Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Samenvatting

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Samenvatting

Er is een groeiende wens in de biologische en klinische wetenschappen om meerdere klassen van biomoleculen te integreren en te correleren om biologie te ontrafelen, paden te definiëren, behandeling te verbeteren, ziekte te begrijpen en biomarkerontdekking te ondersteunen. N-gekoppelde glycosylering is een van de belangrijkste en robuuste post-translationele modificaties op eiwitten en reguleert kritieke celfuncties zoals signalering, adhesie en enzymatische functie. Analytische technieken om N-glycanen te zuiveren en te analyseren zijn de afgelopen tien jaar relatief statisch gebleven. Hoewel nauwkeurig en effectief, vereisen ze gewoonlijk aanzienlijke expertise en middelen. Hoewel enkele hoge-doorvoer zuiveringsschema's zijn ontwikkeld, hebben ze nog geen brede acceptatie gevonden en zijn vaak afhankelijk van de verrijking van glycopeptiden. Een veelbelovende methode, ontwikkeld door Thomas-Oates et al., filterondersteunde N-glycan-scheiding (FANGS), werd kwalitatief aangetoond op weefsels. Hierin hebben we FANGS aangepast aan plasma en gekoppeld aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met de glycanhydrazide-tags strategie om nauwkeurige relatieve kwantificering door vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en verbeterde elektrospray-ionisatie te bereiken. Verder hebben we nieuwe functionaliteit ontworpen in het protocol door tandem, shotgun-proteomics en glycosyleringsplaatsanalyse op kipplasma te bereiken. We toonden aan dat N-glycanen, gezuiverd op filter en gederivatiseerd door hydrofobe hydrazide-tags, vergelijkbaar waren in termen van abundantie en klasse met die door vastefase-extractie (SPE); de laatste wordt beschouwd als een gouden standaard in het veld. Belangrijk is dat de variabiliteit in de twee protocollen niet statistisch verschillend was. Proteomische gegevens die samen met glycomische gegevens werden verzameld, hadden dezelfde diepte vergeleken met een standaard trypsine-vertering. Peptideendeamidatie wordt geminimaliseerd in het protocol, waardoor niet-specifieke deamidatie die wordt gedetecteerd bij glycosyleringsmotieven wordt beperkt. Dit maakte directe glycosyleringsplaatsanalyse mogelijk, hoewel het protocol ook ¹⁸O-plaatslabeling kan accommoderen. Al met al hebben we een nieuw in-line, hoog-doorvoer, onbevooroordeeld, filtergebaseerd protocol voor kwantitatieve glycomics- en proteomicsanalyse gedemonstreerd.

Inleiding

Op het gebied van proteomica, filter geholpen monstervoorbereiding (FASP) is wijd op zijn vermogen om de hoeveelheid uitgangsmateriaal minimaliseren monstervoorbereiding artefacten te verminderen en te maximaliseren monsterdoorvoer ¹ aangenomen. Echter dergelijke werkwijze nog ontstaan ​​en grip te krijgen op het gebied van glycomics. Ontwikkeling van high-throughput, zijn kwantitatieve workflows nodig vanwege de integrale rol van glycosylering in biologische verdediging en de modulatie door kanker of ziekten ^2,3. Bij zoogdieren worden N-glycanen samengesteld uit zich herhalende saccharide eenheden (hexosen (Hex), hexosamines (HexNAc) siaalzuren (NeuAc) en fucoses (Fuc)), die een kernstructuur versieren (Hex ₃ HexNAc ₂₎ ⁴ covalent gebonden asparagine. Hoewel de glycospace aanzienlijk groot als isomeren worden geteld (> 10 ^12), is vrij klein op een samenstelling basis en molecuulgewichten gewoonlijk variëren van 1,000-8,000 Da ^{5 <}/ Sup>. De samenstelling homogeniteit van de klasse en de hydrofiliciteit van glycanen vormen unieke uitdagingen voor zuivering, scheiding en massaspectrometrie (MS) werkstromen ^6.

Traditioneel worden N-glycanen geknipt van eiwitten of peptiden met peptide N -glycosidase F (PNGase F) en vervolgens verrijkt door lectine-affiniteitschromatografie ^7, gefotografeerd door hydrazide kralen ⁸ of gezuiverd door vastefase-extractie (SPE) ^9,10. Hoewel deze methoden zijn zeer effectief, ze introduceren extra stappen voor ontzouting en beperken het aantal monsters tegelijkertijd verwerkt. In de afgelopen tien jaar hebben een aantal high-throughput platform voor glycomics voorgesteld. Kim et al. Publiceerde een semi-automatische methode waarbij een vacuümgestuurde, SPE 96-well plaat ^11. Als alternatief kan een methode affiniteit-filter (N -glyco-FASP) werd ontwikkeld door de Mann-groep, die de oorspronkelijke derivatisering van de fi vereistefilter met een samenstelling van ¹² lectinen. Tenslotte stelt het Thomas-Oates groep een semi-kwantitatieve methode, het filter Geholpen N-glycan Separation (HOEKTANDEN), waarbij de samenstelling smalle afmeting van de glycospace ¹³ benut. Zich baserend op moleculair gewicht cut-off filters, werden kleine verontreinigingen eerst gewassen te verliezen en daarna werden de N-glycanen verteerd en uitgewassen. Gedeglycosyleerde eiwitten blijven op de filter in dit protocol en kan worden onderworpen aan in-line FASP.

