En Face Detection van stikstofoxide en superoxide in endotheellaag van Intact slagaders

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige manier aangepast met de fluorescentie kleurstof diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE) voor en face gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire stikstofoxide (NO) en superoxide anion (O ₂ ^.- ) respectievelijk in vers geïsoleerde intacte aorta's van een obesitas muismodel.

Samenvatting

Endotheel afgeleide stikstofoxide (NO) geproduceerd met endotheliale NO-synthase (eNOS) is een van de belangrijkste vasoprotective moleculen in cardiovasculaire fysiologie. Disfunctioneel eNOS zoals ontkoppeling van eNOS leidt tot afname NO biobeschikbaarheid en toename van superoxide anion (O ₂ ^.-) productie, en op zijn beurt stimuleert hart- en vaatziekten. Daarom geschikte meting van NO en O ₂ ^.- niveaus in de endotheelcellen cruciaal voor onderzoek op hart- en vaatziekten en complicaties. Vanwege de uiterst labiele aard van NO en O ₂ ^.-, is moeilijk te meten NO en O ₂ ^.- direct in een bloedvat. Talrijke werkwijzen zijn ontwikkeld voor het meten en NO O ₂ ^.- productie. Het is echter ook ongevoelig of niet-specifieke of technisch veeleisend en vereist speciale apparatuur. Hier beschrijven we een aanpassingvan de fluorescentie kleurstof werkwijze voor het gezicht en gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire NO en O ₂ ^.- via de cel permeabele diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE), respectievelijk in intacte aorta van een obesitas muismodel opgewekt door hoog-vet dieet geeft. Wij konden aantonen verminderde intracellulaire NO en verbeterde O ₂ ^.- niveaus in de vers geïsoleerde intacte aorta van obesitas muis in vergelijking met de controle lean muis. We tonen aan dat deze werkwijze een gemakkelijke techniek voor directe detectie en visualisatie van NO en O ₂ ^.- in de intacte bloedvaten en kan wijd voor onderzoek endotheel (dys) functie onder (fysio) pathologie.

Inleiding

De vasculaire endotheelcellen houden vasculaire functionele en structurele integriteit door het vrijgeven van vasoactieve factoren ^1. Onder deze factoren, endotheel- afgeleide stikstofoxide (NO) geproduceerd uit L-arginine via endotheliale NO-synthase (eNOS) is de belangrijkste en gekenmerkt factor bij cardiovasculaire fysiologie ^2. NO veroorzaakt relaxatie van glad spierweefsel en remt de celproliferatie remt plaatjesaggregatie en ontstekingscellen adhesie en infiltratie in de subendothele ruimte derhalve bescherming tegen vaatziekten ontwikkeling ^3. Onder vele fysiologische en pathologische aandoeningen, zoals vergrijzing, hypertensie, diabetes, hyperlipidemie, etc., endotheeldisfunctie gekenmerkt door verminderde NO biobeschikbaarheid en verhoogde O ₂ ^.- productie aanwezig en bevordert de pathogenese van atherosclerose ^2. Studies van de afgelopen jaren laten zien dat ontkoppeling van eNOS is eenbelangrijk mechanisme voor de endotheliale dysfunctie, waarbij het ​​enzym eNOS genereert O ₂ ^.- plaats van NO, onder de verschillende bovengenoemde voorwaarden ^1,4. Daarom analyse van endotheelfunctie name endotheliale NO productie en O ₂ ^.- generatie cruciaal voor experimenteel onderzoek op hart- en vaatziekten en complicaties.

