Hier beschrijven we een procedure die een gedetailleerde analyse mogelijk maakt van de fosforyleringsafhankelijke activering van de IRF3-transcriptiefactor. Dit wordt bereikt door de combinatie van een hoge resolutie SDS-PAGE en een native-PAGE gekoppeld aan immunoblots met behulp van meerdere fosfospecifieke antilichamen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een hoge resolutie methode om Fosforylatie-afhankelijke activering van IRF3 Monitor
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De IRF3-transcriptiefactor is cruciaal voor de eerste lijn van verdediging tegen pathogenen, voornamelijk door interferon β en antivirale genexpressie. Een gedetailleerde analyse van IRF3-activering is essentieel om te begrijpen hoe pathogenen de aangeboren antivirale respons induceren of ontwijken. Verschillende geactiveerde vormen van IRF3 kunnen worden onderscheiden op basis van hun fosforylering en monomeer vs dimeer status. In vivo onderscheid tussen de verschillende geactiveerde soorten van IRF3 kan worden bereikt door de scheiding van gefosforyleerde IRF3-vormen op basis van hun mobiliteitsverschuivingen op SDS-PAGE. Bovendien kunnen de niveaus van IRF3-monomeer en -dimer worden gecontroleerd met behulp van niet-denaturerende elektroforese. Hier beschrijven we een procedure om de hoogste resolutie te bereiken om de meeste informatie te verkrijgen over de activeringsstatus van IRF3. Dit wordt bereikt door de combinatie van een hoge resolutie SDS-PAGE en een native-PAGE gekoppeld aan immunoblots met behulp van meerdere totale en fosfospecifieke antilichamen. Deze experimentele strategie vormt een betaalbare en gevoelige aanpak om alle nodige informatie te verzamelen voor een volledige analyse van de fosforyleringsgemedieerde activering van IRF3.
Inleiding
De alomtegenwoordig en constitutief uitgedrukt transcriptiefactor Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) is van cruciaal belang voor de eerste verdedigingslinie tegen pathogenen voornamelijk door de inductie van IFNβ, maar ook door de inductie van de chemokine (CC-motief) ligand 5 (CCL5 ) en verscheidene antivirale eiwitten zoals IFN geïnduceerde eiwitten met tetratricopeptide herhaalt IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 activering werd gemeld na infectie met verschillende virussen, of blootstelling aan polyinosinic-polycytidylic acid (poly I: C) of lipopolysaccharide (LPS) 4. Belangrijker is, hebben de meeste bestudeerde virussen mechanismen ontwi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Het protocol wordt hier beschreven met behulp van A549 cellen geïnfecteerd met Sendai-virus (SeV). Echter, het protocol voor SDS-PAGE en inheemse PAGE werkt ook met alle menselijke en muizen celtypen dusver getest, met name myeloïde cellen gestimuleerd met diverse IRF3 activerende stimuli 9,15,19,24,25.
1. Infectie van A549 Cells
- Handhaaf A549 cellen in kweek in een 15 cm plaat bij 37 ° C / 5% CO 2 in 20 ml F12K / Ham medium dat 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HI-FBS) en 1% L-glutamine (compleet F12K / Ham gemiddeld).