Identificatie en kwantificering van glycanen door electrospray ionisatie (ESI) MS vereist off-line scheidingen voor (gedeeltelijke) oplossing van isomeren en derivatisering voor detectie van lage-voorkomende soort. Etikettering in de individualiteit wanneer normaliseren met glycan hydrazide labels strategie verleent compatibiliteit met reverse-fase-vloeistofchromatografie (RPLC) ^14,15. Het 4-fenethyl-benzohydrazide (P2PGN) hydrofobe tag bemiddelt de hydrofiliciteit van de glycanen, enhancing ionisatie van gemiddeld vier keer ^16. Hoewel andere technieken, zoals permethylation ¹⁷ of amine-reactieve tagging chemie ^18, bieden soortgelijke voordelen, in het hydrazide reactie glycanen omgezet 1: 1 stoichiometrisch in gemakkelijke omstandigheden. Relatieve kwantificering bereikt door tandem analyse van monsters gederivatiseerd met natief (NAT) of ¹³ C ₆ stabiele isotooplabels (SIL).

De volgende methode evolueert HOEKTANDEN voor plasma-toepassingen en koppels naar de P2GPN hydrofobe tag voor nauwkeurige relatieve kwantificering. Bovendien werd ontworpen om jachtgeweer proteomics, deamidering profielen en kwantitatieve glycomics voeren op een enkele portie van het monster, zonder de integriteit van de analyses.

Protocol

1. Eiwit en glycoproteïne Denaturation en Alkylering

1. Voor standaard preparaten, belasting 2,5 ui van een 0,1 ug / ul oplossing van glycoproteïne (bijv Fetuin of RNase B) op een 30 kDa of 10 kDa moleculair gewicht (MW) cut-off filter.
   1. Voor biologische plasma monsters, controleer dan de eiwitconcentratie door een standaard Bradford ¹⁹ of bicinchoninezuur ²⁰ (BCA) proteïne test. Verdun het plasma, indien nodig, met 100 mM ammoniumbicarbonaat (NH ₄ HCO ₃₎ in _H2O (PNGase Digest Buffer) bij een pH van ~ 7 dat tussen 10-100 mg / ml totaal eiwit. Load 2,5 gl plasma (25-250 ug eiwit) op een filter.
      Opmerking: Dit protocol is alleen plasma van bloedmonsters verzameld in aanwezigheid van ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) getest.
2. Voeg 2 pl 1 M oplossing Dithiothreitol (DTT) aan elk monster in het filter.
3. Verdun het monster met 200 ul PNGase verteren buffer.
4. Cap het filter monsterbus en licht vortex, zorg dat u de filter van zijn plaats niet te verstoren. Incubeer het monster bij 56 ° C gedurende 30 minuten om de eiwitten te denatureren en glycoproteïnen.
5. Om de monsters te alkyleren, voeg 50 ul 1 M joodaceetamide, tot een uiteindelijke concentratie van ~ 200 mM, en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
   LET OP: Als proteomics analyse niet gewenst is, kan stap 1.5 worden overgeslagen.
6. Concentreer het gedenatureerde glycoproteïne op het filter door centrifugeren monsters bij 14.000 xg gedurende 40 min. Gooi doorstromen.

2. N-gebonden Glycan enzymatische afbraak

1. Was het monster met 100 ui buffer PNGase verteren. Concentreer het glycoproteïne op het filter bij 14.000 xg gedurende 20 min en gooi doorstromen.
   1. Herhaal het wassen en concentreren stap tweemaal voor een totaal van drie keer, waardoor een concentraat in het filter dode volume (~ 5 pl). gooi alledoorstromen.
   2. Teruggooi collectie flacon eenmaal wast zijn voltooid. Verzamel alle toekomstige elutiemiddelen en wast in een nieuwe collectie flacon.
      OPMERKING: PNGase verteren in buffer H ₂ ¹⁸ O tijdens het PNGase F vertering stap voor stabiele isotoop labeling van de geglycosyleerde asparagine-sites, die chemisch gedeamideerde aangestoken kunnen worden gebruikt.
2. Voeg 2 ul van glycerol-vrije PNGase F (x 75.000 eenheden / ml) te filteren na het overbrengen naar een nieuwe verzameling flesje. Voeg 98 gl buffer PNGase verteren, waardoor de totale volume op 100 pl, en voorzichtig pipet op en neer op het filter te mengen. Enzymatisch verteren de glycanen onder de voorwaarden in de stappen 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OR.
   OPMERKING: Drie werkwijzen voor de deglycosylatie van eiwitten kunnen worden gebruikt. Voor uitsluitend glycomics analyse (geen proteomics), wordt de lange incubatietijd in stap 2.2.1 aanbevolen. Voor glycomics en proteomics onderzoek, de stappen 2.2.2 en 2.2.3 zal een hoge kwaliteit peptiden met minimale niet-specifieke deamidering.
   1. Glycomics alleen digestie protocol (18hr) Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 18 uur enzymatisch splitsen alle N-glycanen.
   2. Spike-vertering protocol (SPI): Incubeer monsters bij 50 ° C gedurende 2 uur. Snel te werken, te verwijderen monsters en piek in een extra 2 ui glycerol-vrije PNGase F (x 75.000 eenheden / ml). Licht vortex de monsters gedurende 1-2 sec te mengen. Incubeer de monsters bij 50 ° C gedurende nog 2 uur.
   3. Microgolfontsluiting protocol (MD): Leg monsters in een microcentrifugebuis drijvend rek. Vlotter monsters in een 1 L beker gevuld met 1 liter gedeïoniseerd (DI) water. Plaats het bekerglas in het midden van een magnetron (950 W) met een roterende plaat. Magnetron op 60% vermogen (570 W) gedurende 5 min. Afkoelen verwijderen monsters houdt bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. magnetron vervolgens gedurende nog 5 min bij 60% vermogen.
      LET OP: Magnetron energie-instellingen zal moeten worden aangepast op basis van het maximale vermogen van de magnetron.Gemiddeld vermogen moet constant tussen de modellen worden gehouden.

