Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een hoge resolutie methode om Fosforylatie-afhankelijke activering van IRF3 Monitor

11.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53723

⸱

24 januari 2016

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een procedure die een gedetailleerde analyse mogelijk maakt van de fosforyleringsafhankelijke activering van de IRF3-transcriptiefactor. Dit wordt bereikt door de combinatie van een hoge resolutie SDS-PAGE en een native-PAGE gekoppeld aan immunoblots met behulp van meerdere fosfospecifieke antilichamen.

Samenvatting

De IRF3-transcriptiefactor is cruciaal voor de eerste lijn van verdediging tegen pathogenen, voornamelijk door interferon β en antivirale genexpressie. Een gedetailleerde analyse van IRF3-activering is essentieel om te begrijpen hoe pathogenen de aangeboren antivirale respons induceren of ontwijken. Verschillende geactiveerde vormen van IRF3 kunnen worden onderscheiden op basis van hun fosforylering en monomeer vs dimeer status. In vivo onderscheid tussen de verschillende geactiveerde soorten van IRF3 kan worden bereikt door de scheiding van gefosforyleerde IRF3-vormen op basis van hun mobiliteitsverschuivingen op SDS-PAGE. Bovendien kunnen de niveaus van IRF3-monomeer en -dimer worden gecontroleerd met behulp van niet-denaturerende elektroforese. Hier beschrijven we een procedure om de hoogste resolutie te bereiken om de meeste informatie te verkrijgen over de activeringsstatus van IRF3. Dit wordt bereikt door de combinatie van een hoge resolutie SDS-PAGE en een native-PAGE gekoppeld aan immunoblots met behulp van meerdere totale en fosfospecifieke antilichamen. Deze experimentele strategie vormt een betaalbare en gevoelige aanpak om alle nodige informatie te verzamelen voor een volledige analyse van de fosforyleringsgemedieerde activering van IRF3.

Inleiding

De alomtegenwoordig en constitutief uitgedrukt transcriptiefactor Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) is van cruciaal belang voor de eerste verdedigingslinie tegen pathogenen voornamelijk door de inductie van IFNβ, maar ook door de inductie van de chemokine (CC-motief) ligand 5 (CCL5 ) en verscheidene antivirale eiwitten zoals IFN geïnduceerde eiwitten met tetratricopeptide herhaalt IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 activering werd gemeld na infectie met verschillende virussen, of blootstelling aan polyinosinic-polycytidylic acid (poly I: C) of lipopolysaccharide (LPS) 4. Belangrijker is, hebben de meeste bestudeerde virussen mechanismen ontwikkeld om de IRF3 gemedieerde respons te omzeilen, en daardoor ontsnappen aan de gastheer aangeboren afweer 5. Zo bewaken IRF3 activatie van groot belang te begrijpen van de moleculaire mechanismen van het aangeboren antivirale afweer, maar ook voor de door deze virussen reactie tegen strategie identificeren.

