Methodenartikel

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

11.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53697

⸱

10 februari 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory Program in Behavioral, Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Filameuze actin (F-actin) speelt een belangrijke rol bij spinogenese, synaptische plasticiteit en synaptische stabiliteit. Kwantificering van F-actin punten is daarom een nuttig hulpmiddel om de integriteit van synaptische structuren te bestuderen. Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren van F-actin punten gelabeld met Phalloidin in primaire corticale neuronale culturen met lage dichtheid.

Samenvatting

Filamenteus actine eiwit (F-actine) speelt een belangrijke rol in spinogenesis, synaptische plasticiteit, en synaptische stabiliteit. Veranderingen in de dendritische F-actine rijke structuren suggereren veranderingen in de synaptische integriteit en connectiviteit. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor het kweken van primaire rat corticale neuronen, Phalloidin kleuring voor F-actine puncta, en de daaropvolgende kwantificatie technieken. Ten eerste, de frontale cortex van de rat E18 embryo's worden gescheiden in een lage dichtheid celcultuur, dan de neuronen gekweekt in vitro gedurende ten minste 12-14 dagen. Volgende experimentele behandeling worden de corticale neuronen gekleurd met AlexaFluor 488 Phalloidin en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (de dendritische F-actine puncta label) (MAP2, de neuronale cellen en dendritische integriteit valideren). Ten slotte wordt de gespecialiseerde software die wordt gebruikt om te analyseren en te kwantificeren willekeurig gekozen neuronale dendrieten. F-actine rijke structuren worden geïdentificeerd aan de tweede orde dendritische takken (lengte range 25-75 &# 181; m) met doorlopende MAP2 immunofluorescentie. Het protocol hier gepresenteerde een bruikbare methode voor het onderzoeken van veranderingen in dendritische structuren synaps na experimentele behandelingen.

Inleiding

Het primaire doel van dit onderzoek is een betrouwbare meetmethode (schatting) van synaptische integriteit van de neuronale dendritische netwerk te ontwikkelen. Hier beschrijven we kwantificering van F-actine puncta in primaire rat gekweekte neuronen met een combinatie van Phalloidin kleuring en immunocytochemische (ICC) detectie van dendrieten met daaropvolgende analyse met behulp van gespecialiseerde (NIS-elementen) software.

Gelabelde phallotoxins soortgelijke affiniteit voor zowel grote als kleine filamenten (F-actine), maar niet binden aan monomere globulaire actine (G-actine), in tegenstelling tot sommige actine antilichamen 1. Niet-specifieke binding van Phalloidin verwaarloosbaar, waardoor minimale achtergrond tijdens cellulaire beeldvorming. Phalloidin is veel kleiner dan antilichamen die typisch zou worden gebruikt om cellulaire eiwitten te labelen voor fluorescentiemicroscopie, die zorgt voor veel intenser etikettering van F-actine met falloïdine. Zo kunnen gedetailleerde beelden van F-actine lokalisatie in neuronenverkregen door het gebruik van gelabelde Phalloidin.

Phalloidin (F-actine) kleuring van neuronale dendrieten genereert discrete "hot spots" of heldere "puncta", die een verscheidenheid van dendritische structuren, met inbegrip van volwassen stekels, niet-stekelige synapsen 2 en onvolwassen stekels vertegenwoordigen. Onrijpe stekels onder dunne filopodia en sommige vormen van patch morfologie, en kunnen de inleiding van spinogenesis 3 vertegenwoordigen. Onrijpe stekels en niet-stekelige flarden missen PSD95 4. Veranderingen in de productie van F-actine leiden tot latere wijzigingen in niet alleen stekels, maar ook extra dendritische structuren, waardoor Phalloidin een belangrijk instrument voor het onderzoeken van synaptodendritic integriteit 5-7. In het algemeen is het aantal Phalloidin-positieve (F-actine) puncta weerspiegelen een evenwicht tussen actieve synapsen (prikkelende en remmende), actine dynamiek en stabiliteit synaps 8.

