Een Pressure Injection systeem voor het onderzoeken van de Neurofarmacologie van Information Processing in Awake Behaving makaak Monkey Cortex

Samenvatting

Hier tonen we de drukinjectie van neurofarmacologische substanties tijdens opname van enkele cellen bij een wakkere, zich gedragende makaak. Deze procedure maakt farmacologische manipulatie mogelijk in de directe omgeving van een corticale opnameplaats.

Samenvatting

De top-down modulatie van feed-forward corticale informatieverwerking is functioneel belangrijk voor veel cognitieve processen, inclusief de modulatie van sensorische informatieverwerking door aandacht. Er is echter weinig bekend over welke neurotransmittersystemen betrokken zijn bij dergelijke modulaties. Een praktische manier om deze vraag aan te pakken is om single-cel opname te combineren met lokale en tijdelijke neurofarmacologische manipulatie in een geschikt diermodel. Hier demonstreren we een techniek die acute single-cel opnamen combineert met de injectie van neurofarmacologische agentia in de directe omgeving van de opname-elektrode. De video toont de voorbereiding van het drukinjectie/opnamesysteem, inclusief de voorbereiding van de te injecteren substantie. We tonen een rhesusaap die een visuele aandachtstaak uitvoert en de procedure van single-eenheid opname met blok-gewijze farmacologische manipulaties.

Inleiding

In corticale en subcorticale gebieden wordt neuronale activiteit beïnvloed door verschillende neuromodulatoren, bijvoorbeeld acetylcholine¹. Deze modulerende effecten op neuronale reacties zijn gemeld in in vitro studies², evenals in elektrofysiologische opnames van verdovde dieren³ en systemische farmacologische manipulaties bij mensen⁴. Niettemin is de exacte rol van verschillende neuromodulatoren en de betrokkenheid van verschillende receptorsubtypes grotendeels onbekend. Om de effecten van specifieke neuromodulatoren op de activiteit van enkele neuronen te meten, is het wenselijk om een tijdelijke verandering van neuromodulator zo dicht mogelijk bij de opname-elektrode te induceren. Bovendien is het belangrijk dat deze manipulaties worden uitgevoerd bij wakkere dieren, omdat cognitieve functies alleen aanwezig zijn bij afwezigheid van anesthesie. Bovendien werkt anesthesie samen met cholinerge en GABAerge systemen^5,6 en kan het leiden tot veranderingen in neurale activiteit³.

In de afgelopen decennia zijn twee belangrijke methoden voor lokale medicijntoediening ontwikkeld en verfijnd: iontoforese en drukinjectie. Bij beide methoden worden geneesmiddelen afgegeven via micropipetten gemaakt van glas of staal. Bij iontoforese regelt een elektrische stroom de afgifte van het medicijn⁷. Bovendien is er een significante bijdrage van elektro-osmose aan de totale hoeveelheid uitgeworpen moleculen⁸, in correlatie met de tipdiameter⁹ van de micropijp en de concentratie⁸ van de gebruikte stof. Iontoforese is een krachtig hulpmiddel om snel en nauwkeurig kleine volumes van zenuwweefsel te manipuleren. Voor iontoforetische injecties worden meestal micropipetten met meerdere vaten gebruikt¹⁰, waarbij één als opnameapparaat dient en de andere posities als afgiftepijp. Een beperking van deze methode is dat alleen geladen moleculen kunnen worden gebruikt, wat de selectie van geneesmiddelen ernstig beperkt.

Drukinjectie maakt gebruik van luchtcompressie of mechanische druk om een stof uit een micropijp te werpen. Met deze methode kan elke oplosbare stof, geladen of ongeladen, worden gebruikt, inclusief grote moleculen. De methode van drukinjectie werd voor het eerst beschreven door Reyniers in 1933 en verder verfijnd in de jaren 1950 (zie Lalley¹¹ voor een overzicht). In de jaren 1980 werd de methode verder verfijnd om leveringen in het nanoliterbereik (voornamelijk lidocaïne¹²) naar een gedefinieerd hersengebied te kunnen uitvoeren¹³, terwijl tegelijkertijd opname van één cel werd uitgevoerd. Het uitgeworpen volume werd meestal gemonitord door het bewegen van een marker te observeren, zoals de meniscus in het bovenste deel van de pijp¹³. Drukinjectie werd voor het eerst in de jaren 1990 gebruikt bij wakkere dieren, zowel extracellulair¹⁴ als intracellulair^15,16. Op basis van de cumulatieve expertise die in deze studies is opgedaan, is het nu mogelijk om betrouwbaar opname uit verschillende hersengebieden te maken in combinatie met farmacologische manipulatie (zie¹⁷ voor een vergelijking van recente drukinjectiesystemen).