ent "> Veel gepubliceerde rapporten geven echter slechts een beperkte analyse van IRF3 activatie uitgevoerd door het volgen van IRF3-doelgen inductie (IFNB1 en IFIT1) en / of luciferase reportergen assay gekoppeld met lage resolutie natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS- PAGE) analyse van IRF3. evenwel talrijke biochemische studies, analyse van het gedrag van verschillende IRF3 mutanten en opheldering van IRF3 kristalstructuur 6-11 hebben bijgedragen IRF3 vast is onderworpen aan een complexe reeks opeenvolgende posttranslationele modificaties door fosforylatie bij meerdere plaatsen. De set van fosforylatie betrokken IRF3 activering wordt afhankelijk van de stimulus en hoogstwaarschijnlijk het celtype zijn. In niet-geïnfecteerde cellen, IRF3 coëxisteert als niet-gefosforyleerde en gehypofosforyleerde bevattende soorten phosphoresidues, waaronder Thr135 en Ser173, de 1 -198 aa N-terminale gebied 6,12-14. Ophoping van deze gehypofosforyleerde form van IRF3 wordt geïnduceerd door stress inducers, groeifactoren en DNA-beschadigende middelen 6. Fosforylering van Ser / Thr residuen aan het C-terminale gebied van IRF3 met het transactiveringsdomein wordt geactiveerd na activering door virussen, poly I: C of LPS in een celtype afhankelijke wijze 15-17. C-terminale fosforylering van IRF3 impliceert niet minder dan 7 verschillende phosphoacceptor locaties georganiseerd in twee clusters, Ser385 / Ser386 en Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, die elk bijdragen aan IRF3 activering door middel van dimerisatie, nucleaire accumulatie, associatie met het CREB -bindende eiwit (CBP) / p300 coactivatoren, DNA-bindende gevoelige respons element (ISRE) consensus sequenties en transactivatie van target genen 9,10,17-19 IFN. Fosforylering van Thr390 is ook gedacht om bij te dragen aan-virus-geïnduceerde IRF3 activering 20. Massaspectrometrie analyses van IRF3 hebben aangetoond dat Ser386, Thr390, Ser396 en Ser402 resten direct fosforylatieed door de remmer van KB-kinase ε (IKKε) /-TANK bindend kinase 1 (TBK1) kinasen 9,10. Fosforylering van het C-eindstandige resten is ook vereist voor beëindiging van IRF3 activering door middel polyubiquitinatie en proteasoom-afhankelijke afbraak 10. Deze werkwijze is ook afhankelijk van de fosforylatie van Ser339, die nodig is voor het aantrekken van de propyl isomerase Pin1 10,11. IRF3 species met tenminste fosfo-Ser339 / 386/396 residu's worden beschouwd gehyperfosforyleerd vormen. De exacte volgorde en de functie van elke site blijft een onderwerp van discussie 10,21. Het is nu duidelijk dat geactiveerd IRF3 vormt geen homogene staat, maar dat de verschillende geactiveerde soorten vertonen duidelijke fosforylering of dimerisatie kenmerken bestaan ​​10,22.

Om een ​​volledig begrip van IRF3 activering mogelijk in antwoord op specifieke pathogenen, is het dus noodzakelijk om characterize welke de geactiveerde species worden opgewekt. Inductie van IRF3 target genen, IFNB1 en IFIT1, heeft zich bewezen als een betrouwbare uitlezing voor IRF3 activering mogelijk maken. De controle expressie van deze genen geen onderscheid maakt tussen verschillende toestanden van activering IRF3. Een uitgebreide analyse van IRF3 activering staten in een bepaalde instelling is gebaseerd op de gedetailleerde karakterisering van de fosforylering en dimerisatie-status 10. Gefosforyleerde (formulier I), gehypofosforyleerde (vorm II) en hypergefosforyleerde (vormen III en IV) IRF3 vormen 6,18,23 succes kan worden opgelost door een verminderde mobiliteit in hoge-resolutie SDS-PAGE analyse. Monomeer en dimeer IRF3 soorten kunnen efficiënt worden geïdentificeerd door native-PAGE analyse. Deze benaderingen zijn sterk verbeterd bij gebruik in combinatie met fosfospecifiek antilichamen gericht tegen verschillende IRF3 phosphoacceptor sites.

Standaardprotocollen maken een slechte resolutie vaneiwitten die efficiënte scheiding van verschillende IRF3 gefosforyleerde vormen niet toestaat. Hier hebben we in vivo onderscheid tussen de verschillende geactiveerd in detail beschrijven een procedure om de hoogste resolutie bereiken de inductie van afzonderlijke-virus geactiveerd IRF3 soort, volgens SDS-PAGE gekoppeld met natieve PAGE in combinatie met immunoblot gebruikt totaal fosfospecifiek antilichamen te controleren. vormen van IRF3 wordt uitgevoerd op basis van hun mobiliteit verschuivingen waargenomen op SDS-PAGE. Bovendien kan IRF3 monomeer en dimeer worden onderscheiden door niet-denaturerende elektroforese. De combinatie van deze twee complementaire technieken met immunoblot blijkt een betaalbare en gevoelige benadering van alle nodige informatie voor een volledige analyse van fosforylering gemedieerde activering van IRF3 verwerven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het protocol wordt hier beschreven met behulp van A549 cellen geïnfecteerd met Sendai-virus (SeV). Echter, het protocol voor SDS-PAGE en inheemse PAGE werkt ook met alle menselijke en muizen celtypen dusver getest, met name myeloïde cellen gestimuleerd met diverse IRF3 activerende stimuli 9,15,19,24,25.