3. Elutie van N-glycanen

1. Elueer glycanen door centrifugeren van het monster bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 20 ° C.
2. Voeg 100 ul PNGase verteren buffer om het filter en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 20 ° C. Collect wash bevattende resterende N-gebonden glycan in dezelfde verzameling flacon als elutiemiddel. Herhaal dit twee keer. Verwijder filter en plaats in de nieuwe collectie flacon.
3. Incubate glycan monsters in de -80 ° C vriezer tot bevroren (30-60 min). Droge voltooid, bij kamertemperatuur, onder vacuüm concentrator (4-6 uur).
   OPMERKING: N-glycanen kunnen worden bewaard bij -20 ° C tot zes maanden voor derivatisering.

4. Eiwit FASP Spijsvertering

LET OP: Als proteomics of deamidering siteanalyse niet gewenst is, kan deel 4 van het protocol worden overgeslagen.

1. Spoel tHij filter met het gedeamideerde peptiden met 400 gl 8 M ureum buffer. Cap de collectie flacon en licht vortex te mengen. Concentreren op de filter bij 14.000 xg gedurende 15 min. Gooi alle doorstroom.
   1. Herhaal stap 4.1 nog tweemaal voor een totaal van drie wassingen ureumbuffer.
2. Spoel de filter met het gedeamideerde peptiden met 400 gl 2 M ureum, 10 mM _CaCl2 buffer (trypsinedigest buffer). Cap de collectie flacon en licht vortex te mengen. Concentreren op de filter bij 14.000 xg gedurende 15 min. Gooi alle doorstroom.
   1. Herhaal stap 4.1 nog tweemaal voor een totaal van drie wassingen trypsinedigestie buffer.
   2. Teruggooi collectie flacon eenmaal wast zijn voltooid. Verzamel alle toekomstige elutiemiddelen en wast in een nieuwe collectie flacon.
3. Voeg 50 ul van varken gemodificeerd trypsine in een 1:50 of 1: 5 trypsine: eiwit (w / w) respectievelijk ratio voor ontdekking of kwantitatieve proteomics experimenten.Cap de collectie flacon en licht vortex te mengen.
4. Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 2 uur. Snel te werken, te verwijderen samples en piek in een extra 50 ul van trypsine aan de 1:50 of 1: 5 trypsine: eiwitverhouding. Licht vortex de monsters gedurende 1-2 sec te mengen. Incubeer de monsters bij 50 ° C gedurende nog 2 uur.
5. Elueer de peptiden door het draaien bij 14.000 xg gedurende 15 min.
6. Spoel de resterende peptiden van de filter met 400 ul 1% mierenzuur en 0,001% Zwittergent 3-16 (quench buffer). Elueer van de filter door het draaien bij 14.000 xg gedurende 15 min.
7. Kwantificeren van de peptide-concentratie in de monsters door Bradford ¹⁹ of BCA assay ^20.
8. Incubate peptide monsters in de -80 ° C vriezer tot bevroren (30-60 min). Droge voltooid, bij kamertemperatuur, onder vacuüm concentrator (4-6 uur).
   OPMERKING: Droge peptiden kunnen tot drie maanden worden bewaard bij -20 ° C.
9. Resuspendeer tryptische eiwitten net voorafgaand aan Liquid chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) analyse 2% acetonitril, 98% _H2O en 0,1% mierenzuur (mobiele fase A) tot de gewenste concentratie. Tryptische peptide concentraties van 2,5 pl plasma range 100-300 ng / ul.

