Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

11.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53705

⸱

8 januari 2016

 ,  , 
1Equipe: Imagerie Cérébrale Fonctionnelle et Comportements (ICFC), Institut des Neurosciences Paris-Saclay (Nero-PSI), UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Graduate College, University of Iowa, 3Department of Anesthesia, Carver College of Medicine, University of Iowa

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.

Samenvatting

Functionele in vivo beeldvorming is een krachtige aanpak om de functie en fysiologie van hersencellen en structuren van belang te bestuderen. Recent werd een nieuwe methode ontwikkeld Ca2 + -Imaging met de bioluminescente GFP reporter-aequorine (GA). Deze nieuwe techniek is gebaseerd op de fusie van GFP en aequorine genen produceren van een molecuul kan binden calcium en - de toevoeging van de coelenterazine cofactor - fel licht uitzenden dat kan worden bewaakt door een foton collector. Transgene lijnen die het GFP-aequorine gen werden gegenereerd voor zowel muis en Drosophila. In Drosophila is de GFP-aequorine-gen onder controle van de GAL4 / UAS binaire expressiesysteem waardoor gerichte expressie en beeldvorming in de hersenen gebracht. Deze methode is vervolgens aangetoond dat het opsporen van te zijn, zowel naar binnen Ca 2+ -transients en Ca 2+ -released van innerlijke winkels. Belangrijker het zorgt voor een grotere duur in continue opname, weergave op grotere diepte in de hersenen, en de opname op hoge temporele resoluties (tot 8,3 msec). Hier presenteren we de basis-methode voor het gebruik van bioluminescentie beeldvorming te registreren en te analyseren Ca 2+ -activity binnen de paddestoel lichamen, een structuur centraal in leren en geheugen in de vlieg hersenen.

Inleiding

De fundamentele patronen en functie van activiteit in de hersenen en de discrete structuren lang een gebied van intensief onderzoek op het gebied van neurologie. Misschien enkele vroegste succesvolle benaderingen voor dit probleem waren direct fysiologische meting van de verandering in de elektrische activiteit - maar alternatieve methoden die levende beeldvorming van veranderingen in spanning, pH of calciumconcentraties (als indicatie voor activiteit) laten hebben extra mogelijkheden voor gebracht de studie van neuronale activiteit 1. Beeldvormingstechnieken voeren een breed scala van voordelen zoals verminderde invasiviteit en de mogelijkheid om te controleren activiteit in gehele hersenstructuren. Verder bij dieren met handelbare genetica, waaronder de fruitvlieg Drosophila, de ontwikkeling van genetisch gecodeerd calcium indicatoren, zoals cameleon, GCaMPs en anderen 1 hebben toegestaan ​​onderzoekers enkele neuronen, neuronale populaties en hele hersenen te controlerenstructuren. Terwijl meer traditionele TL calcium beeldvormende methoden gebruiken GCaMPs (GFP gefuseerd met calmoduline) of FRET (GVB en YFP gefuseerd met calmoduline) hebben bewezen nuttige technieken verstrekken van goede ruimtelijke en temporele resolutie te zijn, het onderliggende proces van licht excitatie wekt een aantal beperkingen op de experimentele toepassingen. Vanwege de aard van het excitatie licht, autofluorescentie, foto-bleken en fototoxiciteit onvermijdelijk worden geproduceerd die dientengevolge beperkt de diepte van de structuren die kunnen worden afgebeeld, de duur van de opnames en de continuïteit van real time opname. Met andere woorden, opnamen moeten vaak intermitterend uitgevoerd om de ongewenste bijwerkingen te voorkomen.