Er zijn talrijke methodologische benaderingen die zijn ontwikkeld voor het analyseren en meten NO productie in biologische monsters. Door de zeer labiele aard van NO die gemakkelijk wordt geoxideerd tot NO ₂ ^- en NO ₃ ^- met een halfwaardetijd van 3 tot 6 seconden is moeilijk direct te meten NO. Derhalve bepaling van NO ₂ ^- / NO ₃ ^- in de vloeistofmonsters werd gebruikt als een index van NO werd vrijgemaakt uit cellen of weefsels ^5. Hoewel de procedure is relatief eenvoudig, de werkwijze is echter eaSily beïnvloed door de hoge achtergrond van de stabiele NO ₂ ^- / NO ₃ ^- in de oplossing. Omdat NO stimuleert oplosbaar guanylaatcyclase aan cyclisch guanosine monofosfaat (cGMP) ⁶ te produceren, heeft het cellulaire cGMP niveau ook is vastgesteld dat NO vrijkomen ⁷ schatten. Ook dit is een indirecte schatting en is derhalve niet specifiek, aangezien sommige endotheel-afgeleide factoren zoals C-type natriuretisch peptide (CNP) ook zou kunnen vergroten cGMP via activering van guanylaatcyclase deeltjesvormig ^8. NO wordt geproduceerd uit L-arginine met vorming van L-citrulline als bijproduct ^9, meting van L-citrulline productie wordt daarom ook gebruikt als een indirecte methode om NO productie schatten. De belangrijkste nadelen van deze methode zijn dat het radioactief is en het niet bioactieve NO te meten, omdat NEE Vrijgegeven kon snel worden geïnactiveerd door O ₂ ^.-; Bovendien kan L-citrulline worden teruggevoerd naar L-arginine ^10. Andere chemische werkwijzen zoals chemiluminescentie detectie ^11, elektronspinresonantie ¹² of elektrochemische porphyrinic NO sensor ¹³ worden gebruikt door verschillende onderzoekers. Deze methoden zijn meestal niet gemakkelijk in operationele, het opsporen van procedures en vereisen speciale apparatuur. Het is ook te vermelden dat veel studies orgaanbad experimenten toe te passen met geïsoleerde bloedvaten, met of zonder het endotheel om endotheelfunctie beoordelen en indirect meet-endotheel afgeleide NO gemedieerde vasculaire relaxaties. Deze werkwijze, hoewel meestal vlakbij fysiologische situatie, maar strikt wil zeggen niet geen functie meten, in plaats beoordeelt endotheel gemedieerde vasomotorische respons in het algemeen dat netto effect van eNOS functie tijdens de productie van andere endothelium afgeleide relaxerende factoren en endotheelafhankelijke verdragsluitende factoren, productie van O ₂ ^.-, alsmede de respons van gladde spiercellendeze factoren. Een specifieke analyse van eNOS functie of NO productie is meestal nodig ^3.

Vele onderzoeksgroepen waaronder ons hebben de afgelopen jaren gebruikt de fluorescentie kleurstof methode om intracellulaire productie van NO ^14-19 detecteren. In deze werkwijze wordt de cel permeabele fluorescentie-indicator diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) werd gebruikt om vrije en NO NOS functie meten in levende cellen en weefsels in vitro of ex vivo. Het principe is dat in de levende cellen, DAF-2DA wordt gedeacetyleerd door intracellulaire esterase aan niet-fluorescerende 4,5- diaminofluorescein (DAF-2), die vervolgens werd omgezet in 2 DAF-triazool (DAF-2T) fluorescerende door reactie met NO . De fluorescentie van DAF-2T kan worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop of fluorescentie confocale microscoop ^14. De intracellulaire fluorescentie-intensiteit dekt dus de intracellulaire NO productie in de cellen of het endotheel in een intacte bloed vessel. Gecombineerd met een specifieke fluorescentie kleurstof zoals dihydroethidium (DHE), kan men tegelijkertijd beoordelen intracellulaire NO en O ₂ ^.- opwekking in de cellen of in bloedvaten ^14. Evenzo DHE is een cel-permeabele stof die wordt geoxideerd door O ₂ ^.- in de cellen, en het product vervolgens oxidatieve intercalaten met nucleïnezuren om een helderrode kleur detecteerbaar kwantitatief fluorescentiemicroscoop of fluorescentie confocale microscoop uitstoten. DHE is een zeer specifieke kleurstof voor detectie van O ₂ ^.- uit biologische monsters, zoals gedetecteerd wezen superoxide radicalen, goed vastgehouden door cellen, en kunnen zelfs milde fixatie ²⁰ tolereren. Een van de voordelen van deze fluorescentie kleurstof methode is dat het detecteert en visualiseert NO en / of O ₂ ^.- en face direct aan de intacte endotheliale laag van een levend bloedvat.

In deze krant,beschrijven we deze fluorescentie kleurstof methode om NO te detecteren en O ₂ ^.- die we hebben aangepast voor en gezichtsherkenning van NO en O ₂ ^.- in intacte aorta's van een obesitas muismodel geïnduceerd door vetrijk dieet (HFD) voeding. We laten zien dat deze methode met succes en betrouwbaar kunnen meten NO en O ₂ ^.- niveaus en eNOS (dys) functie te evalueren in de endotheliale laag van vers geïsoleerde intact muis aorta's in obesitas.

Protocol

Animal werk werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Veterinair Bureau van Fribourg, Zwitserland. Het protocol volgt de richtlijnen voor verzorging van dieren en experimenten bij onze instelling.