5. Derivatisering van N-gebonden glycanen met Hydrofobe hydrazide Tags

1. Reconstitueren gedroogd zware (SIL) of licht (NAT) P2GPN reagentia in 1 ml 75:25 MeOH: azijnzuur (Derivatisering oplossing), om een ​​eindconcentratie van 0,25 mg / ml. Reagentia zal duren tot 10 minuten volledig oplosbaar. Uitvoerig vortex om volledige solubilisatie waarborgen.
   Opmerking: Bij deze derivatisering protocol wordt gebruikt met standaard N-glycanen, versus gezuiverd glycanen, de molaire verhouding van P2GPN: glycaan duurt ongeveer (en niet minder) dan 17 zijn: 1.
2. Tag gedroogd N-glycanen met 200 pi (50 ug) van SIL of NAT P2GPN reagens. Pipet op en neer om gedroogde glycanen mengen. vortex samples en dan spin down monsters voor ~ 5 sec op een bench-top centrifuge.
3. Reageren de glycanen met het reagens gedurende 3 uur bij 56 ° C.
4. Onmiddellijk naar glycanen uit de incubator het vacuüm concentrator. Droge voltooid bij 55 ° C (3-5 uur).
   OPMERKING: Deze stap lest de derivatisering reactie; het monster moet volledig droog kruisreactiviteit in de volgende stappen te voorkomen.
   OPMERKING: Droge, hebben monsters tot zes maanden worden bewaard bij -20 ° C.
5. Resuspendeer hebben N-glycanen in 25-50 pl _H2O vlak voor LC-MS analyse. Pipet op en neer om ervoor te zorgen N-glycanen zijn volledig oplosbaar gemaakt.
   Opmerking: Het volume voor resuspensie is afhankelijk van de uitgangsconcentratie van glycoproteïne die geschat kunnen worden uit de start eiwitconcentratie. Toch zal het bereik varieert per monster type en moet individueel worden geoptimaliseerd.
6. Centrifugeer monsters bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant, en let niet te laten de punt van de pipet raakt de bodem van de centrifugebuis.
   Opmerking: Overmatige tag mogelijk niet zichtbaar voor het oog, maar wordt verminderd door centrifugeren.
7. Combineer een paar NAT en SIL monsters desgewenst relatieve kwantificering, in een 1: 1 verhouding voor tandem analyse.

6. Ultra-hoge druk vloeistofchromatografie en massaspectrometrie Analyse

LET OP: De LC en MS beschreven voor een Easy nLC-1000 en een Q Exactive High Field voorwaarden, respectievelijk, werden geoptimaliseerd in-house voor proteomics analyse en voor de glycan analyse ^21. Deze voorwaarden kunnen worden aangepast aan andere ultra-hoge druk- of nano- LC systemen en andere elektrische massaspectrometers high-oplossing maar kunnen kleine wijzigingen vereisen. Het gebruik van te hoge resolutie massaspectrometrie is noodzakelijk glycan identificatie en deamidering analyse ^22,23.

OPMERKING: Stappen 6,1-6,3 kan zijn skipped wanneer de juiste omgekeerde fase chromatografie of hydrofiele interactie commerciële val en kolom worden gebruikt.

1. Synthetiseren een frit 100 uM ID capillair volgens Meiring et al. ²⁴ voor toepassing als een val.
2. Verpak de val onder druk met 2,6 uM, 100 A, C ₁₈ verpakkingsmateriaal en gesneden tot een lengte van 5 cm.
3. Pack een 75 uM ID emitter kolom onder druk met 2,6 uM, 100 A, C ₁₈ verpakkingsmateriaal en gesneden tot een lengte van 30 cm.
4. Bereid twee verschillende LC-MS methoden voor de proteomics (6.4.1) en glycomics (6.4.2) workflows.
   Opmerking: Eiwit en glycan monsters kunnen worden uitgevoerd op de zelfde opstelling val / column in willekeurige volgorde.
   1. Voor eiwitanalyse Injecteer ~ 400 ng eiwit op de kolom in mobiele fase A (MPA). Laat het monster bij 300 nl / min, volgens tabel 1, met 1 pi pre-kolomequilibratiebuffer (500 bar) en een 5 pl analytische kolomequilibratiebuffer(500 bar). Ioniseren eiwitten onder het MS omstandigheden in tabel 2.
   2. Voor glycan analyse Injecteer 5 ul geresuspendeerd, P2GPN hebben NAT / SIL equimolaire monsters op de kolom. Laat het monster bij 300 nl / min, volgens tabel 3, met 2 pi pre-kolomequilibratiebuffer (500 bar) en een 5 pl analytische kolomequilibratiebuffer (500 bar). Ioniseren glycanen onder de MS omstandigheden in tabel 4.

Tijd	% MPA	% MPB
0	100	0
5	98	2
105	80	20
135	68	32
136	5	95
151	5	95
152	100	0
167	100	0

Tabel 1. LC voorwaarden voor proteoomanalyse. Een gradiëntelutie met mobiele fase B (MPB, 98% acetonitril, 2% _H2O, 0,1% mierenzuur) werd uitgevoerd om peptiden jachtgeweer proteomics, data-afhankelijke acquisitie elueren MS experimenten.