Vanwege deze problemen zijn aanvullende alternatieve calcium beeldvorming ontwikkeld. Een van de meest veelbelovende methoden bioluminescentie beeldvorming, die berust op licht geproduceerd door een enzymatische reactie na calcium binding. Bioluminescent beeldvorming niet licht excitatie vereisen en dus niet dezelfde problemen als conventionele calcium imaging ervaren. Het bioluminescente reporter aequorine - geïsoleerd uit Aequorea victoria, dezelfde kwal waaruit GFP werd isolated- bindt calcium via de drie EF kant structuren en ondergaat een vormverandering, die leidt tot de oxidatie van de coelenterazine cofactor en de vrijlating van blauw licht (λ = 469 nm) 2,3. Aequorine heeft een lage affiniteit voor calcium (Kd = 10 uM) dat ideaal toezicht calcium transiënten omdat het zeer weinig ruis en niet interfereert met het intracellulaire calcium buffersysteem 4 maakt. Hoewel aequorine eerder is gebruikt om het proces van neurale inductie monitoren de Xenopus ei 5 het geproduceerde licht is te zwak om te gebruiken voor real time imaging van neuronale activiteit. In een poging om deze uitdaging, Philippe Br & pakken# 251; laat en collega's bij het ​​Instituut Pasteur creëerde een genetisch construct fuseren GFP en aequorine genen, het nabootsen van de inheemse staat binnen de kwallen 4. Dit fusiegen product bindt calcium weer via de drie EF kant structuren van aequorine, waarbij een conformationele verandering die leidt tot oxidatie van coelenterazine, welke energie niet radiatief overdraagt ​​aan de GFP ondergaat. Deze energieoverdracht resulteert in het vrijkomen van groen licht (λ = 509 nm) van GFP, in plaats van blauw licht van aequorine. De fusie van GFP en aequorine verleent ook een grotere eiwitstabiliteit helpen het fusie-eiwit te produceren licht 19-65 keer helderder dan alleen 4 aequorine. Met een bioluminescente benadering in de hersenen breidt de huidige experiment met calcium beeldvorming zowel wat de duur van continue registratie en het aantal structuren binnen de hersenen die kan worden opgenomen. In grote lijnen in de context van eerder werk betekent dat zowel globale en meerverscheidenheid van geregionaliseerde "activiteit" van de hersenen kan worden bewaakt (door de proxy van calcium transiënten). Belangrijker kan worden geregistreerd langer, in real time en continu, die gemakkelijk leent voor de uitoefening van een volledig begrip van basale functie in de hersenen.

In de laatste jaren hebben ons laboratorium en anderen transgene vliegen expressie brengen van het GFP-aequorine onder de controle van de binaire expressiesysteem (GAL4 / UAS-GFP-aequorine) 5,6 ontwikkeld. We hebben gebruik GFP-aequorine bioluminescentie naar record activiteit door natuurlijke stimuli zoals geur 7,8, en bestudeerden de cellulaire componenten modulerende Ca2 + -activity de mushroom bodies volgende acetylcholine receptor stimulering door directe nicotinezuur toepassing 9. Daarnaast hebben we ook GFP-aequorine een aantal experimentele vragen die niet in staat zijn eerder gericht, zoals langdurige pakkenbeeldvorming van spontane calcium transiënten en visualisatie van diepere hersenstructuren 10. Recenter hebben we de GAL4 / UAS systeem om de zoogdierlijke ATP receptor P2X 2 11 een kation kanaal in de projectie neuronen (PN) expressie en gebruikt het LexA systeem GFP-aequorine in de champignon organen expressie (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (een hoffelijkheid van B. Pfeiffer, Janelia Boerderij, Verenigde Staten). Daardoor hebben we de PN activeren toepassing van ATP, dat op zijn beurt activeert de champignon organen (een stroomafwaarts doel van de PN), nabootsen meer natuurlijke omstandigheden, zoals de respons op een stimulus geur. Overall deze techniek combineren P2X 2 en GFP-aequorine breidt de experimentele mogelijkheden. In grote lijnen biedt de mogelijkheid om de activiteitspatronen beter inzicht in de hersenen, het initiëren van nieuwe studies over verschillende stimuli en perturbaties de basale patronen van activiteit kan veranderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van de monsters