1. Bereiding van een set-up voor de incubatie van geïsoleerde slagaders

1. Construct een orgaanbad systeem dat tot 37 ° C worden verwarmd en belucht met 95% _O2 en 5% _CO2 uit een koolstof gastank.
2. Bereid zoveel Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer indien nodig de concentratie van de volgende samenstelling: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCI, 2,5 mM _CaCl2, 1,2 mM _MgSO4, 1,2 mM KH _{2PO 4,} 25 mM NaHCO _3, 0,026 mM EDTA en 11,1 mM D-glucose).
3. Houd de voorraad buffer op ijs en beluchten van de buffer met 95% _O2 en _{5% CO2.}
4. Schakel het orgaanbad systeem, de temperatuur bij 37 ° C, voeg 5 ml van de kant-en-klare buffer elke kameren houden beluchten de buffer met 95% _O2 en _5% CO2.
5. Was de kamers een keer met Krebs-Ringer buffer gedurende 30 min.
6. Voeg 5 ml Krebs-Ringer buffer aan elke kamer en hebben betrekking op de kamer om verdamping te voorkomen.

2. Isolatie van Mouse aorta

1. Injecteer pentobarbital die intraperitoneaal wordt opgelost in 0,9% NaCl bij een concentratie van 150 mg / kg om de muizen te offeren.
2. Leg de muis achterover op een chirurgische boord.
3. Spray de vacht van de borstkas met 70% ethanol behoeve van sanering en vocht.
4. Open borstholte door het snijden van rond de rib naar het hart en de longen bloot te leggen, en verwijder de longen.
5. Verwijder het bloed in de borstholte voorzichtig met een tissue.
6. Pak het hart voorzichtig met een pincet en verwijder de thoracale aorta door het snijden van de perivasculaire vetweefsel tussen de aorta en de wervelkolom met chirurgische schaar.
7. Onmiddellijk dompel de groe weefsels in ijskoude (4 ° C) Krebs-Ringer buffer.
8. Verwijder het hart en de aortaboog onder een dissectie microscoop en houd de thoracale aorta segment in de buffer.
9. Ontleden de aorta vrij van het naleven perivasculaire weefsel onder een microscoop met chirurgische schaar en pincet.
10. Pak de eindrand van de aorta met een forceps, en weg te spoelen het bloed in het vasculaire lumen door zachtjes spoelen Krebs-Ringer buffer met een 26 G x 1 / 2" spuit.
11. Snijd de schoongemaakte aorta ringen tot 3 mm lang segmenten.
    Opmerking: Let op deze stap om endotheliale laag niet beschadigen.

3. DHE en DAF-2DA kleuring

1. Breng de gereinigde aortische segmenten met een tang om de kamers orgaanbad gevuld met Krebs-Ringer buffer bij 37 ° C belucht met 95% _O2 en _5% CO2.
   Opmerking: Raak alleen de adventitia kant van de aorta ringen met een tang en niet de b niet klemmenLood schepen.
2. Equilibreren de slagaders in het orgaanbad kamer gedurende 30 minuten.
3. acetylcholine (ACh) toevoegen orgaanbad de eindconcentratie 1 uM, en incubeer de aders 10 min.
4. Bereid 1 ml DHE / DAF-2DA oplossing (5 uM van elke kleurstof, verdund van 1000 x voorraad) met voorverwarmd Krebs-Ringer buffer in 1,5 ml microcentrifugebuis. Wikkel de microcentrifugebuis met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen.
5. Na stimulatie, overdracht van de aortaringen van orgaanbad de DHE / DAF-2DA oplossing in een microcentrifuge buis bij 37 ° C belucht met 95% _O2 en _5% CO2 en incubeer de aorta ringen voor 30 min.
   Let op: Vanaf deze stap, houd de aorta altijd in het donker.
6. Breng de aorta ringen naar een nieuwe microcentrifugebuis met Krebs-Ringer buffer voor het wassen en herhaal het wassen drie keer binnen 1 min.
7. Breng de aortaringen tot 4% paraformaldehyde oplossing bevestiging voor 30min.
8. Bereid 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oplossing (300 nM verdund van 1000 x voorraad) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Tegenkleuring de aorta voor 3 minuten.
9. Breng de aorta nieuwe microcentrifugebuis met PBS buffer voor het wassen gedurende 1 min. Herhaal het wassen driemaal.
   Opmerking: Let niet op de aorta ringen klemmen of schade aan het endotheel laag.

4. En Face Montage

1. Voeg een druppel montage medium op de dia.
2. Snijd de aorta ringen lengterichting met microchirurgische scharen onder de microscoop, maken het opgerolde aorta vlak en monteer het eigen gezicht op de montage medium met het endotheel naar beneden op het glaasje. Niet heen en weer bewegen van de aorta.
3. Bedek de dia met dekglas en sluit de dia met nagellak.
4. Na drogen aan de lucht onder lichte bescherming, gebruik maken van de dia's voor het afbeelden van directly binnen enkele uren of bewaar ze bij -20 ° C voor de volgende paar dagen.