MS 1 Parameters
Mass Range (Th)	375-1500
Resolutie	120.000
AGC	1 x 10 6
Max ionisatie Time	30
S-Lens FR Level	55
capillaire Temp (° C)	300
Spray Voltage	1.75
MS 2 Parameters
acquisitie Type	top20
Resolutie	15.000
AGC	1 x 10 5
Max ionisatie Time	30
ondervulling Ratio	2%
Isolatie Window (Th)	1.4
Laadtoestand Uitsluiting	1
Genormaliseerde Collision Energy	27
Uitsluiting Time (s)	20

Tabel 2: MS voorwaarden voor proteomics analyse van de parameters voor electrospray ionisatie, MS ¹ acquisitie, en MS ² acquisitie in een orbitrap instrument met hogere energie dissociatio.n (HCD) gegeven.

Tijd	% MPA	% MPB
0	95	5
1	70	30
41	60	40
46	37	63
47	10	90
55	10	90
56	95	5
66	95	5

Tabel 3:. LC condities voor glycaan analyse Gradient elutie werd uitgevoerd elueerde hydrazide hebben N-glycanen voor MS analyse.

MS 1 Parameters
Mass Range (Th)	600-1900
Resolutie	60.000
AGC	5 x 10 5
Max ionisatie Time	64
S-Lens FR Level	65
Capillaire Temp (° C)	325
Spray Voltage	1.75
MS 2 Parameters
acquisitie Type	top12
Resolutie	15.000
AGC	5 x 10 4
Max ionisatie Time	100
ondervulling Ratio	1%
Isolatie Window (Th)	1.4
Vaste Eerste Mass	125
Stapte Genormaliseerde Collision Energy	10/20/30
Uitsluiting Time (sec)	15

Tabel 4: MS voorwaarden voor hydrazide tag N-glycan analyse van de parameters voor electrospray ionisatie, MS ¹ acquisitie, en MS ² acquisitie in een orbitrap instrument met een hogere energie-dissociatie (HCD) worden gegeven..

7. Proteomics en Deamidatie Analyse

1. Identificeer eiwitten / peptiden met behulp van standaard bioinformatica zoekfuncties.
   Opmerking: De volgende analyse protocol werd ontworpen met behulp van de Swiss-Prot / Trembl databases in UniprotKB en zoeken via SEQUEST in de Proteome Discoverer 1.4 software, maar het protocol kan direct worden vertaald naar een eiwit search engine en scoren met behulp van een GUI-software. Alle opdrachten hieronder weergegeven kunnen worden geraadpleegd in de software-interfaces door middel van drop-down menu's.
   1. maken of downloaden van een organisme geschikte eiwitsequentie database genomische data of ter beschikking proteoom databases zoals beschreven door Apweiler et al. ²⁵
      Opmerking: Common proteoom databases bevatten Swiss-Prot, Trembl, en NCBI, maar kan worden gebouwd van in-house gegevens, alsmede.
   2. Binnen de software, kies een database zoekmachine en selecteer parameters op basis van de kwaliteit van de verkregen gegevens en de strengheid van de gewenste zoeken, zoals beschreven door Perkins et al. voor MASCOT ²⁶ of Eng et al. voor Sequest ^27.
      1. Voor high-mass nauwkeurigheid van de gegevens, set parameters voor het zoeken in de software als volgt: max 2 gemiste breuklijnen, 5 ppm voorloper massa tolerantie, en 0,02 Da fragment massa tolerantie (voor optimale accurate deamidering detectie ²²⁾ en omvatten de volgende tryptische peptide modificaties "carbamidomethyl (C)" statische modificatie en "deamidering (N / Q)" en "oxidation (M) "dynamische veranderingen. Bij gebruik ¹⁸ O digestie labeling bevatten" deamidering ¹⁸ O (1) "als extra dynamische wijziging.
      2. Zoek met behulp van de gekozen motor, de ruwe peptide data tegen het eiwit database (7.1.1).
         Opmerking: Mass toleranties moet geschikt zijn voor het gebruikte instrument en niet willekeurig laag zijn.
         Opmerking: De zoekfunctie wordt automatisch ingevuld door de software met behulp van verschillende zoekmachines specifieke algoritmes. De percolator algoritme (MASCOT), SEQUEST of andere combinaties van algoritmen worden toegepast om eiwitten te identificeren van peptiden en de geldigheid van de treffers behaalt; meer informatie over de beschikbare instrumenten worden behandeld in een recensie van Gonzalez-Galarza et al. ^28,29. Afhankelijk van de software, kunnen extra zoekparameters moeten worden afhankelijk van de beoordeling van de gebruiker.
   3. Exporteer de geïdentificeerde peptiden voor handmatige curation en Fürther analyse.
2. Handmatig curate een lijst van peptiden die een geïdentificeerde deamidering op asparagine van de N-gebonden glycosylering motief (NX (S / T), waarin X ≠ P). Cross-valideren deze sites met bekende glycosylering motieven uit de literatuur en het creëren van twee zwembaden van de resultaten (gevalideerd en theoretisch).
3. Gebruik spectrale tellen ³⁰ om het percentage bezetting van een gegeven glycosyleringsplaats vergelijken door vergelijking van de overvloed aan gedeamideerde en niet gedeamideerde vormen.

8. Glycan Relatieve kwantificering

Opmerking: De volgende identificatie en kwantificatie werd voltooid met behulp van de Xcalibur software. Echter, alle software die ruwe data analyseert en automatisch integreert chromatografische pieken kunnen worden vervangen.