  1. Bereiding van oplossingen en het opzetten
    1. Handhaven alle Drosophila melanogaster lijnen bij 24 ° C op standaard voedsel medium. Achter en houd ze bij lage dichtheid in de flacon gestandaardiseerde grootte en het gewicht van vliegen genereren.
      1. Voeg 10 maagdelijke vrouwtjes met 10 mannen in een flesje, laat ze paren en over te brengen om de 2 dagen om een ​​nieuwe flacon. Vervolgens 10 dagen later, toen de vliegen beginnen te Eclose, oogsten de vliegen elke dag. Houd een nauwkeurige registratie van de leeftijd van de vliegen en bewaar ze in goede staat.
      2. Op dag 3, scheiden de mannetjes van de vrouwtjes en houden de vrouwtjes 20 vliegen per flacon. Noteer het vliegen op 4 of 5 dagen oud.
    2. Bereid Ringer's oplossing met de volgende concentraties: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES en 36 mM sucrose en de pH van de oplossing nauwkeurig 7,3. Bereid perfusie-oplossingen van 25 μ; M nicotine en 100 mM KCl in Ringer-oplossing.
    3. Bereid 1000 ui pipet tip: met behulp van een scheermesje vorm tip om schuin (ongeveer 35 ° ten opzichte van het einde van de tip) en verwijder overmaat base dan 1 ½ cm van tip.
    4. Bereiden doos voor opslag (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) van het monster tijdens incubatie. Plaats twee sponzen (12 cm x 8 cm x 3 cm) verzadigd met water in de bodem onder een kleine rek apparaat [monster uitdroging te voorkomen] om monsters te plaatsen op hun voorbereiding is voltooid.
    5. Bereid vliegt monsters, zodat ze ten minste 1 kopie van de UAS-GFP-aequorine en één kopie van een Gal4 lijn om de expressie van GFP-aequorine rijden. OK107 Gal4 lijn (een lijn rijden expressie voornamelijk in de paddestoel lichamen) wordt gekruist met UAS-GFP-aequorine in deze voorbereiding.
      LET OP: De binnenkant van de doos moet waterbestendig zijn en de buitenkant moet licht te blokkeren van het invoeren van in om degradatie van coelenterazine tijdens incubatie te voorkomen.
  2. Prepreiding van de monsters
    1. Ice verdoven Drosophila door de overdracht naar een glazen flesje en blijf op ijs gedurende 2 minuten alvorens te worden verplaatst naar de gekoelde petrischaal voor het positioneren in de pipetpunt. Bereid pipet tips over licht bevochtigde filterpapier in 100 ml petrischaal op ijs onder de dissectie microscoop.
    2. Voorzichtig met een pincet plaats vliegen binnenkant van pipetpunt.
    3. Met behulp van een borstel duw en lijn vlieg zodanig dat de kop is volledig voorbij de rand van de tip en de dorsale regio is gedeeltelijk blootgelegd door de sectie verwijderd tijdens tip vormgeving (Figuur 2B).
    4. Combineer een klein (ongeveer 3-4 ul) delen van de twee componenten van de tandheelkundige lijm. Breng de lijm zorgvuldig rond de voor- en achterkant van hoofd en nek naar beneden om en rond de pipet tip rand - het vermijden van de kruin van het hoofd. Laat de lijm droog gedurende 2 minuten.
    5. Plaats pipetpunt met gelijmde vliegen door het gat in de opname kamer (figuur 2D) en genTLY drukken om vast te zetten.
    6. Combineer de twee componenten van silicium lijm (ongeveer 3-4 ul). Breng lijm op de platte kant van de kamer langs de rand waar de kamer en pipettip samenkomen om lekken van de Ringer-oplossing te voorkomen. Laat de lijm droog gedurende 2 minuten.
  3. Ontleding
    1. Bevestig tape over de perfusie kanaal, korte zijde en zich uitstrekt tot de achterkant van de kamer.
    2. Plaats kamer met een vlieg op dissectie blok onder de microscoop zijn beurt op tl-lamp. Pipet 1 ml Ringer-oplossing in de kamer.
    3. Gebruik fijne chirurgische mes nagelriem verwijderen. Voeg parallelle insnijdingen vanaf de achterkant van het hoofd antennal regio. Snijd vervolgens langs de rand van het oog te maken dan een loodrechte incisie boven antenne aansluiten van de vorige insnijdingen. Een definitieve snede evenwijdig aan die aan de achterkant van het hoofd. Gebruik de fijne scherpe tang om cuticula (figuur 2C) te verwijderen.
    4. Gebruik fijne scherpe tang om voorzichtig te begrijpen eend Ruim blootgesteld respiratoire weefsel tot de hersenen en [fluorescerende] paddestoel lichaam duidelijk wordt gevisualiseerd.
    5. Gebruik ultra-scherpe pincet om zorgvuldig te begrijpen en knijp neuro-weefsel dat de hersenen om voor permeatie van de coelenterazine.
      Opmerking: Als alternatief papaïne kan worden gebruikt om de neuroepithelia 9 permeabilize.
    6. Met behulp van een pipet, wassen tweemaal met Ringer-oplossing voor elk puin van dissectie en plaats monster in het donker vakje te verwijderen.
    7. Pipetteer 1 ml Ringer's oplossing bevattende 5 pM benzyl-coelenterazine in de kamer. Sluit de doos en laat incubatie met coelenterazine bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur.