Een blijvend probleem voor beide medicijntoedieningsmethoden is de moeilijkheid om het precieze geïnjecteerde volume te bepalen. Dit is een nog grotere uitdaging voor experimenten met wakkere, gedragende resusaapjes waarbij het dier de experimentele taak uitvoert in een aparte kamer. Dit kan worden verlicht door gebruik te maken van een softwaregestuurd systeem in plaats van te vertrouwen op een visuele marker om een injectie continu te monitoren.

Het hier beschreven systeem is een uitbreiding van een goed gevestigd elektrofysiologisch opnamesysteem (Mini Matrix System) en combineert een injectiepijp met meerdere evenwijs georiënteerde opname-elektroden op gedefinieerde afstanden in een aanpasbare opstelling. Farmacologische manipulatie van het weefsel nabij de opname-elektrode is mogelijk met behulp van slechts een kleine hoeveelheid substantie, wat een snelle herstel mogelijk maakt en meerdere blokken injectie en controle/herstel binnen de beperkte tijdsvenster die wordt geboden door de gedragstaak van het dier.

Protocol

Dierenverzorging en alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving met betrekking tot de verzorging van dieren en door het district regering van Braunschweig, Nedersaksen, Duitsland goedgekeurd.

Opmerking: Als het experiment wordt uitgevoerd in vivo, is het cruciaal om de hoogst mogelijke hygiëne te handhaven. Waar mogelijk werken onder steriele omstandigheden.

1. Voorbereiding van de Injectie / Recording System

1. Steriliseer de buis die de micropipet verbindt met de spuit. Gebruik de kortste lengte van de buis mogelijk in de experimentele set-up tussen de injectiepomp en elektrofysiologische opname systeem.
2. Reinig de geleidingsbuizen van de opname-systeem met behulp van reiniging draden. Dompel ze in steriele siliconenolie en voeden hen door de afzonderlijke geleidebuizen meerdere malen.
3. Steek het kwartsglas micropipet in een geleidingsbuis van het opnamesysteem. Zie figuur 1A.
4. Na vaststelling van de micropipet inhet opnamesysteem, bevestig de steriele buis naar de metalen pin van de micropipet. Wees voorzichtig; hoewel de micropipet in het systeem wordt vastgesteld kan gemakkelijk breken bij het bevestigen van de buis. Gebruik twee steriel pincet om gelijke druk uit te oefenen op de pin en de buis.
5. Vloeibare super lijm op de kruising tussen de buis en micropipet af te dichten. Wacht tenminste 3 uur voor de lijm uitharden alvorens het vullen van de micropipet met vloeistof.
6. Invoegen micro-elektroden (bijvoorbeeld kwarts glas geïsoleerde platina wolfram) in andere standen van het opnamesysteem voor of na het inbrengen micropipet.

2. De voorbereiding van de chemische stof

1. Steriliseren 1,5 ml microcentrifugebuizen voor latere opslag van injectieoplossingen gebruik van een autoclaaf of andere betrouwbare procedure.
2. Weeg de bijbehorende stof scopolamine hydrochloride tot 5 ml van een 0,1 molaire oplossing te bereiden. Oplossen in steriele zoutoplossing (0,9% NaCl).
3. Onder steriele omstandigheden ina zuurkast, filteren de oplossing met behulp van een injectiespuit filter met een voldoende grote poriën diameter, bijvoorbeeld 0,2 urn.
4. Onder de zuurkast aliquot de oplossing in hoeveelheden voldoende voor een enkel experiment, bijvoorbeeld voor scopolamine, 500 pl in steriele 1,5 ml microcentrifugebuis. Gebruik donkere buisjes om de stof te beschermen tegen het licht; als alternatief, wikkel tubes in aluminiumfolie. Voor scopolamine Bewaar de oplossing tot 14 dagen bij 4 ° C.