1. Infectie van A549 Cells

  1. Handhaaf A549 cellen in kweek in een 15 cm plaat bij 37 ° C / 5% CO 2 in 20 ml F12K / Ham medium dat 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HI-FBS) en 1% L-glutamine (compleet F12K / Ham gemiddeld).
    OPMERKING: Alle gebruikt voor celkweek en behandelingen oplossingen moeten steriel zijn.
  2. Op 24 uur voor de infectie, zuig het medium en spoelen van de cellen met 10 ml gedestilleerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (D-PBS) bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 1 ml van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing aan elke plaat om de cellen te bedekken en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min.
  4. Stop de incubatie zodra the cellen beginnen te los te maken van de plaat door zachtjes de plaat tikken met één hand. Inactivatie van het trypsine door toevoeging van 10 ml van voorverwarmd compleet F12K / Ham medium per plaat en overbrengen van de cellen naar een 15 ml conische buis.
  5. Centrifugeren bij 350 g gedurende 3 min bij RT. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 8 ml compleet F12K / Ham medium tot een homogene enkele celsuspensie te verkrijgen.
  6. Tel de cellen met een hemocytometer. Zaad de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen per 60 mm plaat 4 ml voorverwarmd compleet F12K / Ham medium. Incubeer gedurende 20 - 24 uur bij 37 ° C / 5% CO 2. Na 20 - 24 uur, de cellen vormen een confluente monolaag 90% (dit komt overeen met 1,5 x 10 6 cellen).
  7. Verwijder het medium en spoelen van de cellen met 2 ml serumvrij F12K / Ham medium (SFM). Voeg 2 ml vers SFM per 60 mm plaat.
  8. Dooi een hoeveelheid van Sendai virus (SeV) (opgeslagen in porties bij -80 ° C) op ijs en vortex kort.
  9. Verdunnen the virus in voorverwarmde SFM tot 60 HAU / 100 ui te verkrijgen. Meng door op en neer pipetteren zacht en voeg 100 ul verdunde virusoplossing per plaat om de infectie te voeren op 40 HAU / 10 6 cellen. Do virus toe te voegen in de niet-geïnfecteerde stuurplaat.
  10. Incubeer de cellen in de incubator bij 37 ° C / 5% CO 2. Schud de platen met de hand 3 of 4 keer, of een automatisch orbitale of rocking shaker direct geplaatst in de incubator gedurende het eerste uur van de infectie.
  11. Op 2 uur na infectie, voeg 2 ml F12K / Ham medium dat 20% HI-FBS tot een uiteindelijke concentratie van 10% HI-FBS verkrijgen.
  12. Incubeer de cellen in de incubator bij 37 ° C / 5% CO 2 tegen 1, 4 en 7 uur tot totaal infectie keer bereiken van 3, 6 en 9 uur, respectievelijk. Op elk van deze tijdstippen, ga dan naar stap 2.1.

2. Voorbereiding van de volledige celextracten (WCE)

  1. Verwijder het infectiemedium. Oogst de cellen door schrapen in 1 mlijskoude D-PBS en breng de celsuspensie op een vooraf gekoelde 1,5 ml centrifugebuis.
  2. Pellet de cellen door centrifugeren bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 sec en zorgvuldig decanteer alle sporen van D-PBS.
    Opmerking: In deze stap kan de celpellet direct worden onderworpen aan proteïne extractie of snel bevroren in vloeibare stikstof of droog ijs / ethanol bad en bij -80 ° C totdat lysis.
  3. Bereid de lysis buffer bevattende 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% glycerol en 1% Nonidet P-40 in gedeïoniseerd water (DDH 2 O). Extemporarily voeg protease (1 ug / ml leupeptine en 2 ug / ml aprotinine) en fosfataseremmers (5 mM natriumfluoride, 1 mM geactiveerde natriumorthovanadaat, 2 mM p-nitrofenylfosfaat en 10 mM β-glycerofosfaat pH 7,5).
    Opmerking: De lysisbuffer zonder remmers kunnen bij 4 ° C bewaard. Een specifiek protocol voor het activeren van natriumorthovanadaat wordt beschreven in de tabel van specifieke reagentia / Equipment.
  4. Resuspendeer de celpellet in 70 ul lysisbuffer. Typisch de lysaat concentratie ongeveer 2 ug / ul zijn.
  5. Incubeer op ijs gedurende 20 min. Flash-bevriezen het lysaat door incubatie in een vloeibaar stikstof bad gedurende 15 sec. Ontdooi het lysaat bij KT totdat deze volledig gesmolten en vortex gedurende 10 seconden. Herhaal de vries / dooi / vortex cyclus 3 keer.
    1. Als alternatief, het uitvoeren van de bevriezing stap in een ethanol / droog ijsbad gedurende 1 min.
  6. Centrifugeer bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 min. Breng de bovenstaande vloeistof (overeenkomend met de WCE) om een ​​nieuwe voorgekoelde 1,5 ml centrifugebuis. Houd de WCE op ijs te allen tijde.
  7. Kwantificeren eiwitten met elke eiwit kwantificatie procedure verenigbaar met de lysisbuffer zoals Bradford-assay 26 eiwitten.