2. Imaging

  1. Opstelling
    1. Start de opname systeem: schakel microscoop, computer, camera en drainagesysteem en zet kamer milieucontroles tot 25 ° C.
    2. Open Meet- en Automation Explorer programma op de computer. Klik op “ Apparaten en Interfaces ", dubbelklik dan op" NI Motion Devices "en klik tenslotte recht op" PCI-7334 "en selecteer" initialiseren apparaat ".
    3. Open Photon Imager. Maak een nieuwe map en de naam van de eerste opname bestand. Camera moet -80 ° C te bereiken voordat het systeem zal functioneren.
    4. Instellen perfusiesysteem - voeg KCl, nicotine en Ringer's oplossing voor reservoirs en passen zodat het elke oplossing lozingen op 2 ml / min. Wassen met Ringer's oplossing vóór het begin experiment.
  2. Bereid monster
    1. Plaats imaging monteren blok schotel op de berg onder de microscoop bij 5x vergroting en steek perfusie buis in kanaal door punctie.
    2. Stel microscoop om fluorescerende modus dan midden en breng paddestoel lichamen (MB) in beeld. Pas om 20X en re-center en focus.
    3. Positie drainage apparaat dan drainage zwembad, stel hoogte van de drainage shunt, zodat de tip is gewoon Above zwembad, en lopen Ringer-oplossing voor 30 sec om voldoende waterafvoer te garanderen.
    4. Trek schild af te sluiten apparaat uit licht. Met behulp van het automatische systeem in foton imager maken fijne aanpassingen aan de focus en een verwijzing fluorescerende beeld van de MB's te nemen.
  3. Opname
    1. Pas foton snelheid gewenste opnamesnelheid (van 50 msec tot 1 seconde of meer). Selecteer foton-modus en open blind. Record genotype, geslacht, leeftijd, en sample nummer logboekvermeldingen. Stel de positie ROI dozen over kelk en mobiele lichamen (CCB) en mediale lobben door te klikken op de ROI dozen en te slepen terwijl controle.
    2. Neem basislijn gedurende ongeveer 5 tot 10 min (zoals gewenst).
    3. Breng nicotine gedurende 1 min. Opmerking starten / stoppen in logboek. Wassen met Ringer-oplossing gedurende 5 min.
    4. Wacht 5 min voor het herstel en de voorbereiding KCl logboekvermelding en timer.
    5. Breng KCl gedurende 1 min. Opmerking starten / stoppen in logboek. Wassen met Ringer's oplossing gedurende 1 min.
    6. Schakelaarfluorescerende modus, neem uiteindelijke beeld fluorescerende, en zet Ringer's oplossing.
    7. Druk op "Stop". Dialoogvenster vraagt ​​af te sluiten van het systeem. Selecteer "Nee" om de opname voort te zetten.
    8. Open schild, verplaatsen drainagesysteem, switch lens doel 5X, verwijderen perfusie buis. Verwijder monster / opnemen gerecht uit het podium, schoon uit 20X lens door het spoelen en de lens tweemaal vegen met water.
    9. Druk op de play-knop wit aan de bovenkant van het programmavenster om de volgende opname te starten.