Hoewel het belangrijk dieper specifieke types synapsen (dwz excitatoire stekels), wanneer het doel van de behandeling is niet bekend moet eerst de algemene integriteit van verschillende dendritische structuren te schatten. Aangezien F-actine is een belangrijke component van spines en andere structuren, waaronder remmende synapsen, een veranderde aantal F-actine puncta kan synaptopathy duiden. Dit synaptopathy kan dan verder worden onderzocht voor meer specifieke aanpassingen. Onze kwantificatie methode voor het opsporen van meerdere synaptische typen / structuren levert een totale raming van dendritische synaptische veranderingen (stijgingen en dalingen) na verschillende experimentele behandelingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van South Carolina (assurance nummer: A3049-01) goedgekeurd.

1. Lage-dichtheid Embryonale neuronale Cultuur

  1. Voorbereiding voor primaire corticale neuron cultuur
    1. oplossingen:
      1. Bereid Poly-L-lysine voorraadoplossing door het oplossen van 5 mg van poly-L-lysine in 10 ml Boraatbuffer.
      2. Bereid werkoplossing door verdunning 1 ml poly-L-lysine De in 49 ml boraatbuffer.
      3. Bereid boraatbuffer, pH 8,4 door te beginnen met 395 ml dH 2 O en vervolgens het toevoegen van alle ingrediënten (1,24 g boorzuur + 1,9 g Borax). Stel de pH tot 8,4 met 1 M NaOH. Pas tot 400 ml en filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap.
      4. Bereid HBSS oplossing, pH 7,2 door te beginnen met 445 ml dH 2 O en het toevoegen van alle andere bestanddelen (50 ml 10X HBSS Stock + 1,2 g HEPES). Stel de pH tot 7,2 met 1 N HCl, bring tot 500 ml en filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap.
      5. Bereid plating medium: DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum. Filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap.
      6. Bereid compleet groeimedium: Aan 50 ml Neurobasal medium, voeg de supplementen (500 ui GlutaMax (100X) + 500 ul Glucose + 1 ml B-27 (50X) + 500 ui van antibiotica Antimycoticum-oplossing (100x) + 100 pl 7,5% natriumbicarbonaat. filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap.
    2. Twee dagen voor cultuur:
      1. Coat twaalf 35 mm glazen bodem gerechten met 2 ml Poly-L-Lysine werkoplossing en houdt onder de motorkap O / N.
    3. Een dag voor de cultuur:
      1. Lege bekledingsmiddel van de gerechten en spoel af met DDH 2 O. Laat gerechten te drogen voor een uur onder de motorkap.
      2. Bereid plating medium (DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum (10% van de totale oplossing). Pipetteer 2 ml medium inelke schotel en incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO2.
        Let op: Het is belangrijk om plastic cultuur gerechten te vermijden bij het ​​kweken. Het gebruik van glazen bodem gerechten (voor omgekeerde microscopen) of dekglaasjes (voor staande microscopen) levert scherpe en heldere beelden. Vergeleken met een plastic bodem gerecht, de glazen bodem schaal voorkomt ongewenste tinten of schittering tijdens fluorescentie microscopie.
  2. Celkweek protocol:
    1. Put gekoelde HBSS Buffer (100-150 ml), 100 mm petrischaaltjes, tang, schaar, 50 ml buizen, en 15 ml buizen onder UV-licht in de kap.
    2. Euthanaseren zwangere rat met dodelijke inhalatie van 5% sevofluraan onder de motorkap buiten cultuur kamer.
    3. Steriliseren met 70% EtOH, tent de huid van de onderbuik behulp van een tang tijdens het snijden van de staart in het midden van abdominale cavity.Open de baarmoeder met een schaar de placenta bloot.
    4. Verwijder 8-10 E18 foetussen. Place 8-10 foetussen in petrischaaltjes met HBSS oplossing.
    5. Houd de achterkant van het hoofd van de foetus met een tang en gebruik schaar om het hoofd van het lichaam scheiden. Plaats het in een andere petrischaal gevuld met 5-7 ml van HBSS. Transfer gerecht te capuchon.
    6. Vul twee extra 100 mm petrischaal met koud HBSS.
    7. Peel opzij schedel, en schep de hersenen in een nieuwe petrischaal gevuld met HBSS.
    8. Gebruik scherp gebogen tang, aparte cerebellum en de hersenstam van de hersenen, vervolgens over te dragen hersenen om een ​​nieuwe petrischaal met koud HBSS erin.
    9. Gebruik een pincet te beveiligen, scheiden de hemisferen met gebogen pincet. hersenvliezen te verwijderen; isoleren frontale cortex en de overdracht stukken in gemarkeerd 15 ml centrifugebuizen.
    10. Vul de 15 ml buis met 2 ml verse HBSS en voeg 20 ul trypsine EDTA (10x geconcentreerd mengsel met 0,5% trypsine en 5,3 mM EDTA.) Aan elk 15 ml buis.
    11. Incubeer 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Zwenk buis om de paar minuten, niet toestaan ​​dat de afwikkeling.
    12. After 10-15 min, gebruik glazen pipet om oude HBSS te verwijderen en tweemaal spoelen met nieuwe HBSS.
    13. Dompel in trypsineremmer (1 mg / ml, 2 mg trypsine-remmer in 2 ml HBSS), meng goed en laat het zitten 5 min. Was tweemaal met verse HBSS.
    14. Het gebruik van glazen pipet met rubberen bol, fijnstampen hersenen stukken 10-15 keer heel langzaam om zo bubbles.Triturate voorkomen dat opnieuw met een gekalibreerde pipet en een steriel tip met een gereduceerde tip diameter heel langzaam tot homogeen.
    15. Overdracht gedissocieerde cellen op gewenste dichtheid vooraf bereide gecoate kweekschalen (50 cellen / mm2). Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO2.
    16. Na 24 uur werd vervangen DMEM / F12 medium met vers gemaakte volledige groei serumvrij Neurobasaal medium.
    17. Handhaaf de cellen te allen tijde in een 5% CO2 / 95% kamerlucht bevochtigde incubator gedurende ten minste 12-14 dagen voor de experimenten. Supplement de cellen elke 5-6 dagen met vers Neurobasal medium vervangen ongeveer 50% van het oude medium.

