Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network

Samenvatting

We hebben een techniek ontwikkeld voor de isolatie, karakterisatie fenotypische en functionele analyse van immuuncellen van muizen gingiva vastgesteld.

Samenvatting

Immuuncellnetwerken in weefsels spelen een essentiële rol bij het mediëren van lokale immuniteit en het handhaven van weefselhomeostase, toch is er weinig bekend over de residente immuuncelpopulaties in het mondslijmvlies en het tandvlees. We hebben een techniek ontwikkeld voor het isoleren en bestuderen van immuuncellen uit muis-gingivalweefsel, een gebied met constante microbiële blootstelling en een kwetsbare plaats voor een veelvoorkomende ontstekingsziekte, parodontitis. Ons protocol staat een gedetailleerde fenotypische karakterisering toe van de immuuncelpopulaties die in het tandvlees aanwezig zijn, zelfs in rusttoestand. Onze procedure levert ook voldoende cellen met hoge levensvatbaarheid op voor gebruik in functionele studies, zoals de beoordeling van cytokinesecretie ex vivo. Deze combinatie van fenotypische en functionele karakterisering van het immuuncelnetwerk in het tandvlees zou moeten helpen bij het onderzoek naar de mechanismen die betrokken zijn bij orale immuniteit en parodontale homeostase, maar zal ook ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij lokale immunopathologie bevorderen.

Inleiding

Gingivale weefsel rondom de menselijke en murine gebit en worden voortdurend blootgesteld aan het complex biofilm van de tand ^1. De immuuncel netwerk toezicht op de gingivale barrière is essentieel voor het handhaven weefselintegriteit, waardoor homeostase met de lokale commensale microben en, tegelijkertijd, doeltreffende immuniteit tegen pathogene challenge ^2. Om homeostase, wordt het immuunsysteem nauwkeurig afgestemd op de gingivale milieu waardoor een sterk gespecialiseerde immuuncel netwerk, maar weinig detail bekend van de gingivale immuuncelpopulaties en hun rol bij het ​​handhaven weefsel immuniteit ^2.

Wanneer immuun homeostase wordt verstoord op het tandvlees, hetzij door middel van verhoogde vatbaarheid gastheer en / of de aanwezigheid van dysbiotic microbiële gemeenschappen, een inflammatoire aandoening, parodontitis ontstaat ^{3 4.} Parodontitis een gemeenschappelijke ontstekingsziekte, wat leidt tot verlies van tanden supporting structuren. In haar ernstige vormen het wordt gezien in ongeveer 10% van de bevolking ^5. Ontrafeling van de belangrijkste factoren die betrokken zijn bij parodontitis gevoeligheid en de progressie is moeilijk gebleken ^6. Echter diermodellen uiterst nuttig bij het ​​begrijpen van de mechanismen van parodontitis initiatie en progressie ⁷ geweest. Modellen kunnen worden gebruikt om de sleutel celpopulaties en moleculaire mediatoren die essentieel voor immuun homeostase en aandrijving ontwikkeling van parodontitis zijn gedefinieerd. Dergelijke inzichten zal ons begrip van gingiva-specifieke controle van het immuunsysteem homeostase transformeren en verder ons huidige begrip van de ziekte pathogenese.

Protocol

Alle in dit protocol beschreven experimentele gevolgde procedures vereiste richtlijnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite, NIDCR / NIH.

1. Bereid in Advance

1. Bereid compleet medium: RPMI aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 10% FBS.
2. Bereid DNase media: 50 ml RPMI medium aangevuld met 7,5 ug DNase (Voeg verse, houdt op ijs te allen tijde).
3. Bereid Collagenase-DNase media: 5 ml DNase media plus 3,2 mg / ml van Collagenase Type IV (Voeg verse, houdt op ijs te allen tijde).
4. Pre-cool FACS buffer: 0,5% FBS verdund in PBS.
5. Pre-cool centrifuge tot 4 ° C.
6. Warm shaker incubator op 37 ° C.

2. Isolatie, Dissection en Cell Isolatie van Gingival Blocks

1. Euthanaseren muizen door ze bloot te stellen aan _CO 2 in een geschikte kamer, volgens de richtlijnen ARAC.
2. Open de borst- en buikholte naar het hart en de inwendige organen bloot. Te perfuseren, een insnijding in de onderste vena cava en perfuseren 3 ml PBS via de linker ventrikel met een 3 ml spuit met een 27 G naald.
3. Immobiliseren van het lichaam en het hoofd van de muis op een pad met de buik naar boven.
4. Snij elke commissure van de lip in de richting van de hals met een schaar, het scheiden van de huid die betrekking heeft op de onderkaak en halsgebied, het blootstellen van de onderliggende weefsels en spieren. Ontleden de onderlip aan de onderkaak bloot te leggen.
5. Snijd tussen de onderste snijtanden aan beide zijden van de onderkaak scheiden en immobiliseren weerszijden om de mondholte.
6. Visualiseren en ontleden de mond weg van de neusholte.
7. Ontleden gebieden met een mes 10 en omvatten bovenkaak en onderkaak molaire gebieden met omgeving gingiva (figuur 1). Voeg verticale incisies anterieure en posterieure molaire eerste naar de derde molair en een horizontale snede inde rand van het tandvlees (witte kraag van weefsel rondom de tanden).
8. Plaats de bovenkaak en onderkaak blokken in een 50 ml conische buis met 5 ml Collagenase / DNase (te houden op het ijs).
9. Incubeer in een shaker incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur en gedurende de laatste 5 minuten incubatie voeg 50 ul van 0,5 M EDTA.
10. Voeg 5 ml koude DNase media om de 50 ml buis met weefsels en draai voorzichtig te mengen.
11. Breng de 4 blokken van weefsel op een petrischaal en bedek met 500 ul van DNase media. Verwijderen gingiva uit elk blok van weefsel, met behulp van een scalpel en wijst het mes in de gingivale en interdentale ruimten.
12. Breng de weefsels en de inhoud van de petrischaal en de vorige DNase media tijdens dissectie, een nieuwe 50 ml buis door de cel zeef (70 um grootte). Wassen met DNase media (3-5 ml), alle van de gebruikte instrumenten en filter.
13. Met de plunjer van een steriele 3 ml spuit, mash het weefsel tegen de zeef,filtering met koude DNase media (30-35 ml).
14. Was de cel zeef met koud DNase media.
15. Centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 6 minuten.
16. Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml van complete media.
17. Tellen cellen (het verwachte bedrag moet liggen tussen 8 x 10 ^5-1,2 x 10 ⁶ cellen met een levensvatbaarheid van> 80%) met behulp van een geautomatiseerde cel teller.