OPMERKING: Alle gebruikt voor celkweek en behandelingen op....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een typisch beeld van immunoblot IRF3 gedetecteerd met IRF3 totale antilichamen en IRF3-fosfospecifiek antilichamen tegen Ser396 en Ser398 na resolutie van WCE door een hoge-resolutie SDS-PAGE Figuur 2 toont. In ongestimuleerde A549 cellen, wordt IRF3 gedetecteerd als twee banden op 50 en 53 kDa op SDS-PAGE die overeenkomen met de niet-gefosforyleerd (vorm I) en de gehypofosforyleerde (vorm II) soorten IRF3. Blootstelling van A549 cellen SEV voor 3-9 uur resulteert in ee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol beschrijven we hier bestaat uit een combinatie van hoge-resolutie SDS-PAGE en natieve PAGE gekoppeld aan het gebruik van verschillende fosfospecifiek antilichamen tegen het monomeer / dimeer en phosphoforms I-IV van IRF3 onderscheiden. Geschikte detectie van deze IRF3 soort is essentieel om volledig te karakteriseren IRF3 activering in een specifieke instelling. Bijvoorbeeld, LPS stimulatie van geactiveerde macrofagen leidt tot de vorming van dimere, Ser396 / 398 gefosforyleerd IRF3 een gehypofosforyleerde .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de voormalige en huidige leden van het laboratorium voor de ontwikkeling van de protocollen. Het werk werd ondersteund door financiering van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [subsidie # MOP-130527] en van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is ontvanger van een Tier II Canada Research Chair. AR heeft een beurs van het opleidingsprogramma van het Respiratory Health Research Network van de Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Verwarm in een 37 °C bad voor gebruik. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Voor celcultuur. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Snij de extremiteit van de punt af en pipet langzaam omdat het erg dik is. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Geregistreerd handelsmerk dat overeenkomt met Octylfenoxy poly(ethyleenoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activering van natriumorthovanadate 0,2 M: 1) Pas de pH aan tot 10,0 met behulp van 1 N NaOH of 1 N HCl. De start-pH van de natriumorthovanadate-oplossing kan variëren met veel chemicaliën. 2) De oplossing is geel bij pH 10,0. 3) Kook tot het kleurloos wordt. 4) Koel af tot RT. 5) Pas de pH opnieuw aan tot 10,0 en herhaal stappen 3-4 tot de oplossing kleurloos blijft en stabiliseert bij 10,0. Bewaar de geactiveerde natriumorthovanadate aliquoten bij -20 °C. |
| p-nitrofenylfosfaat dinatriumzout hexahydraat | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-glycerofosfaat | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxisch |
| Acrylamide/Bis-acrylamide (37,5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxisch |
| Tris-basis | Bioshop | DEO701 | |
| Zoutzuur (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Werk onder afzuigpunt. Giftig en irriterend. |
| Natriumdodecylsulfaat (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Iriterend. |
| Amoniumpersulfaat | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Giftig en irriterend. |
| Broomfenolblauw | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Werk onder afzuigpunt. Giftig voor het zenuwstelsel, slijmvliezen. Kan giftig zijn voor de bovenste luchtwegen, ogen, centraal zenuwstelsel. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Natriumdeoxycholaat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Natriumhydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Iriterend. |
| Nitrocellulosemembraan (0,45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Azijnzuur glaciaal | Bioshop | ACE222.4 | Werk onder afzuigpunt. Giftig, irriterend en ontvlambaar. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Kaliumchloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | Voor PBS-samenstelling voor immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | Voor PBS-samenstelling voor immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Voor PBS-samenstelling voor immunoblot. |
| Rundserumalbumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Voor PBS-T-BSA samenstelling voor immunoblot. |
| Vrij van vet melkpoeder | Carnation | ||
| Polysorbaat 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Snij de extremiteit van de punt af en pipet langzaam omdat het erg dik is. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Bewaar gealiquoteerd bij -20 oC. Beperk vries-/ontdooicycli. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Thuis gemaakt19 | Bewaar gealiquoteerd bij -80 oC. Beperk vries-/ontdooicycli. | |
| Phosfo-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Bewaar bij -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Thuis gemaakt15 | Bewaar gealiquoteerd bij -80 oC. Beperk vries-/ontdooicycli. | |
| Anti-IRF-3-volledige lengte | Actif motif | 39033 | Bewaar gealiquoteerd bij -80 oC. Beperk vries-/ontdooicycli. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Bewaar gealiquoteerd bij -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD-camera-apparaat | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE moleculaire gewichtsstandaard, breed bereik | Bio-Rad | 161-0317 | Bewaar gealiquoteerd bij -20 oC. |
Referenties
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