3. Dagelijks Voorbereiding van de Injectie / Recording System

Opmerking: Bij montage in het opnamesysteem, worden de elektroden en micropipet opgeslagen in een enzymoplossing (Tergazyme, 1% oplossing met gedeïoniseerd water) tussen opnames. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd voor elke opname.

1. Verzamel een buis van de te injecteren substantie. Laat het RT bereiken als gekoeld.
2. Verwijder de injectie / opnamesysteem van de enzymoplossing en spoel elektrodenen micropipet met gedeïoniseerd water om volledig schoon enzymoplossing.
3. Verwijder de voorkant van het opnamesysteem om visueel te controleren de afdichting tussen micropipet en de buis.
4. Toepassen steriele siliconenolie aan de geleidebuis spleet (zie figuur 1A) en de uiteinden van de elektroden en micropipet om het systeem te smeren voor soepele bewegingen.
5. Controleer tips van de elektroden en micropipet met behulp van een microscoop te zorgen dat ze intact zijn. Lijn de elektroden en de micropipet onder de microscoop, zodat ze uit de geleidebuizen uitbreiden dezelfde lengte. Drijf ze in de geleidingsbuizen, zodra zij niet meer toegankelijk te stoppen. Hieronder wordt verstaan ​​elektrodepositie nul. Stel de diepte van de elektroden en micropipet aan 0 in de software.
6. Vul een steriele spuit met een steriele zoutoplossing en steek de naald in de buis, het verzorgen van de wand van de buis niet te doorboren. Rij de micropipet uit de geleidebuis voor visual controle van de stof flow.
7. Spoelen tenminste 2 ml steriele zoutoplossing door de buis en micropipet geen lucht waarborgen in de spuit of in de buis. Niet te veel druk niet op de zuiger van de spuit. Zorg ervoor dat de verbinding tussen buis en micropipet is verzegeld. Als lekkage zichtbaar is, re-lijm de splitsing (zie stap 1.5) en de opname uit te stellen.
8. Vul een nieuwe steriele spuit met de oplossing te injecteren en uitwisseling met de loop van de zoutoplossingspuit, dat wil zeggen, houdt de naald van de spuit met zoutoplossing in de buis. Zorg ervoor dat er geen lucht wordt overgedragen in het systeem. Dit wordt het best bereikt door het vullen van de naaldnaaf met zoutoplossing na verwijdering van de zoutoplossing gevulde vat.
9. Spoel het systeem met 250 ul van de oplossing te injecteren, om de zoutoplossing uit de buis te verwijderen.
10. Met de motor besturingssoftware intrekken elektroden en micropipet in de guidetubesto een diepte van ten minste -500 urn.
11. Laat de geleidebuis ring (Figuur 1A) naar de bodem van de geleidingsbuizen hun vaste relatieve positie te handhaven.
12. Reinig de basis van het systeem met ethanol, in het bijzonder wanneer de aap opname kamer zal raken.
13. Sluit het opnamesysteem door het vervangen van de voorklep en de schroeven.

4. Validatie van het injectiesysteem

Let op: Hoewel het bedrijf kalibreert het systeem, is het raadzaam om de uitgeworpen volumes met de gebruikte in de experimentele set-up (buizen, spuiten enz.) Materialen te valideren.

1. Bereid het systeem zoals beschreven in stap 3, waarbij elektroden en micropipet uitgebreid uit de geleiding buizen. Een diepte van tenminste 7000 urn wordt geadviseerd om verlies van meetvolume voorkomen door hechting langs het buitenoppervlak van de micropipet en de elektroden.
2. Plaats het opnamesysteem op de plaats zal worden gebruikt tijdens het experiment en zet de syringe in de micro-injectie pomp. Bevestig de spuit op zijn plaats met behulp van de rubberen band en verstelbare grip (zie figuur 1A). Schuif het beweegbare deel van de pomp totdat deze stevig op zijn plaats achter de zuiger van de spuit.
3. Met behulp van de software-gestuurde motor-eenheid, werpen een volume groot genoeg is om nauwkeurig te meten, bijv., 1000 nl. Het verdient de voorkeur een enkele stap om het totale volume te werpen om de effecten van capillaire werking langs de micropipet oppervlak voorkomen. Zeer lage snelheden (1 nl / s) kan ook leiden tot dit effect tijdens de validatieprocedure.
4. Verzamel het totale volume in een bak onder de micropipet geplaatst, of zorgvuldig direct verzamelen van de uitgeworpen daling van de punt van de micropipet. Schat de uitgeworpen volume met behulp van een pipet of door weging, met een precisieweegschaal.
5. Herhaal deze procedure een paar keer om metingen te bevestigen.

