uur.
- Fabricage injectie pipetten en houdt pipetten door te trekken borosilicaat-glazen capillaire buis (OD = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) met een mechanische puller.
- Fabriceren injectie pipetten om stompe tips en gepolijst openingen van <500 urn tip lengte en 1-2 micrometer tip binnendiameter met behulp van een microgrinder en een microforger hebben.
- Fabriceren die pipetten zodanig dat ze stompe uiteinden en gepolijst openingen met een inwendige diameter van 20 pm en een buitendiameter van 100 urn.
- Lading injectie pipetten met voldoende (> 200 nl) plasmide oplossing bij 1,0 ug / ul.
- Microinject ~ 10 pl plasmide oplossing bij 2-PN embryo in een van de pronuclei met een microinjector bevestigd aan een gemotoriseerde micromanipulator; tijdens dit proces, houden embryo's in positie door het toepassen van negatieve druk met een deelneming pipet.
- Na micro-injectie, was de 2-PN embryo's 3 keer met verse M16 media voor less dan 1 minuut per keer.
- Cultuur 2-PN embryo in een druppel verse M16 media op een plastic kweekschaal waarop een druppel minerale olie om verdamping te voorkomen media.
- Let op de embryo's in 24 uur intervallen onder een differentieel interferentie contrast (DIC) omgekeerde microscoop bij 200X vergroting.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We ontdekten dat neogenin is transiënt tot expressie tijdens de vroege ontwikkelingsstadia van pre-implantatie muizenembryo's verschijnen reeds in het 2-cel stadium en duren tot de vroege morula maar steeds deficiënt in de late morula en blastocyst stadium (figuur 2A). Bovendien, de ruimtelijke verdeling van neogenin beperkt was voornamelijk buiten cellen. De resultaten van RT-PCR analyse waren consistent met de vroege en voorbijgaande aard van neogenin uitdrukking p...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit protocol tonen we nieuwe werkwijzen voor micro-injectie van genetisch materiaal, hetzij cDNA of shRNA, in de 2-PN muizenembryo's om de rol van neogenin begin celdifferentiatie staand tijdens embryogenese van de muis. Genetische modificatie van pre-implantatie embryo's is een krachtige techniek in het blootleggen van de belangrijkste informatie over de onderliggende moleculaire mechanismen voor, bijvoorbeeld, de eerste cel lineage bepalen. Genetische modificatie is een van de meest gebruikte methoden voor ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen ook graag aan de groep Dr. Xiong bij Georgia Health Sciences University erkennen voor de productie en het delen van de constructen voor neogenin cDNA en shRNA vectoren. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Basic Science Research Program (2013R1A1A4A01012572) gefinancierd door de Koreaanse Research Foundation en door een onderzoeksbeurs van Sahmyook University.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Geitenserum, | Dako (Glostrup, Denemarken) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Nederland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineralolie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| humaan choriongonadotropin en zwanger merrie serum gonadotropin | (Intervet, Nederland) | (invitrogen, 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixtuur | (Bioneer, Daejon, Zuid-Korea) | GenDEPOT, A0224-050 | |
| Agarose (moleculair graad) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde-oplossing, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyklonaal konijn anti-neogenine antilichaam | Santa Cruz Biotechnology, VS | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 gelabeld anti-konijn antilichaam | Molecular Probes (Invitrogen, VS) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 gelabeld anti-konijn antilichaam | Molecular Probes (Invitrogen, VS) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, VS) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-fenylindol, dihydrochloride) | Invitrogen, VS | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| alle plasmideconstructies | Prof. Wen Cheng Xiong aan de Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | voor de huidige studies werden vriendelijk verstrekt door | |
| Neon® Transfectiesysteem | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromanipulatie systeem met Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
Referenties
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851(2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769(2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989(2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