3. Analyse en Video Creation

  1. Extract foton waarden
    1. Open het foton analyse programma (bijvoorbeeld Photon Viewer) en een open eerste monster spreadsheet bestand.
    2. Selecteer het tabblad scherm controle. Selecteer de ROI door te klikken op de regio terwijl controle. Pas grootte, oriëntatie en vorm van de regio van belang zijn voor GFP verlicht CCB en mediale lobben omvatten.
    3. Voeg een toevoegingal ROI door te klikken op "Definieer ROI" en te klikken en te slepen op het scherm om de nieuwe ROI te creëren.
    4. Selecteer het tabblad "Movie" naar foton video af te spelen. Passen "sec breedte" en "sec stappen" zoals gewenst. Bijstellen ROI plaatsing als dat nodig is.
    5. Selecteer vertegenwoordiger screen shots van GFP fluorescentie, nicotine respons en KCl reactie. Afbeelding plakken gewas screenshots en in een presentatie dia voor latere analyse en vergelijking.
    6. Pas zowel de "sec breedte" en "sec stap" om de opnamesnelheid in seconden. Selecteer de lengte van de analyse door het verplaatsen van grijze markeringen op het bovenpaneel om beugel regio voordat stimulus aanvang en net na het einde respons.
    7. Selecteer "Uitstellen uitzicht tijdens het spelen van" druk "<< REW" en druk op de "PLAY>". Selecteer het tabblad 'Count Rate Chart "en pas eenheden zoals gewenst en lijn kleuren om ROI kleur overeenkomen.
    8. Wanneer analyse is voltooid, Druk op de "Export Count Rate Data". Select screen shots van gecombineerde opnames CCB en mediale kwab regio interesse van beide kanten. Afbeelding plakken gewas screenshots en in een dia met respons beelden. Deze schuif zal later worden gebruikt in laatste instantie.
  2. Voorbeeld Analyse: een methode voor de analyse van gewonnen foton gegevens gedetailleerd
    1. Open de spreadsheet-bestanden in 'Count Rate export "map.
    2. Formatteert u de cellen van de eerste kolom de tijd om de tijd in uren en minuten weergegeven.
    3. Verwijzen naar de overeenkomstige glijbaan voor het monster. Verwijder alle waarden met uitzondering van de kolommen voor de tijd en de twee representatieve ROI.
    4. Bepaal nicotine stimulatie starttijd - verkrijgbaar in logboekvermelding bestand in de belangrijkste Dossier aanvullende gegevens voor de start of markeer de waarde te verwijderen.
    5. Zoek hoogste / piekwaarde voor zowel de CCB en de mediale kwab en merk / highlight.
    6. Bepaal reactie begin- en eindtijd voor zowelCCB en mediale kwab door het creëren van een schatting met tijdstip van overeenkomstige grafiek respons op dia en selecteer actuele waarde door veranderingen in de waarden in de nabijheid van deze punten. Markeer het gebied tussen deze punten in zowel de CCB en de mediale lobben. U kunt ook gebruik maken van een macro-9.
    7. Combineer alle monsters van een experimentele groep op een nieuw werkblad.
    8. Uitlijnen op piek door het bepalen van de rij waarde is voor elke CCB piekwaarde. Aftrekken van de lagere waarden van de hoogste rij waarde geschatte waarde rij waarin dat monster gegevens moeten worden gekopieerd om te bepalen. Controleer of alle piekwaarden zijn uitgelijnd.
    9. Kopieer de plaat twee keer en zowel de mediale kwab kolommen of de CCB kolommen maken van pagina's van slechts CCB of mediale kwab waarden verwijderen.
    10. Gegevens te verwijderen na de CCB alle reacties zijn beëindigd. Maak vier rijen gelabeld Totaal Fotonen, Response lengte (duur), Peak Amplitude en Response Latency. Kopieer en plak deze weer onder de originelen.