5. Acute Recordings

1. Stel de xy positievan het opnamesysteem. Dit bepaalt het punt waarop de geleidebuizen bereikt de dura mater binnen de chronisch geïmplanteerde opname kamer. Zorg ervoor dat de gids buizen zijn volledig ingeschoven (geleidebuis z stand 0).
2. Breng het opnamesysteem in positie en plaats de spuit in de micro-injectie pomp. Bevestig de spuit op zijn plaats met behulp van de rubberen band en verstelbare grip (zie figuur 1A). Schuif het beweegbare deel van de pomp totdat deze stevig op zijn plaats achter de zuiger van de spuit. Als een druppel stof zichtbaar aan het uiteinde van de geleidingsbuizen voorzichtig verwijderen met een steriel wattenstaafje.
3. Bereid het dier voor het opnemen volgens de procedure van het laboratorium (zie ¹⁸ bijvoorbeeld richtlijnen).
4. Te monteren de opname-systeem op de opname kamer van de aap.
5. Langzaam handmatig de geleidebuizen laten zakken in de opname kamer tot de dura wordt bereikt, dan rijden de elektroden met behulp van de motor control software.
6. Aangezien het niet mogelijk is de impedantie van de micropipet meten rijden eerst met elektroden en controleren hun impedanties regelmatig op verschillende diepten. Na penetratie van de dura met succes wordt uitgevoerd zonder beschadiging van de elektroden vooraf de micropipet.
7. Rij de elektroden en de micropipet de doelelektrode diepte waarop het hersengebied plaats wordt verwacht worden. vooraf langzaam de elektrode totdat deze dicht genoeg bij de activiteit van een eenheid op te nemen, zoals blijkt uit een goede signaal-ruisverhouding in het opgenomen signaal. Belangrijker plaats de registratie-elektrode en de micropipet op dezelfde diepte om de minimale afstand tussen elektrode en micropipet waarborgen.
   1. Indien mogelijk, houdt de elektroden en micropipet op deze diepte voor de gehele opname. Indien de enige manier om de signaalkwaliteit van de geregistreerde-cel is met de elektroden bewegen, dan rijdt de elektroden en de micropipettegelijkertijd de afstand tussen hen te handhaven.

6. Ruimtelijke Aandacht Task

1. In een reeks proeven onderhavige twee bewegende puntpatronen op het scherm, een gepositioneerd in het receptieve veld van de opgenomen neuron en andere daarbuiten, alsmede een centraal gepresenteerde bevestigingspunt dat het dier moet foveate in elk proces ^{19, 20.}
   Opmerking: De aap is getraind om te reageren op een verandering van richting in de cued dot patroon (het doel event), terwijl het negeren van elke richting overgaand in de andere dot patroon, en wordt beloond met een druppel vloeistof voor elke succesvolle afronding van een proef ^{19, 20.} Als een zintuiglijke controle conditie, de aap heeft een luminantie verandering van de fixatie te melden terwijl het negeren van zowel bewegende stip patronen (zie figuur 2 voor een meer gedetailleerde beschrijving van de taak).

7. Farmacologische Manipulatie tijdens het opnemen

Let op: Terwijl de aap is het uitvoeren van de taak, injecteer de stof in een bloksgewijs manier. Drie opeenvolgende blokken gedefinieerd: controle, die fungeert als basis; injectie, waarbij een stof wordt uitgestoten; en herstel, waarbij de cellen waarop het injectie terugkeer naar de basislijn.