5. Confocale Microscopische Beeldvorming

1. Gebruik een confocale microscoop om de fluorescentiesignalen te detecteren. Schakel de machine en de beeldvormende instellingen zoals vergroting, scansnelheid, resolutie, Z-stack optimaliseren.
   1. Voor dit protocol, gebruik maken van een 200 Hz scansnelheid, resolutie van 1024 × 1024 pixels en Z-stapgrootte van 0,25 micrometer. Excite fluorescentie van DAF-2DA met 488 nm argon laser en op te sporen bij 515 nm, terwijl fluorescentie prikkelen van DHE bij 514 nm en op te sporen bij 605 nm emissie.
2. Gebruik 10X vergrotingen om zich te concentreren op het monster totdat de DAPI signaal is duidelijk met ultraviolette stralen, en dan is de doelstelling aan te passen aan 40X vergrotingen.
3. Om het bereik van endotheliale laag door aanpassing Z-positie op het bedieningspaneel. De signalen van DAPI gekleurde kernen ovale of ronde stippen in de endotheliale laag.
4. Scannen vanuit de top(Endotheellaag op het lumen grens) van het monster door de volledige dikte van endotheliale signalen en beelden. Minstens 3 verschillende gebieden voor het scannen van elk monster.

6. beeldanalyse

1. Gebruik software om de data gescand door confocale microscoop te openen. Kies drie opeenvolgende beelden per veld voor analyse en ten minste 3 verschillende gebieden per monster te evalueren. Exporteer de gekozen foto's en opslaan als JPEG-bestanden.
2. Kwantificeren van de beelden van DAF-2DA, DHE en DAPI kleuring met beeldbewerkingssoftware. Voor de afbeelding van DAPI kleuring, kiest u 'Plugins' → 'Analyze' → 'Cell Counter' om het aantal DAPI positieve kern tellen.
   1. Voor de beelden van DAF-2DA en DHE kleuring, kies 'Analyze' → 'Measure' om de intensiteit van de signalen te analyseren, en neem de 'Mean' waarde als de relatieve intensiteit van het signaal. Heden dan de resultaten als de verhouding van DAF-2DA naarDAPI positieve kernen of ratio van DHE te DAPI. Voor elk monster, neem dan de gemiddelde waarde van elk beeld en in het veld.
3. Verdeel het resultaat van elk monster met het gemiddelde van de controlegroep de veelvoudverandering krijgen. Statistische analyse werd uitgevoerd met ongepaarde Student t-test of ANOVA met Dunnett of Bonferroni post-test. Geven data als gemiddelde ± SEM. Beschouw verschillen in gemiddelde waarden significant bij p <0,05 ^14.

Resultaten

Obesitas is een belangrijke risicofactor voor ischemische coronaire hartziekten en wordt geassocieerd met een verminderde endotheliale NO biologische beschikbaarheid, een kenmerk van atherosclerotische vaatziekte ^21. eNOS ontkoppeld is aangetoond dat een belangrijk mechanisme van endotheeldisfunctie onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden zoals vergrijzing ^22, atherosclerose, obesitas en ^14. Daarom hier vergelijken we de slanke e...

Discussie

Detectie van NO of O ₂ ^.- met fluorescerende kleurstoffen werd veelvuldig bij vele studies in gekweekte endotheliale cellen en in weefsels cryosecties ^23. Hier uitgebreid we deze methode om intacte levende bloedvaten, dat wil zeggen, en gezichtsherkenning van NO en O ₂ ^.- niveaus in de endotheliale laag met DAF-2DA en DHE, respectievelijk, die effectief is, relatief eenvoudig en intuïtief. In vergelijking met de werkwijze in vasculaire vriescoupes ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dihydroethidium (DHE)	Invitrogen	D 1168	oplossen met DMSO tot 5 mmol/L als 1.000x stock, opgeslagen bij -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA)	Calbiochem	251505	oplossen met DMSO tot 5 mmol/L als 1.000x stock, opgeslagen bij -20 °C
4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)	Invitrogen	D 1306	oplossen met water tot 300 µmol/L als 1.000x stock, opgeslagen bij 4 °C
Montagemedium	Vector labor. (reactolab)	H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)	Sigma-aldrich	N5751
Pentobarbital	Sigma-aldrich	P3636
Multi-Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 610M
Microscoop	Nikon	SMZ800
Confocale microscoop	Leica	DM6000
Beeldverwerkingssoftware	National Institute of Health (NIH)	Image J
Chirurgische schaar	S&T AG	SDC-11
Microchirurgische schaar	F.S.T	15000-01
Pincetten	S&T AG	JF-5
Dekglas rond diameter 15 mm	VWR	631-1579
Tips 1 ml	VWR	RFL-1200c
Tips 200 μl	VWR	613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml	Eppendorf	30120086
Acetylcholine chloride	Sigma-aldrich	A-6625