    11. Gebruik de functie SOM totale fotonen bepalen tijdens respons. Gebruik de COUNT functie op lengte van de respons te bepalen. Kopiëren en koppelen hoogste waarde cel om piekamplitudewaarde bepalen. Gebruik COUNT functie - selecteren van het begin van de perfusie van nicotine aan de start van de reactie - bepalen Response Latency.
    12. Kopieer waarden met behulp van de koppeling functie en vermenigvuldigen (alle behalve piek amplitude) door het opnemen van de snelheid in seconden.
    13. Bar / box grafieken worden gecreëerd berekende parameters zoals Total fotonen, piekamplitude en respons lengte desgewenst (ex .: Figuur 5B, C, D).
    14. In de kolom na de ruwe gegevens foton reactie, het gemiddelde van de ruwe gegevenspunten voor elk tijdstip via average functie. Desgewenst volgen met een kolom bepalen van de standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor elk van de gemiddelde foton waarden op een tijdstip.
    15. Gebruik de gemiddelde kolom een ​​gemiddelde respons profil construerene [Graph] voor de CCB steekproef. Om dit te doen selecteert u de kolom met vermelding van het moment als de x-as waarden en de kolom van de gemiddelde foton waarden als de y-as en selecteer tot slot de puntenwolk grafiek creatie tool.
    16. Herhaal deze analyseprocedure met de gegevens van de mediale lobben.
  3. Het creëren van Beelden voor de Video
    1. Open foton kijker.
    2. Selecteer het tabblad weergave controle. Klik op ROI terwijl controle te selecteren, te verwijderen en / of minimaliseren.
    3. Wijzigen "sec width" (accumulatie), zoals gewenst om de inhoud van elk frame te bepalen.
    4. Wijzigen "sec stap" om de overlap van elk frame te definiëren.
    5. Selecteer "uitzicht export tijdens het spelen van" druk "<< REW" en vervolgens "PLAY>". De beelden van de video naar de "view export" map worden geëxporteerd als een reeks .png-bestanden.
  4. Een methode voor video-c: met behulp van Virtual Dub om video te makenreation gedetailleerde
    1. Maak een nieuwe map met de naam "resultats" in de folder view export met de beelden.
    2. Breng script (renommer.VBS) in de map met afbeeldingen.
    3. Dubbelklik op renommer.VBS te lopen.
    4. Afbeeldingen worden automatisch numeriek worden hernoemd en gekopieerd naar "resultats" map.
    5. Open VIRTUALDUB.EXE.
    6. Selecteer geopende videobestand - selecteer eerste afbeelding (volgende afbeeldingen wordt automatisch geladen).
    7. Selecteer video - selecteer frame rate aan te passen zoals gewenst.
    8. Selecteer video - select compressie selecteren Cinepak Codec door straal.
    9. In het bestand selecteert u Opslaan als AVI de video zal automatisch worden aangemaakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De fusie van de GFP tot aequorine stelt ons in staat om onze regio van belang voorafgaand aan bioluminescentie imaging visualiseren door de excitatie van GFP in fluorescerende modus op de microscoop (Figuur 3A, 4A, 6A, 6E). Een van de eenvoudigste manieren om de paddestoel lichamen te stimuleren is door activering van de ionotrope nicotine acetylcholinereceptoren. Hoewel acetylcholine is de endogene ligand van deze receptor hebben wij gevonden dat nicotine produceert meer reproduceerbare responsen in de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het recent ontwikkelde bioluminescente gebaseerde GFP-aequorine benadering hier gepresenteerde maakt in vivo functionele opname van Ca2 + -activity verschillende neuronen, alsmede indien gewenst, in andere soorten cellen zoals bruine stellaatcellen zoals in Cabrero et al. 2013 5.