1. Genereer een theoretische overzicht van glycan composities uit de biologisch mogelijke combinaties van hexosen, deoxy-hexosen, hexosamines, siaalzuren en andere saccharides. Daartoe is een menselijke glycan databank gepubliceerd door Walker et al. ¹⁵ en kunnen worden gebruikt zoals het is. Voor theoretische databases, moet soortspecifieke biologische beperkingen worden opgelegd aan de combinatorische ruimte, en deze regels worden beschreven door Kronewitter et al. ^31.
2. Bereken de glycan mono-isotopische massa (M) van de atomaire massa's voor elke compositie voor proton lading staten + 1-3. Wijzig de mono-isotopische massa van de toevoeging van de NAT (254,14191 g / mol) of SIL (260,162042 g / mol) P2GPN tag bevatten.
3. Open de "Processing Setup" programma van de routekaart uitzicht in Xcalibur. Stel een verwerkingsmethode precies in het Aanvullend materiaal beschreven door Walker et al. ¹⁵ met de lijst gegenereerd in stap 8.2 met de theoretische mono-isotopische massa van de [M + H] ^1+, [M + 2H] ²⁺ en [ M + 3H] ³⁺ soorten.
   Opmerking: Om glycaan identiteit daarbuiten nauwkeurig te bevestigenmassa, voor NAT / SIL dubbelzijdig runs, controleer dan of NAT en SIL N-glycan paren co-elueren met dezelfde retentietijd. Kwalitatief cross-identificaties bevestig met de MS spectra ^2, waarbij pieken behorend tot de oxonium ion serie ³² moet bevatten.
4. Exporteer de geïntegreerde, geëxtraheerd ion chromatogram (XIC) gebieden om Excel aan de SIL en NAT abundanties precies in het Aanvullend materiaal beschreven van Walker et al te verkrijgen. ¹⁵
5. In Excel programma de cellen in een nieuwe kolom aan de correctie van het molecuulgewicht overlap berekenen door aanpassing van de SIL overvloed volgens een door Walker e.a. vergelijking ^{1 5.:}
   ,
   waarbij A de mono-isotopische piek en de theoretische isotoop overlap, , Kunnen onafhankelijk van elkaar worden berekend per samenstelling.
6. In een tweede kolom, het programma cellen NAT en SIL kanalen normaliseren behulp van de vergelijking van het totale genormaliseerde glycan factor (TGNF), per spectrum, zoals beschreven door Walker et al ^{1 5.:}
   ,
   waarbij N het aantal N-glycanen boven de limiet van kwantificering.
7. In een nieuwe kolom Programmeer de cellen met de verhouding tussen SIL nemen: NAT glycanen (of vice versa) om de veelvoudverandering concentratieverhouding tussen de twee monsters te berekenen.

Resultaten

Figuur 1:. De regeling van de HOEKTANDEN-P2GPN hydrofobe tagging gekoppeld methode (methode A) voor gecombineerde proteomics en glycomics analyse wordt gegeven Stappen die verschillen tussen glycomics-enige vorm van verwerking en tandem glycomics en proteomics analyse, met glycosylatieplaats identificatie, worden gemarkeerd. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De in-line proteoomanalyse en glycomics, filter-gebaseerde P2GPN hydrofobe tagging methode (methode A) werd gevalideerd voor de identificatie, kwantificering en molecuulgewicht voorspanning waarbij gebundelde hen plasmamonsters (Figuur 1). Voor uitsluitend glycomics experimenten, glycanen onderlinge vergelijkingen in de abundanties van N gewonnen door MethodA Carbograph SPE (gouden standaard, methode B) werden gemaakt (figuur 2). Er waren geen significante verschillen in de dichtheden van glycanen tussen beide methoden. De intra-variabiliteit werd ook beoordeeld door het kwantificeren van de SIL: NAT verhouding glycanen geëxtraheerd volgens dezelfde werkwijze. De log ₂ -distributions van beide methoden waren Gaussian, gecentreerd op nul en niet significant verschillend (Figuur 3A-B). Het molecuulgewicht varieert tussen de twee protocollen volledig overlappende, wat suggereert dat het filter niet discrimineren N-glycanen basis van moleculaire gewichtsbereik en hydrofiliciteit (figuur 4).

Figuur 2: Een equimolair mengsel van NAT en SIL N-glycanen geëxtraheerd volgens werkwijze A of werkwijze B werd bereid uit 2,5 pl hen plasma (N = 4) De monsters waren anal.yzed door UPLC-MS volgens de aanbevolen parameters in paragraaf 6. De abundances per glycan voorgesteld, in elke NAT / SIL kanaal, berekend door integratie van de oppervlakte onder de geëxtraheerde ionenchromatogram (MMA = 3 ppm) en corrigeert de moleculaire gewicht overlap, en aanpassen door de TGNF. Deze ratio's worden getoond met hun standaard fouten. De dichtheden van Methode B: Methode A N-glycanen waren niet significant verschillend (p> 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De intra-variabiliteit in de (A) Methode A (N = 133) of (B) Methode B (N = 123) strategieën vergeleken. NAT en SIL equimolaire mengsels van N-glycanen, uit dezelfde extractie schemaWerden geanalyseerd via drie technische replicaten. De log ₂ -distributions werden gecentreerd op nul en waren niet significant verschillend tussen de twee workflows. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Het molecuulgewicht varieert van glycanen van elke strategie vergeleken. De twee workflows leverde glycanen verspreid over hetzelfde gewicht bereik moleculaire. N-glycanen aangetroffen in een protocol ten opzichte van de andere viel net boven de detectielimiet (1 x 10 ⁵ overvloed) en komen niet overeen met systematische vooringenomenheid. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.