1. Tijdens een injectieblok injecteren een vooraf bepaalde hoeveelheid van de stof regelmatig bv., 2 nl elke minuut met een snelheid van 2 nl / s. Voor dit voorbeeld gebruiken scopolamine hydrochloride. Het injectieproces wordt via software die verscheidene opties biedt. Gebruik bijvoorbeeld de stap functie aan de injectie volume te definiëren, en druk op de knop injectie elke minuut op basis van de klok van de opname software.
   Opmerking: De exacte duur van de injectieblok substantie en experiment afhankelijk, bijvoorbeeld voor gebruik scopolamine 2 nl injecties per minuut gedurende 10 min (20 nl in totaal).. Het verdient de voorkeur de elektroden en micropipet duri niet om door te gaanng van de injectie blok.
2. Noteer de tijd en het proces waarin de stof wordt geïnjecteerd, de diepte van de elektroden en micropipet, en de hoeveelheid uitgestoten stof.
3. Volg de injectieblok een herstel blok, waarin geen substantie geïnjecteerd. De duur van het herstel blok stof specifiek en moet worden gedefinieerd in de pre-testen. Bewaken en de opnamekwaliteit van de geselecteerde afzonderlijke eenheden handhaven tot het einde van de herstelperiode blok.
4. Herhaal de drie blokken voor zo lang als de opname kwaliteit en motivatie van de aap mogelijk te maken.

8. Bericht Opname Procedures

1. Na de registratie van de gegevens, in te trekken elektroden en micropipet in de geleiding buizen en vervolgens handmatig de geleidebuizen trekken. Verwijder de opname-systeem van de opname kamer van de aap. Maak de spuit uit de inspuitpomp en het systeem dragen aan de bereidingsruimte te reinigen.
2. Behandel het dier(inclusief reinigen van de opname kamer ¹⁸⁾ volgens de standaard procedures van het laboratorium en terug naar de behuizing faciliteit.
3. Spoel de buitenzijde van de geleidingsbuizen met waterstofperoxide (3%) en vervolgens met gedeïoniseerd water. Drive elektroden en micropipet uit de geleiding buizen, spoelen met waterstofperoxide en vervolgens gedemineraliseerd water.
4. Wisselen de cilinder van de spuit met een cilinder van een injectiespuit gevuld met steriele zoutoplossing, waarbij de naald in de buis. Spoel de buis en de micropipet met 1-2 ml zoutoplossing. Na het spoelen, verwijder dan het vat en vul deze met lucht. Plaats het vat in de naald en droog de buis en de micropipet van binnenuit diept lucht door.
5. Bewaar de geleidingsbuizen uitgebreid elektroden en micropipet ondergedompeld in de enzymoplossing om uitdroging te voorkomen en om de afbraak van organisch materiaal te waarborgen.

Resultaten

Figuur 2 geeft de ruimtelijke aandacht taak van de aap uitgevoerd terwijl het injectieproces werd uitgevoerd. De aap werd opgeleid bij te wonen om ofwel de prikkel gelegen binnen de receptieve veld van de opgenomen neuron (wonen-in), de prikkel zich buiten de receptieve veld (wonen-out) of de fixatie (wonen-fix). Deze omstandigheden maken een vergelijking van de neuronale activiteit in verschillende staten van aandacht.

Figuur 3 toont een peri-stimulus time histogram van een monster neuron in een experiment met scopolamine, een muscarinische cholinerge antagonist. De plot toont de respons onderdrukking tijdens scopolamine injectie versus geen injectie, wanneer een patroon bewegen in voorkeursrichting van de cel in receptieve veld het neuron wordt gepresenteerd en wordt bijgewoond door het dier. De eerste twee pieken vertegenwoordigt de neuron9; s reactie op de on- en offset van de ruimtelijke cue, dat verschijnt in de receptieve veld. Dit wordt gevolgd door de reactie op de bewegende patroon dat op het scherm 500 ms na aanvang cue. De grijs gearceerde gebied geeft de onderzochte periode wordt gebruikt om de gemiddelde vuursnelheid voor elke proef te berekenen. De groene omgeving benadrukt de onderdrukkende invloed van scopolamine injectie in de cel vuursnelheid. De donkergroene gebied toont de onderdrukking in de onderzochte periode.