Modificaties, trouble shooting, extra componenten en kritische stappen

Drosophila Veehouderij ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar aan E. Karplus, van Sciences Wares, VS, voor zijn waardevolle en nuttige hulp en adviezen. We danken E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier en J. Stinnakre voor hun bijdrage aan de ontwikkeling en verbetering van deze techniek. We danken ook B. Pfeiffer en G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, VS, voor de pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP lijn. Dit werk werd ondersteund door de Chateaubriand Fellowship, Franse Ambassade, Washington, VS aan A. Lark, door de National Science Foundation (IOS 1352882) aan T. Kitamoto, en door de Franse ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, en FlyBrainImaging, 2011), de Conseil Régional Ile-De France (NeRF en DIM), het IFR-144, het Physique-Chimie-Biologie Interface Programma van de CNRS (2009), en door de CNRS, Frankrijk aan JR Martin.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NaClSigma-AldrichS3014
CaCl2Merck1023911000
HEPESSigma-Aldrich7365-45-9
KClprolabo26 764.298normapur
MgCl2prolabo25 108.295normapur
sucroseSigma-AldrichS0389
NicotineSigma-AldrichN3876
ATPSigma-AldrichA2383Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazineProlume, nanolight Cat #301 Coelenterazine hhttp://www.prolume.com/
dental glue3M ESPE™46954Protemp IV
silicon glue3M ESPE™36958Express 2 Regular Body Quick
tape3M Scotch122s3M Scotch Magic Tape
pipette tipsCorning Incorporated4868100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage)hand made
incubation boxhand made
forceps (No. 5)Fine Science Tools11252-00Micro-dissecting forceps
curved forcepsSigma-AldrichF4142Micro-dissecting forceps
glue applicator hand made 
knifeFine Science Tools10316-145 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera AndorDU-897E-CS0-#BViXon (cooled to -80 °C)
MicroscopeNikonEclipse-E800
immersion objective lensNikon20X Fluor.5w
dissection microscope with fluorescenceLeica MZ Fl IIIleica dissection scope and fluorescent lamp
tight dark boxScience WaresCustom built by Science Wares
peristaltic pump GilsonMinipuls 2
tubingFisher Scientificdepends on thicknessTygon R3603, St-Gobain
perfusion systemWarner64-0135  (VC-66CS)Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulatorsLeventon201108Dosi-flow 3
measurement and automation explorerSciences Wares & National InstrumentsN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager Science Wares & National InstrumentsN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewerScience Wares & National InstumentsN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
ExcelMicrosoftN/Asoftware https://www.microsoft.com
virtual dubopen access N/Asoftware http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2Martin et al., 2007, Ref. 1 N/ANo stocks {currently} publicly available 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP  B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. (STOCK #1117340)pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2Lima and Misenboeck, Ref. 11 N/ANo stocks {currently} publicly available 
OK107Bloomington stock center854http://flystocks.bio.indiana.edu/

Referenties

  1. Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
  2. Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
  3. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
  4. Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
  5. Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943(2013).
  6. Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
  7. Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275(2007).
  8. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
  9. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105(2011).
  10. Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
  11. Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
  12. Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
  13. Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
  14. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
  15. Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6(2003).
  16. Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
  17. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bioluminescent imagingcalciumtransi ntDrosophila breinpaddenstoelenlichamenfoton imagercoelenterazinenicotine stimulatiekaliumchloridefluorescentie imaging
In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.