2. Fluorescerende Labeling en Immunocytochemie

Opmerking: De immunofluorescentie labeling van primaire corticale celkweken werd in glazen bodem 35 mm celcultuurschalen uitgevoerd met een werkvolume van 1 ml.

  1. Het glazen bodem schaal tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS).
  2. Fix cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Was de cellen tweemaal met PBS en doorlaatbaar met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten.
  4. Behandel cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met een F-actine specifieke kleurstof, AlexaFluor 488 Phalloidin (01:40, 25 gl Phalloidin in 1 ml PBS).
  5. Spoel de cellen tweemaal met PBS en geblokkeerd met 10% normaal geit serum bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur.
  6. Verdun de kippen polyklonale anti-MAP2 antilichaam (1: 2500) in PBS met 2% normaal geit serum en geïncubeerd O / N bij 4 oC
  7. Na incubatie, spoelen in PBS twee keer.
  8. Verdun de secundaire antilichaam (Alexa Red 594-geconjugeerde geit anti-kip IgG (1: 500) met 2% normaal geit serum en incubeer gedurende 2 uur bij KT.
  9. Spoelen met PBS en voeg 10 pl / schotel van Hoechst kleurstof.
  10. Incubeer 3 min bij RT en wassen met PBS twee keer.
    Opmerking: De gelabelde cellen klaar voor stap 3 (F-actine puncta tellen).
  11. Preserve cel monster met 100 ui antifade reagens als afdekproces middel en houden bij 4 ° C in het donker voor de lange termijn opslag.
    Opmerking: Phalloidin is relatief stabiel in PBS bij 4 ° C in het donker tot 1 week en fluorescentie kan worden geconserveerd met antifade afdekken reagentia. Echter, optimale afbeeldingen verkregen 1-3 dagen na kleuring sinds Phalloidin kan beginnen uit te verspreiden met langdurige opslag.