Figuur 4A toont het effect van scopolamine op de gemiddelde verbrandingssnelheid van het monster neuron in elk van de drie voorwaarden van aandacht. De neuron verbrandingssnelheid voor de twee ruimtelijke aandachtcondities (aandacht binnen of buiten het receptieve veld van de opname neuron) en voor de sensorische aandoening (let op bevestigingspunt) daalde kort na de eerste injectie van de injectieblok (grijs gearceerd zijna) en tijdens het herstel blokkeren gestegen na een vertraging van het niveau van voor de injectie.

Figuur 4B een regelschema opneemt van een tweede monster neuron waarin zoutoplossing (0,9% NaCl) werd geïnjecteerd met hetzelfde protocol als voor de injectie scopolamine. Tijdens de injectieblok geen verandering in de neuron vuursnelheid waargenomen vergeleken met het besturingsblok.

Figuur 1. Set-up gebruikt voor farmacologische manipulatie tijdens het opnemen. (A) toont de micro-injectie pomp en de elektrofysiologische opname systeem uitgerust met elektroden en micropipet. De guidetube spleet, waarin siliconenolie wordt ingebracht om de elektroden en micropipet smeren getoond vergroot. (B) Geeft een voorbeeld micropipet (boven)en registratie-elektrode (hieronder). Voor grootte vergelijking, een eurocent (diameter: 16 mm). Daaronder is geplaatst Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Taak ontwerp tot ruimtelijke aandacht te begeleiden. Apen werden getraind om een beweging richting overgaand in de cued puntpatroon detecteren. De cue was ofwel geplaatst in receptieve veld van de neuron (wonen in), zoals getoond in de figuur, of daarbuiten (wonen-out). Als een zintuiglijke controle werd de aap getraind om een luminantie verandering van de fixatie op te sporen (wonen-fix). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

< img alt = "Figuur 3" src = "/ files / ftp_upload / 53724 / 53724fig3.jpg" />
Figuur 3. Invloed van antagonist scopolamine op vuursnelheid. De peri-stimulus time histogram voor een monster neuron getoond voor de attend in staat (aandacht in het receptieve veld van het neuron opgenomen) gedurende de injectieblok en tijdens het besturingsblok. De x-as toont de tijd in milliseconden na cue begin en de y-as de mate van verbranding in spikes / sec. Het grijze gebied geeft de onderzochte periode (300-800 ms na stimulus onset) gebruikt om het proces gemiddelde vuursnelheid te berekenen. De groene gearceerde gebied toont de onderdrukking in het afvuren tarief over de twee voorwaarden. De donkergroene kleur benadrukt de onderdrukking in de onderzochte periode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

iles / ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg "/>
Figuur 4. Effect van scopolamine en zout op vuursnelheid. (A) Antagonist scopolamine injectie. Het proces gemiddelde verbrandingssnelheid van de monstercel van figuur 3 in de loop van het experiment wordt de preferente stimulus voor alle drie attentional omstandigheden. De x-as geeft de proef start in minuten en de y-as geeft het apparaat vuursnelheid in spikes per seconden. Symbolen ( wonen-in, wonen-fix, wonen-out) vertegenwoordigen de neuron's afvuren tarief binnen de onderzochte periode in elk succes uitgevoerd proces, en horizontale lijnen (doorgetrokken lijn: wonen-in, stippellijn: wonen-fix, onderbroken lijn: wonen-out) tonen gemiddelde vuursnelheid voor de drie verschillende experimentele blocks (controle, injectie, herstel). De grijs gearceerde gebied geeft het injectieblok, vanaf de eerste injectie en eindigt 1 minuut na de laatste injectie. Tijdens de injectie blok 2 nL van 0,1 molair scopolamine werden geïnjecteerd elke minuut met een injectie snelheid van 2 nl / s. (B) Saline injectie. Het vuren van een cel in de loop van het controle-experiment wordt getoond de voorkeur stimulus voor alle drie attentional omstandigheden. Grijs gearceerde gebied visualiseert het blok van zout injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hier hebben we in detail hoe betrouwbaar en nauwkeurig injecties en hoogwaardige eencellige opnamen uitgevoerd met een "off-the-shelf" druk injectiesysteem. Hoewel deze wijze van geneesmiddelafgifte is eerder gebruikt gedragen apen (besproken in ^17), het hier gepresenteerde systeem heeft voordelen, hieronder besproken.