3. Resolutie van WCE door met hoge resolutie SDS-PAGE

  1. Bereid drie denaturerende elektroforese gels.
    1. Voor de detectie vanIRF3 vormen, giet twee gels van minimaal 16 cm lang met een scheiding gel bestaande uit 7,5% acrylamide / bisacrylamide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS ), 1% ammoniumpersulfaat en 0,1% TEMED in DDH 2 O en stapelgel bestaande uit 4% acrylamide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% ammoniumpersulfaat en 0,1% TEMED in DDH 2 O.
      Voorzichtigheid! Acrylamide, TEMED en SDS zijn giftig en / of irriterend. Draag beschermende handschoenen en manipuleren onder een zuurkast.
    2. Voor de detectie van SeV eiwitten, giet een gel van ten minste 8,5 cm lengte met soortgelijke beschreven in 3.1.1, behalve dat de scheiding gel bevat 12% acrylamide gel kenmerken.
  2. Denatureren de WCE verkregen in stap 2.6 door toevoeging van 1: 4 (v / v) 5x laadbuffer (125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p / v) glycerol, 0,0005% broomfenolblauw en 25% β-mercaptoethanol in DDH 2 O), gevolgd door verwarming bij 100 °C gedurende 10 min. Snelle draai de buizen naar beneden de condensatie die zich vormt in de dop brengen.
    Voorzichtigheid! β-mercaptoethanol toxisch bij inademing. Draag beschermende handschoenen en manipuleren onder een zuurkast.
  3. Monteer de gels in de migratie apparaat. Vul het bovenste en onderste kamers met lopende buffer bevattende 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS en 192 mM glycine in gedestilleerd water (dH 2 O).
  4. Belasting 14 pi molecuulgewichtstandaard in een putje van elk 16 cm gel en 7 ui molecuulgewichtstandaard in een putje van 8,5 cm gel. Belasting 30 ug gedenatureerd WCE (bereid zoals beschreven in stap 3,2) per putje van de twee gels bereid in stap 3.1.1 IRF3 vormen detecteren. Load 8 - 10 ug gedenatureerd WCE (bereid zoals beschreven in stap 3.2) per well op bereid in stap 3.1.2 voor SeV-analyse gel.
  5. Voer de gels bij 30 mA constante stroom totdat de migratie achterkant onderkant van de gel bereikt.
    OPMERKING: Migratie duurt meestal approximately 3 uur voor een 16 cm gel en 45 min bij 8,5 cm gel.
  6. Ga verder met de overdracht naar nitrocellulose membranen (stap 5).

4. Analyse van IRF3 Dimerisatie van Native-PAGE

LET OP: Deze methode werd oorspronkelijk beschreven door de groep van Dr. T. Fujita 27.