3. F-actine Puncta Counting

  1. Schakel fluorescentiemicroscoop en over te schakelen naar 20 × doelstelling. Open microscoop software, en het opzetten van programma van 1280 × 960 pixels beeldformaat, en 0,17 um / pixel resolutie bij 1 × zoom.
  2. Acquire beelden van co-gelabelde F-actine / MAP2 neuronen onder groene (495 nm) / rood (613 nm) fluorescerende kanalen.
  3. Kies 5 Green (F-actine) / Rood (MAP2) immunolabeled / blauw (Hoechst) fluorescerende beelden van individuele neuron met duidelijk omschreven dendritische priëlen.
  4. Identificeer de F-actine rijke structuren in tweede orde dendritische segment (lengte range 25-75 pm) met doorlopende MAP2 immunofluorescentie.
  5. Draai het geselecteerde gebied van beelden naar een horizontale niveau. Kopiëren en plakken als nieuwe afbeelding.
  6. Aftrekken van de achtergrond van afbeeldingen, met een consistente dient voor elk gerecht.
  7. Tel de felgroene F-actine puncta en traceren van de lengte van de geselecteerde dendritische segment handmatig door getrainde onafhankelijke waarnemers. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet-bestand.
  8. Bereken de dichtheid door het totale F-actine gelabeld puncta (N) door de lengte (L) van de MAP2 gemerkte dendrieten. Express-gegevens als het aantal F-actin puncta per 10 micrometer van dendriet
    Opmerking: Puncta (size ≤1.5 pm) van F-actine fluorescentie met een piekintensiteit van ten minste 50% boven het gemiddelde intensiteit van kleuring in de dendritische as werden in elke geselecteerde dendritische segment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In de huidige methoden, moeten we eerst cultuur rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten, die ons in staat stelt om de dendrieten van individuele neuronen te identificeren. In figuur 1, de differentiële interferentie contrast (DIC) beelden tonen de morfologische veranderingen in de ontwikkeling foetale rat corticale neuronen op dag 4, 6, 10, 14, 21 en 27 in vitro. Merk op dat de lengte en het aantal dendrieten toenemen rijping va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol beschrijven we het kweken van rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten die ons in staat stelt om dendrieten van individuele neuronen te identificeren. Vervolgens gebruiken we Phalloidin en MAP2 kleuring dendritische veranderingen te detecteren. Vervolgens gebruikten we gespecialiseerde software veranderingen in F-actine puncta kwantificeren.

Om veranderingen in de F-actine puncta het hele neurale netwerk van een individuele neuron moet duideli...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies DA013137, DA031604 en HD043680. Gedeeltelijke ondersteuning werd verleend door een NIH T32-opleidingssubsidie in biomedisch-gedragswetenschappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglasMatTek CorporationP35G-1.5-20-C
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Trypsin-EDTALife Technologies15400-054
Poly-L-LysineSigmaP9155
Boric acidSigmaB0252
BoraxSigmaB9876
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
GlucoseVWR101174Y
HBSSSigmaH464110X
Neurobasal mediumLife Technologies21103-049
B-27 supplementLife Technologies17504-04450X
Antibiotic-Antimycotic solutionCellgro30004CI100X
Sodium BicarbonateLife Technologies25080
Vannas ScissorsWorld Precision Instruments500086
Iris ScissorsWorld Precision Instruments500216
Iris ForcepsWorld Precision Instruments15914
Dumont #7 ForcepsWorld Precision Instruments14097
Dumont #5 ForcepsWorld Precision Instruments14095
ProLong GoldLife TechnologiesP36930
Paraformaldehyde SigmaP6148
Cover glassVWR631-0137
AlexaFluor 488 PhalloidinLife TechnologiesA12379
Normal horse serumLife Technologies26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2abcamAb92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgGLife TechnologiesA11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342Life TechnologiesR37605
NIS-Elements softwarepakketNikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E invertede fluorescente computergestuurde microscoop Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membraanfilterFishersci151-4020

Referenties

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dendritische stekelsynaptische plasticiteitphallo dine kleuringprimaire neuronale cultuurMAP2 immunofluorescentiedendritische vertakkingenfluorescentiemicroscopiesynaptische integriteit

Gerelateerde artikelen