Zoals getoond in figuur 4A, kan het hier beschreven systeem stabiele meting van één neuron activiteit en zonder farmacologische injecties in de directe nabijheid van de opname site. Zoals getoond in figuur 4B, de injectie van een bestrijdingsmiddel, zoutoplossing, leidde niet tot een verandering van vuren. Deze controle blijkt dat het injectieproces zelf geen merkbare invloed hebben op de eigenschappen afvuren van de neuronen opgenomen.

De ruimtelijke configuratie van neuron, registratie-elektrode en micropipet van essentieel belang in deze experimenten. Hoewel een precieze meting van de relatieve posities in het weefsel tijdens het opnemen is niet mogelijk, kunnen we overwegen en controle voor mogelijke bronnen van variantie. Eerst, tijdens geïnjecteerde volume bestaat het risico dat de neuron plaats weg verplaatst kan worden van de registratie-elektrode, die de stabiliteit van de geregistreerde signalen. Om die reden is het verstandig om de vuursnelheid te vergelijken voor en na de injectie blok om het signaal stabiliteit te controleren. Ten tweede, de geleidingsbuis configuratie van het opnamesysteem definieert de afstand tussen elektroden en micropipet (bijv., 305 urn in de concentrische 3-kanaalsysteem gebruikt in dit experiment). Als het systeem zorgt voor een nauwkeurige positieregeling voor de diepte van de elektroden en micropipet in het weefsel, kan de afstand daartussen worden geminimaliseerd door zorgvuldig kalibreren relatieve diepte voor het opnemen (stap 3,5), en waardoor ze een gemeenschappelijke diepte tijdens opnames.

ent "> Mogelijke beperkingen
Naast interne kwaliteitscontrole door de fabrikant van het systeem moet worden bevestigd onder laboratoriumcondities, zoals verschillende merken van buizen, kunnen spuiten enz. Worden gebruikt en kan leiden tot verschillen in uitgeworpen volumes. Hoewel het systeem kan worden gebruikt om kleine volumes in het hier getoonde experiment injecteren, zijn onder de minimumhoeveelheid die kan worden bevestigd door praktische limieten meting in een normale laboratoriumomgeving. Echter kunnen grotere injectievolumes worden gebruikt om de relatie tussen de softwareradio volume en het volume van de hardware uitgeworpen afleiden. Als transparante buizen worden gebruikt, als extra visuele controle van het injectieproces is mogelijk door de verplaatsing van een visuele markering.

Plaatsen van de micropipet in het systeem is veeleisender dan elektrodeplaatsingsinstrument, als de diameter van de micropipet is iets groter en het materiaal is kwetsbaarder. Daarnaast,verbinden van de buis met de pin van de micropipet is een uitdaging omdat het een hoog risico van het breken van de bovenkant van de micropipet meebrengt. De levensduur van een succesvol geladen micropipet is enkele maanden, zelfs bij dagelijks gebruik.

In de praktijk hebben we nog niet gestuit op een blokkade in het inspuitsysteem tijdens post-opname reiniging van het systeem. Niettemin geen "online" check is mogelijk, en er is een risico dat een fysieke blokkade (zoals weefsel op de micropipet tip) stof injectie kunnen verhinderen. Het zou daarom wenselijk om de gegevens te analyseren conservatief, zoals dat het alleen die cellen meer onderzoek dat aanzienlijke veranderingen in bakken weer tussen controle en injectie blokken van het experiment tonen.

Ondanks hun kleine diameter, zal micro-elektroden en pipetten hersenweefsel verdringen en kunnen sommige lokale weefselbeschadiging veroorzaken. Dit kan worden geminimaliseerd door het handmatig positioneren van de punt van the geleidebuizen net boven de dura mater. De elektroden dringen dan de dura en de intactheid wordt afgeleid door online meten van hun impedanties. Daarna wordt de micropipet gestoken. Bij gebruik van deze benadering wordt regelmatige afvoer van weefsel boven de dura aanbevolen om het risico van elektrode of pipet breuk verder te verminderen.