  1. Bereid de bovenste (-) en onderste (+) kamer elektroforese buffers. De bovenkamer buffer bestaat uit 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), 192 mM glycine en 1% natriumdeoxycholaat (DOC) in DDH 2 O. De onderste kamer buffer bevat 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) en 192 mM glycine in DDH 2 O.
    Opmerking: De bovenste en onderste kamer elektroforese buffers kunnen bij 4 ° C tot gebruik bewaard. Echter, zorg ervoor dat ze pre-opgewarmd tot RT voor het uitvoeren van de elektroforese.
  2. Giet een niet-denaturerende gel oplossen van minimaal 8,5 cm lengte met 7,5% acrylamide / bisacrylamide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% ammonium persulfaat en 0,1% TEMED in DDH 2 O.
  3. Pre-run de gel bij 40 mA constante stroom gedurende 30 minuten op ijs. Druk de draaiende inrichting in het ijs bij benadering op het niveau van de onderste kamer elektroforesebuffer. Het is belangrijk dat de gel niet in het ijs.
  4. Tijdens de pre-run, meng WCE gehouden op ijs met 2x native-PAGE laadbuffer 1: 1 (v / v) met 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% glycerol en 0,1% broomfenolblauw in DDH 2 O.
  5. Load 8 - 10 ug WCE (bereid zoals beschreven in stap 4,4) onmiddellijk na afloop van de pre-run.
  6. Voer de gel bij 25 mA constante stroom op ijs, zoals hierboven beschreven voor de pre-run, totdat de migratie achterkant onderkant van de gel (ongeveer 40 min) bereikt.