3. Stimulatie en FACS kleuring van Gingival Cells

1. Stimuleren van de enkele celsuspensie met PMA (50 ng / ml) en Ionomycine (2,5 ug / ml) in aanwezigheid van 1 ul / ml Brefeldine A.
2. Incubeer gedurende 3,5 uur bij 37 ° C en _5% CO2.
3. Spin down en wassen met PBS en centrifugeer bij 4 ° C; 314 g gedurende 6 minuten.
4. Vlekken op de cellen met een levensvatbaarheid kleuring de instructies van de fabrikant.
5. Vlek voor extracellulaire merkers (CD45, TCRγδ, TcR, CD4, CD8, TCRγδ of mieribodies keuze) volgens de instructies van de fabrikant.
6. Was de cellen met koude FACS buffer en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
7. Voorzichtig vortex de celpellet verstoren.
8. Fixeer de cellen met 2% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
9. Was de cellen met koude FACS-buffer, centrifuge bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 minuten en kleuring voor intracellulaire cytokinen.
   1. Vul het FACS buizen met een oplossing van koude 0,5% saponine verdund in FACS buffer en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
   2. Voeg 300 ul van 0,5% saponine oplossing voor de FACS buizen, incubeer 15 min in het donker bij 4 ° C en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
   3. Vlekken op de cellen voor intracellulaire merkers (IL-17A en IFNy of cytokines keuze) volgens de instructies van de fabrikant. Was de cellen met 0,5% saponine-oplossing en centrifuge bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
   4. Was opnieuw met FACSbuffer en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
   5. Resuspendeer de cellen in 300 pl FACS-buffer.
10. Analyseer resultaten op een flowcytometer.

4. Flowcytometrieanalyse

1. Visualiseren cellen die moeten worden geanalyseerd op vooruit (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SCC) en de poort naar puin uit te sluiten.
2. Selecteer enkele cellen met voorwaartse verstrooiing gebied (FSC-A) vs. hoogte (FSC-H) parameters.
3. Poort levende cellen die (zoals aangeduid door levensvatbaarheid kleuring) en positief voor de marker CD45 ⁺ hematopoietische voor verdere analyse (Figuur 2A en 2C) zijn.
4. Continue analyse van specifieke markers zoals getoond in figuur 2 en figuur 3.

Resultaten

De toepassing van het protocol illustreren, tonen we representatieve resultaten onderzoeken de immuuncel netwerk in de gingiva van muizen met en zonder parodontitis (WT versus LFA ^{- / -} figuur 2A - C). Representatieve FACS plots tonen levende CD45 ⁺ hematopoietische cellen in de gingiva (Figuur 2A, 2C). Isolatie en verwerking van immuuncellen met dit protocol levert voldoende cellen ex vivo...

Discussie

De huidige techniek succes een groot aantal immuuncellen (van één enkele muis) geschikt oplevert, niet alleen voor de fenotypische karakterisatie, maar ook voor functionele studies ex vivo. Een andere groep eerder gepubliceerd protocol voor het isoleren en karakteriseren van muizen gingivale immuuncellen en introduceerde de waarde van het gebruik multicolor flowcytometrie in de studie van parodontitis in diermodellen ^9. Na aanzienlijke problemen de belangrijkste wijziging in dit protocol werd dissect...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fine Scissors	Fine science tools	14058-11
Scalpel Handle #3	Fine science tools	10003-12
Scalpel Blades #10	Fine science tools	10010-00	Steriele
Splinter Forceps	Integra Miltex	6-304
Naalden met reguliere bevel	BD Medical	305109	27 G, 12,7 mm lengte
Monoject spuiten	Covidien	8881513934	Luer-lock tip, 3 ml
PBS, pH 7.4	Life Technologies	10010-049	Zonder calcium en magnesium
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Zonder L-glutamine
DNase I van bovien pancreas	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Collageenase type IV	Gibco (door Life technologies)	17104-019
Fetaal bovien serum	Gemini Bio-products	100-106
Gentamicine 50 mg/ml	Quality biological	120-098-661EA
Pen Strep	Gibco (door Life technologies)	15140-122
L-Glutamine	Gibco (door Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Quality biological	351-027-721EA
50 ml buizen	Corning	352070	Polypropyleen, steriele
70 μM Cell Strainers	Corning	352350
Petrischalen	Corning	351029	Steriele
5 ml FACS buizen	Corning	352052	Steriele
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Bevat brefeldine A oplossing
Phorbol 12-Myristaat 13-Acetaat (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Ionomycin Calcium Zout	Sigma-Aldrich	13909
Saponin uit quillaja schors	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-Mouse IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-Mouse IFN-γ PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-Mouse CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-Mouse CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-Mouse CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-Mouse CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-Mouse TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-Mouse Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-Mouse Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104