Filameuze actin (F-actin) speelt een belangrijke rol bij spinogenese, synaptische plasticiteit en synaptische stabiliteit. Kwantificering van F-actin punten is daarom een nuttig hulpmiddel om de integriteit van synaptische structuren te bestuderen. Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren van F-actin punten gelabeld met Phalloidin in primaire corticale neuronale culturen met lage dichtheid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Filamenteus actine eiwit (F-actine) speelt een belangrijke rol in spinogenesis, synaptische plasticiteit, en synaptische stabiliteit. Veranderingen in de dendritische F-actine rijke structuren suggereren veranderingen in de synaptische integriteit en connectiviteit. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor het kweken van primaire rat corticale neuronen, Phalloidin kleuring voor F-actine puncta, en de daaropvolgende kwantificatie technieken. Ten eerste, de frontale cortex van de rat E18 embryo's worden gescheiden in een lage dichtheid celcultuur, dan de neuronen gekweekt in vitro gedurende ten minste 12-14 dagen. Volgende experimentele behandeling worden de corticale neuronen gekleurd met AlexaFluor 488 Phalloidin en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (de dendritische F-actine puncta label) (MAP2, de neuronale cellen en dendritische integriteit valideren). Ten slotte wordt de gespecialiseerde software die wordt gebruikt om te analyseren en te kwantificeren willekeurig gekozen neuronale dendrieten. F-actine rijke structuren worden geïdentificeerd aan de tweede orde dendritische takken (lengte range 25-75 &# 181; m) met doorlopende MAP2 immunofluorescentie. Het protocol hier gepresenteerde een bruikbare methode voor het onderzoeken van veranderingen in dendritische structuren synaps na experimentele behandelingen.
Inleiding
Het primaire doel van dit onderzoek is een betrouwbare meetmethode (schatting) van synaptische integriteit van de neuronale dendritische netwerk te ontwikkelen. Hier beschrijven we kwantificering van F-actine puncta in primaire rat gekweekte neuronen met een combinatie van Phalloidin kleuring en immunocytochemische (ICC) detectie van dendrieten met daaropvolgende analyse met behulp van gespecialiseerde (NIS-elementen) software.
Gelabelde phallotoxins soortgelijke affiniteit voor zowel grote als kleine filamenten (F-actine), maar niet binden aan monomere globulaire actine (G-actine), in tegenstelling tot sommige actine antilichamen 1.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van South Carolina (assurance nummer: A3049-01) goedgekeurd.
1. Lage-dichtheid Embryonale neuronale Cultuur
- Voorbereiding voor primaire corticale neuron cultuur
- oplossingen:
- Bereid Poly-L-lysine voorraadoplossing door het oplossen van 5 mg van poly-L-lysine in 10 ml Boraatbuffer.
- Bereid werkoplossing door verdunning 1 ml poly-L-lysine De in 49 ml boraatbuffer.
- Bereid boraatbuffer, pH 8,4 door te beginnen met 395 ml dH 2 O en vervolgens het toevoegen va....
- oplossingen:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de huidige methoden, moeten we eerst cultuur rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten, die ons in staat stelt om de dendrieten van individuele neuronen te identificeren. In figuur 1, de differentiële interferentie contrast (DIC) beelden tonen de morfologische veranderingen in de ontwikkeling foetale rat corticale neuronen op dag 4, 6, 10, 14, 21 en 27 in vitro. Merk op dat de lengte en het aantal dendrieten toenemen rijping va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit protocol beschrijven we het kweken van rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten die ons in staat stelt om dendrieten van individuele neuronen te identificeren. Vervolgens gebruiken we Phalloidin en MAP2 kleuring dendritische veranderingen te detecteren. Vervolgens gebruikten we gespecialiseerde software veranderingen in F-actine puncta kwantificeren.
Om veranderingen in de F-actine puncta het hele neurale netwerk van een individuele neuron moet duideli.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies DA013137, DA031604 en HD043680. Gedeeltelijke ondersteuning werd verleend door een NIH T32-opleidingssubsidie in biomedisch-gedragswetenschappen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglas | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements softwarepakket | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E invertede fluorescente computergestuurde microscoop | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membraanfilter | Fishersci | 151-4020 |
Referenties
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