Vergelijking met alternatieve methoden
Het systeem gebruikt hier laat zien duidelijke voordelen ten opzichte van andere druk inspuitsystemen. Een sterk voordeel is de diameter van de micropipet (ongeveer 100 um), die de helft kleiner dan andere beschikbare probes ¹⁷ en minimaliseert derhalve neurale weefselbeschadiging. In tegenstelling tot eerdere ontwerpen wendt het huidige systeem ruimtelijk gescheiden registratie-elektrode en micropipet. Hoewel andere systemen een kleinere afstand tussen elektrode en pipet, het hier beschreven systeem maakt onafhankelijke ingrijpende wijzigingen van de elektroden en pipet, waardoor Permin de sla variabele relatieve afstanden binnen een opnamesessie. Belangrijk, geen compromis met betrekking opnamekwaliteit moet worden gemaakt, als het injectiesysteem is een uitbreiding van een bestaande opnameapparaat. Terwijl slechts een micropipet en dus een stof wordt gebruikt in dit protocol, is het mogelijk om verschillende stoffen te injecteren in een experimentele procedure. Hiervoor kunnen meerdere micropipetten worden geschroefd in afzonderlijke geleidebuizen en verbonden spuiten aangebracht in afzonderlijke injectiepompen. Tenslotte besturen van het systeem eenvoudig, aangezien slechts een computerprogramma is nodig om de elektroden en micropipet bevorderen, en om tevens injectie voeren tijdens het experiment.

Vergeleken druk injectie iontoforese, er relatieve voordelen en nadelen. Bijvoorbeeld, druk injectie van grotere volumes worden ingebracht in het weefsel dan iontoforese, waardoor het risico van neuronale verplaatsing verhogen. De huidige protocol gebruikt volumes in NL range, en we zelden meegemaakt merkbare veranderingen in een opgenomen cel van de kwaliteit van het signaal. Het systeem maakt het ook mogelijk grotere hoeveelheden te injecteren, die potentieel bruikbaar zijn voor gedrags manipulaties maar kon beïnvloeden de stabiliteit van neuronale opname. Een duidelijk voordeel van druk injectie gedurende iontoforese is de grotere verscheidenheid van bruikbare stoffen er geen vereiste om geladen stoffen gebruiken. Er moet echter pH-waarden worden gecontroleerd en vergeleken tussen experimentele en controle stoffen (bv., Zoutoplossing).

De vraag zou kunnen ontstaan ​​waarom de reeds lang gevestigde methode van de druk injectie in plaats van nieuwere technieken te gebruiken, zoals optogenetics voor het manipuleren van neurale activiteit. Hoewel goed ingeburgerd in knaagdieren, optogenetics is nog niet betrouwbaar vastgesteld bij resusapen. In het bijzonder is het niet toelaat dat de lokale manipulatie van cellen selectief voor een bepaalde neurotransmitter type. Op de langere termijn zien wegroot potentieel voor de combinatie van de voordelen van farmacologische manipulaties met de voordelen van optogentic manipulaties in het ophelderen van de neurale basis van cognitieve functies.

Hier hebben we aangetoond hoe druk injectie kan worden gebruikt om een ​​lokaal beperkt gebied in de hersenen van wakker farmacologisch manipuleren, gedragen resusapen. Wij hopen dat deze methode inspireert andere wetenschappers om neuromodulatory bijdragen aan de dynamiek van de neuronale activiteit te onderzoeken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(-)-Scopolamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339,81 g/mol
NaCl 0,9%	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	enzymdetergenz
Hydrogen peroxide	Roth		Gebruikt in 3% oplossing met gedeïoniseerd water
Ethanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Gedeïoniseerd water
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Spuit en naald
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Kwartspijp micropipet	Thomas Recording
Opname-elektrode	Thomas Recording		kwarts/platina-wolfraamvezel elektrode; impedantiewaarde 1-2 MΩ  en 0,3-0,5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Grootte: 0,25 x 2,05 mm (Bd: 0,9mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Superlijm
Silicone olie	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761----------R	Spuitfilter
Multichannel Micro Injectie Systeem	Thomas Recording		multichannel microelektrode manipulator “System Eckhorn” uitgerust met microelektroden en micropipetten en een precisie multichannel micro-injectiepomp
McLab	op maat		interne lab software om de stimuluspresentatie te controleren