Behoud van het gedeglycosyleerde eiwitten door het molecuulgewicht filter ingeschakeld in-line proteoom brede analyse en glycosyleringsplaats identificatie. Meerdere protocollen voor gecombineerde zuivering van glycanen en eiwitten werden vergeleken met een traditionele FASP preparaat zonder deglycosylering (Tabel 5). Onze typische 18 uur filter gebaseerd PNGase F vertering, gevolgd door FASP trypsine digestie (Std protocol) geleid tot aanzienlijke niveaus van niet-specifieke deamidering, die kunnen interfereren met de identificatie van glycosites. Daarom is een methode waarbij een kortere incubatietijd bij verhoogde temperatuur (50 ° C) en een PNGase F piek in stap (SPI protocol) werd onderzocht als alternatief, samen met een microgolfontsluiting protocol (MD protocol), die niet-minimaliseren specifieke deamidering. De glycanen waargenomen in de nieuwe digestiemethoden waren niet significant verschillend in samenstelling of abundanties van de standaard 18 uur, 37 ° C filter PNGase F digest ( Figuur 5). Gecombineerd met een korte trypsine incubatie werd aspecifieke deamidering aanzienlijk verminderd, met een vals positieven voor glycosites <5% (Tabel 5).

		eiwitten					peptiden					gedeamideerde Peptiden					Glycosites					glycoproteïnen
		+		-			+		-			+		-			+		-			+		-
FASP				249					3083					795					5					5
18hr		217		304			6013		5086			1029		733			257		24			112		18
MD		270		266			5190		5125			465		455			254		8			102		7
SPI		281		288			4729		4482			602		573			232		10			145		8

. Tabel 5: Vergelijkingen van proteomics data van een standaard trypsine verteren ten opzichte van de in-line HOEKTANDEN-P2GPN tagging methode werden voorbereidingen getroffen werden uitgevoerd met (+) en zonder (-) PNGase F op de achtergrond de tarieven van de niet-specifieke deamidering en de raming te bepalen glycosite vals positieve tarieven. Eiwitten werden geïdentificeerd met 1% valse ontdekking tarief (FDR); peptiden werden gefilterd op basis van peptide vertrouwen "hoog" in Proteome Discoverer 1,4 (q <0,01); glycosites werden identified basis van unieke sequenties die deamidering van het geconserveerde motief glycosylering (NXS / T); en glycoproteïnen werden gedefinieerd als geïdentificeerde eiwitten die ten minste één geïdentificeerde glycosite.

Figuur 5: Verkorte protocollen voor glycanen werden ontwikkeld om deaminering in de monsters te minimaliseren en vergeleken met de 18 uur HOEKTANDEN PNGase F vertering. De gemiddelde verschillen waren in dichtheden 10% en 5% van de MD (2.2.3) en SPI (2.2.2) protocollen, respectievelijk. Van de 48 glycanen geïdentificeerd, 90% weergegeven minder dan 1,5-voudige variatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hoge-doorvoer kwantitatieve methoden zijn nodig om routinematige glycan-analyse te vergemakkelijken. De afgelopen dertig jaar is glycomische analyse beperkt gebleven tot een subset van onderzoeksgroepen, ondanks de belangrijkheid ervan in ziekte, klinische toepassingen en farmaceutische producten. De FANGS-P2GPN-zuiverings- en taggingmethode voor glycomics en proteomics voert dezelfde analyse uit op een enkele aliquot van een monster, waardoor de kosten van benodigdheden en de hoeveelheid benodigde materialen worden verminderd (bijzonder belangrijk bij onderzoek met mensen en muizen). Bovendien zijn inspanningen om de variabiliteit in voorbereidingen te minimaliseren van cruciaal belang, aangezien elke extra stap bijdraagt aan fouten, wat belangrijke maar zeldzame veranderingen in case-control-studies kan maskeren. De koppeling van FANGS aan hydrofobe hydrazide tagging maakt het mogelijk om eiwit- en glycanmonsters op dezelfde RPLC-kolom te laten lopen, verbetert de glycanisatie, zorgt voor relatieve kwantificering en kan kwantitatief worden toegepast op plasma.