5. Immunoblot analyse van IRF3 Species

  1. Bereid de overdracht buffer die 25 mM Tris-Base en 192 mM glycine in DDH 2 O. Koel de overdracht buffer bij 4 ° C vóór gebruik.
  2. Natte drie stukken nitrocellulosemembraan gesneden iets groter is dan de gels in een plastic / glazen kast met de overdrachtsbuffer. Geven de oriëntatie van het membraan door het snijden van een hoek. De transfer buffer kan 3 maal hergebruikt worden. Bewaar de buffer bij 4 ° C tussen toepassingen.
  3. Uncast de gels (SDS-PAGE en native PAGE) en knip één hoek van elke gel voor de juiste oriëntatie.
    1. Bij natieve PAGE, incubeer de gel bij kamertemperatuur onder zacht schudden gedurende ten minste 30 min in SDS-PAGE lopende buffer om de DOC verwijderen alvorens naar de overdrachtsbuffer.
  4. Incubeer de gels (SDS-PAGE en native-PAGE) in het overdrachtsbuffer gedurende 5 - 10 min.
  5. Monteer een transfer sandwich per gel in een transfer cassette met het membraan naar de positieve elektrode (schuim pad / filterpapier / membraan / gel / filter papier / foam pad). Wees voorzichtig om alle luchtbellen tussen de lagen van de sandwich verwijderd.
  6. Voer de overdracht zoals aanbevolen by de fabrikant voor de overdracht gebruikte apparatuur.
    OPMERKING: Voer alle incubaties en wast in de volgende stappen op een schommelstoel of orbitale schudden platform.
  7. Aan het einde van de overdrachtstijd, incubeer de membranen gedurende 15 min in fixatie oplossing bevattende 7% azijnzuur, 40% ethanol en 3% glycerol in DDH 2 O. Was de membranen 3 x 5 min in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 en 1,8 mM KH 2PO 4 in dH 2 O).
    Voorzichtigheid! Azijnzuur is giftig, irriterend en ontvlambaar. Draag beschermende handschoenen en manipuleren onder de zuurkast.
    OPMERKING: De fixatie oplossing kan meerdere malen worden hergebruikt.
  8. Voor de inheemse-PAGE membraan direct doorgaan naar stap 5.11.
  9. Snel spoelen drie SDS-PAGE membranen in dH 2 O vóór incuberen gedurende 1 min bij Ponceau rode oplossing bevattende 6,57 mM Ponceau rode en 1% azijnzuur in DDH 2 O.
    OPMERKING: De rode ponceau oplossing kan r worden eused meerdere malen.
  10. Spoel de membranen in dH 2 O, totdat de achtergrond is wit genoeg om de eiwitbanden gekleurd in het rood te zien. Let op de markeringen met een potlood en snijd de overtollige membraan rond de eiwitten. Destain de membranen door incubatie gedurende 5 min in PBS onder roeren.
  11. Incubeer de membranen gedurende 1 uur bij RT of O / N bij 4 ° C in de blockingbuffer (PBS met 0,05% Tween 20 en 5% magere melkpoeder (PBS-T-melk). Was de membranen 3 x 5 min in PBS-T.
    Opmerking: De PBS-T wassen is optioneel en alleen strikt vereist bij het ​​toepassen antilichamen verdund in PBS-T met 5% runderserumalbumine (PBS-T-BSA) (Figuur 1 en Tabel 1) bij de volgende stap.
  12. Incubeer de vier membranen (van SDS-PAGE en natieve PAGE) met de primaire antilichamen volgens de volgorde beschreven in figuur 1 en tabel 1. Voer 5x 5 min wassingen in PBS-T.
"> figure-protocol-1
Figuur 1. Sequentie van immunoblot analyses. Het schema beschrijft de individuele SDS-PAGE en natieve PAGE-gels nodig om de verschillende IRF3 gefosforyleerde en monomeer / dimeer vormen detecteren. De specifieke volgorde van antilichamen toegepast op het membraan verkregen uit elke gel in de immunoblot wordt beschreven. Merk op dat de anti-actine antilichamen eerst worden gebruikt om gelijke lading van de monsters te verzekeren voordat enige andere specifieke antilichamen. De alternatieve sequentie met anti-actine antilichamen worden toegepast na de anti-fosfo-IRF3 antilichamen, ook werkt. Strippen wordt gebruikt tussen anti-actine en anti-SeV antilichamen, of tussen anti-fosfo-IRF3 en anti-IRF3 antilichamen vanwege overlappende grootte van de signalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Primaire antilichamen Verdunning Verdunningsbuffer Incubatie Secundaire antilichamen Opmerkingen
Anti-Actin 1 / 10.000 PBS-T-BSA 15 min bij KT Anti-muis Gebruiken na SDS-PAGE
Verdunde antibodyies kan meerdere keren worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C bij aanwezigheid van 0,02% natriumazide.
Anti-IRF3-P-Ser386 1/200 PBS-T-BSA O / N bij 4 ° C Anti-konijn Gebruiken na Inheems-PAGE.
Het is niet aan te raden om de verdunde antilichaam hergebruiken
Anti-IRF3-P-Ser396 1 / 10.000 PBS-T-BSA O / N bij 4 ° C Anti-rabbit Gebruiken na SDS-PAGE.
Het is niet aan te raden om opnieuw de verdunde antilichaam anti-IRF3-P-396 is ook verkrijgbaar bij Cell Signaling. Optimale verdunning werd gedefinieerd als 1 / 1.000 van dit antilichaam, maar kan variëren tussen partijen.
Anti-IRF3-P-Ser398 1 / 10.000 PBS-T-BSA O / N bij 4 ° C Anti-konijn Gebruiken na SDS-PAGE. Het is niet aan te raden om de verdunde antilichaam hergebruiken
Anti-IRF3 volledige lengte 1/7500 PBS-T-melk 3 uur bij KT Anti-konijn Gebruiken na SDS-PAGE. Anti-IRF3 antilichaam van volledige lengte kan worden gebruikt na natieve PAGE, maar is minder gevoelig voor de monomeer detecteren. Verdunde antilichamen kunnen meerdere malen worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C bij aanwezigheid van 0,02% natriumazide.
Anti-IRF3-NES 0,5 ug / ml PBS-T-melk 3 uur bij KT Anti-konijn Gebruiken na Inheems-PAGE. Verdunde antibodyies kan meerdere keren worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C bij aanwezigheid van 0,02% natriumazide.
Anti-SeV 1 / 14.000 PBS-T-BSA 3 uur bij KT Anti-konijn Gebruiken na SDS-PAGE. Verdunde antibodyies kan meerdere keren worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C bij aanwezigheid van 0,02% natriumazide.
OPMERKING: verdunning en buffer gebruikt voor de HRP-gekoppelde secundaire antilichamen moeten worden geoptimaliseerd als het varieert van het ene bedrijf naar het andere.

Tabel 1. Specificaties van antilichamen worden gebruikt in de Immunoblotting Procedure.