Voor N-glycan-analyse is het essentieel om het voorgestelde niveau van PNGase F te gebruiken om volledige de-glycosylering te bereiken. Hoewel glycanen blootstaan aan oplosmiddelen, helpen denaturatie van eiwitten en overtollig enzym om een efficiënte en volledige splitsing te garanderen. Voor nauwkeurige kwantificering van de glycanen is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat ze volledig zijn gedroogd na derivatisering om de reactie te stoppen en kruisreacties te voorkomen bij het mengen van de NAT- en SIL-soorten. Ten slotte is het tijdstip van de stappen van cruciaal belang bij het uitbreiden van de workflow naar glycosit-analyse om niet-specifieke deamidering te minimaliseren. De aangepaste protocollen die zijn voorgesteld voor gecombineerde glycomics- en proteomics-analyse werken consistent wanneer ze overeenkomstig worden uitgevoerd.

De workflow bereikt nauwkeurige relatieve kwantificering van N-glycanen uit plasma in vergelijking met de gouden standaard, SPE-methode. Er is geen duidelijke voorkeur in de typen glycanen die worden geëxtraheerd in termen van moleculair gewicht, hydrofiliciteit en samenstellingsstructuur. Hoewel we de kwalitatieve analyse van O-gekoppelde glycanen niet hebben onderzocht, verwachten we dat FANGS de toevoeging van een β-eliminatie stap post-PNGase F-vertering van N-gekoppelde glycanen zou kunnen ondersteunen. Procedures zouden echter aanzienlijke aanpassingen vereisen voor reiniging van reagentia voorafgaand aan massaspectrometrie, en peptidenanalyse zal aanzienlijk worden beïnvloed. Voor proteomics wordt dezelfde diepte van proteoom-dekking bereikt in vergelijking met traditionele FASP-methoden. Belangrijk is dat methoden een minimale valse ontdekkingsgraad bereiken voor N-glycandeamidering. Hoewel de methode compatibel is met ¹⁸O-labeling van Asn tijdens de PNGase-verteringsstap^22,23, suggereert de lage valse ontdekkingsgraad voor glycosyleringsplaatsen dat dit misschien niet nodig is, waardoor verdere kosten en complexiteit worden verminderd.

Het proteoom is niet verrijkt met glycoproteïnen in deze methode, wat zowel voor- als nadelen heeft. Bepaalde zeldzame glycoproteïnen worden mogelijk niet gedetecteerd in de analyse. De bezetting van geglycosyleerde plaatsen per eiwit kan echter worden vergeleken tussen biologische monsters. Bovendien wordt de fout en bias geïntroduceerd door lectin-affiniteitszuivering of chemische verrijking geëlimineerd. Kortom, de koppeling van FANGS aan de individualiteit normalisatie bij het labelen met glycanhydrazide-tagsstrategie resulteert in een vereenvoudigde, kwantitatieve, hoge-doorvoer methode voor de tandem-analyse van het glycoom en proteoom met groot potentieel voor toepassing in klinische case-control-studies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Azijnzuur (50%)	Sigma Aldrich	45754
Acetonitrile, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH015-4
Ammonium Bicarbonaat	Sigma Aldrich	A6141
Bradford Reagens	Sigma Aldrich	B6916	Alternatief: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calciumchloride	Sigma Aldrich	C1016
Centrifuge	Eppendorf	5804 R	Alternatieve centrifuges die 14.000 x g bereiken zijn geschikt
DL-Dithiothreitol, 1 M in oplossing	Sigma Aldrich	646563
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	Alternatieve nano- of ultra hogedruk LC's produceren vergelijkbare gegevens, zoals: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Waters).
Floating Tube Rack	TedPella	20831-20
Fetuïne	New England Biolabs	P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens	Fisher Scientific	11-690-625F	Alternatieve incubatoren die 56 °C bereiken zijn geschikt
Mierenzuur	Sigma Aldrich	56302
GE Magnetron	General Electric	57B5 E82904	Elke magnetron met instelbare vermogensinstellingen is geschikt
INLIGHT Glycan Tagging Kit	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	Het INLIGHT-kit biedt NAT- en SIL-versies van het P2GPN-reagens.
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	A3221
Kinetix 2,6 mM, 100 Å, C18 bulk stationaire fase	Phenomenex	Bulk Media	Alternatief: Elke C18 stationaire fase 5 mM
Mascot Daemon Software en Server	Matrix Science		Alternatief: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 μm, OD 75 μm ID, 15 μm tip, niet-gecoat, 5 per doos, 50 cm	New Objective	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-vrij), 75.000 eenheden/ml	New England BioLabs	P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Massaspectrometer	Thermo Scientific		Alternatieve hoge massa nauwkeurigheid (5 ppm) massaspectrometers zullen vergelijkbare gegevens leveren
RNase B	New England Biolabs	P7817S
Trypsine uit varkens pancreas	Sigma Aldrich	T6567-5X
Urea	Sigma Aldrich	51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	SPD131DDA	Alternatieve vacuüm concentratoren zijn geschikt
Vivacon 500 30 kDa Filters	Sartorius Stedim Biotech	VN01H22	Alternatief: Amicon Ultra 0,5 Centrifugal Filter Units met Ultracel-10 kDa Membraan (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH365-4
Water, 18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	De toevoeging van 18O in de PNGase F verteringstap is optioneel en is mogelijk niet nodig voor deamideringsstudies die met 95% zekerheid zijn voltooid
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit	Merck Millipore	693030