  1. Incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd secundaire antilichamen zoals beschreven in figuur 1 en tabel 1. Was de membranen 5x 5 min in PBS-T, vervolgens 2 x 5 min in PBS om sporen Tween volledig te verwijderen.
  2. Incubeer de membranen gedurende 1 min in een volume van versterkte chemiluminescentie reagens voldoende doorgronden van de membranen. Droog de membranen met filterpapier.
  3. Plaats de membranen in een afbeelding lichtgevende analyser aan de immunoreactieve bands visualiseren.
    1. Als alternatief, het uitvoeren van de detectie van immunoreactieve banden met gevoelige X-Ray films.
  4. Was de membranen 3x 5 min in PBS.
    Opmerking: In deze stap de membranen droog kan worden gehouden. Indien verder strippen nodig is, is het beter om het strippen uitgevoerd vóór het drogen van het membraan. Membranen kunnen ook worden opgeslagen op korte termijn in PBS.
  5. Voor de membranen die niet nodig strippen tussen incubatie met antilichamen (zie figuur 1) ga dan naar stap5.20.
  6. Wanneer het strippen nodig is tussen antilichamen (zie figuur 1), incubeer de membranen in voorverwarmde stripping oplossing die 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) en 0,7% β-mercaptoethanol in DDH 2 O bij 50 ° C gedurende 20 min onder regelmatig roeren. Was de membranen 3x 5 min in PBS.
    OPMERKING: Roeren tijdens het strippen procedure is de sleutel. Strippen kan worden uitgevoerd in een hybridisatie oven. Alternatief strippen kan worden uitgevoerd met membranen afgesloten in plastic zakken en ondergedompeld in een waterbad. In dit geval is het belangrijk om de membranen te roeren 4 - 5 keer tijdens de incubatie.
  7. Incubeer de membranen gedurende 1 uur bij RT of O / N bij 4 ° C in PBS-T-melk.
  8. Herhaal stap 5,12 tot 5,16 volgens figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een typisch beeld van immunoblot IRF3 gedetecteerd met IRF3 totale antilichamen en IRF3-fosfospecifiek antilichamen tegen Ser396 en Ser398 na resolutie van WCE door een hoge-resolutie SDS-PAGE Figuur 2 toont. In ongestimuleerde A549 cellen, wordt IRF3 gedetecteerd als twee banden op 50 en 53 kDa op SDS-PAGE die overeenkomen met de niet-gefosforyleerd (vorm I) en de gehypofosforyleerde (vorm II) soorten IRF3. Blootstelling van A549 cellen SEV voor 3-9 uur resulteert in ee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol beschrijven we hier bestaat uit een combinatie van hoge-resolutie SDS-PAGE en natieve PAGE gekoppeld aan het gebruik van verschillende fosfospecifiek antilichamen tegen het monomeer / dimeer en phosphoforms I-IV van IRF3 onderscheiden. Geschikte detectie van deze IRF3 soort is essentieel om volledig te karakteriseren IRF3 activering in een specifieke instelling. Bijvoorbeeld, LPS stimulatie van geactiveerde macrofagen leidt tot de vorming van dimere, Ser396 / 398 gefosforyleerd IRF3 een gehypofosforyleerde ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de voormalige en huidige leden van het laboratorium voor de ontwikkeling van de protocollen. Het werk werd ondersteund door financiering van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [subsidie # MOP-130527] en van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is ontvanger van een Tier II Canada Research Chair. AR heeft een beurs van het opleidingsprogramma van het Respiratory Health Research Network van de Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
F12/HamLife Technologies11765-054Verwarm in een 37 °C bad voor gebruik.
Fetal bovine serumLife Technologies12483-020
L-glutamineLife Technologies25030-081
D-PBSLife Technologies14190-144Voor celcultuur.
Trypsin/EDTA 0.25%Life Technologies25200-072
Sendai virus Cantell StrainCharles River Laboratories600503
HepesBioshopHEP001
Sodium chloride (NaCl)BioshopSOD001.5
EDTABioshopEDT001
GlycerolBioshopGLY001.1Snij de extremiteit van de punt af en pipet langzaam omdat het erg dik is.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771Geregistreerd handelsmerk dat overeenkomt met Octylfenoxy poly(ethyleenoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent
LeupeptinBioshopLEU001
AprotininBioshopAPR600.25 
Sodium fluorideSigma-Aldrich201154
Sodium orthovanadateMP Biomedicals159664Activering van natriumorthovanadate 0,2 M: 1) Pas de pH aan tot 10,0 met behulp van 1 N NaOH of 1 N HCl. De start-pH van de natriumorthovanadate-oplossing kan variëren met veel chemicaliën. 2) De oplossing is geel bij pH 10,0. 3) Kook tot het kleurloos wordt. 4) Koel af tot RT. 5) Pas de pH opnieuw aan tot 10,0 en herhaal stappen 3-4 tot de oplossing kleurloos blijft en stabiliseert bij 10,0. Bewaar de geactiveerde natriumorthovanadate aliquoten bij -20 °C.
p-nitrofenylfosfaat dinatriumzout hexahydraatSigma-AldrichP1585
Beta-glycerofosfaatSigma-AldrichG6376 
Bio-Rad Protein Assay Reagent Bio-Rad500-0006 Cytotoxisch
Acrylamide/Bis-acrylamide (37,5 : 1) 40%BioshopACR005 Cytotoxisch
Tris-basisBioshopDEO701
Zoutzuur (HCl)LabChemLC15320-4 Werk onder afzuigpunt. Giftig en irriterend.
Natriumdodecylsulfaat (SDS)BioshopSDS001.1 Iriterend.
AmoniumpersulfaatSigma-AldrichA3678
TEMEDInvitrogen15524-010Giftig en irriterend.
BroomfenolblauwFisher ScientificB392-5
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250Werk onder afzuigpunt. Giftig voor het zenuwstelsel, slijmvliezen. Kan giftig zijn voor de bovenste luchtwegen, ogen, centraal zenuwstelsel.
GlycineBioshopGLN001.5
NatriumdeoxycholaatSigma-AldrichD6750
Natriumhydroxide (NaOH)BioshopSHY700 Iriterend.
Nitrocellulosemembraan (0,45 mm)Bio-Rad162-0115
Azijnzuur glaciaalBioshopACE222.4Werk onder afzuigpunt. Giftig, irriterend en ontvlambaar.
Red ponceauSigma-AldrichP3504  
Kaliumchloride (KCl)Sigma-AldrichP3911 Voor PBS-samenstelling voor immunoblot.
Na2HPO4BioshopSPD307.5Voor PBS-samenstelling voor immunoblot.
KH2PO4Sigma-AldrichP0662 Voor PBS-samenstelling voor immunoblot.
RundserumalbumineSigma-AldrichA7906Voor PBS-T-BSA samenstelling voor immunoblot.
Vrij van vet melkpoederCarnation
Polysorbaat 20 (Tween)MP Biomedicals103168Snij de extremiteit van de punt af en pipet langzaam omdat het erg dik is.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-America18783Bewaar gealiquoteerd bij -20 oC. Beperk vries-/ontdooicycli.
Anti-IRF-3-P-Ser396Thuis gemaakt19Bewaar gealiquoteerd bij -80 oC. Beperk vries-/ontdooicycli.
Phosfo-IRF-3 (Ser396) (4D4G)Cell Signaling Technology4947sBewaar bij -20 oC.
Anti-IRF-3-P-Ser398Thuis gemaakt15Bewaar gealiquoteerd bij -80 oC. Beperk vries-/ontdooicycli.
Anti-IRF-3-volledige lengteActif motif39033Bewaar gealiquoteerd bij -80 oC. Beperk vries-/ontdooicycli.
Anti-IRF3-NESIBL-America18781Bewaar gealiquoteerd bij -20 oC.
Western Lightning Chemiluminescence Reagent PlusPerkin-Elmer Life SciencesNEL104001EA
LAS4000mini CCD-camera-apparaatGE healthcare
SDS-PAGE moleculaire gewichtsstandaard, breed bereikBio-Rad161-0317Bewaar gealiquoteerd bij -20 oC.

Referenties

  1. Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
  2. Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
  3. Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
  4. Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
  5. Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
  6. Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
  7. Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
  8. Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
  9. Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  10. Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
  11. Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
  12. Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
  13. Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
  14. Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
  15. Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
  16. Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).
  17. Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
  18. Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
  19. Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
  20. Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
  21. Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
  22. Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
  23. McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
  24. Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).
  25. Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  28. tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
  29. Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
  30. Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

IRF3 activatiefosforyleringsanalyseSDS PAGENative PAGEimmunoblotSendai viruscellysaatfosfospecifieke antilichamenniet denaturerende elektroforesehoge resolutiegel
Een hoge resolutie methode om Fosforylatie-afhankelijke activering van IRF3 Monitor
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.