Methodenartikel

RNAi Trigger delivery in

10.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53738

⸱

8 maart 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biology Department, Boston College, 2Division of Biology, Kansas State University, 3Discovery Research, Biogen

In dit artikel

Samenvatting

RNA-interferentie (RNAi) is een uiterst waardevol hulpmiddel voor het onthullen van genfunctie. De mogelijkheid om genen te targeten met behulp van RNAi tijdens pre-adulte stadia is echter beperkt in de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae. We beschrijven een RNAi-protocol om genfunctie te verminderen via directe injectie tijdens de popontwikkeling.

Samenvatting

RNA-interferentie (RNAi), een natuurlijk voorkomend fenomeen in eukaryote organismen, is een uiterst waardevol hulpmiddel dat in het laboratorium kan worden gebruikt voor functionele genomische studies. De mogelijkheid om individuele genen selectief uit te schakelen via deze omgekeerde genetische techniek heeft veel onderzoekers in staat gesteld om snel de biologische rollen van talloze genen in vele organismen te ontdekken, door evaluatie van fenotypes met verlies van functie. In de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae is de meest gebruikte methode om de functie van doelgenen te verminderen de injectie van dubbelstrengs (dsRNA) in de hemocoel van de volwassen mug. Hoewel deze methode succesvol is geweest, sluit genuitdoving bij volwassenen de functionele beoordeling uit van genen die worden uitgedrukt en mogelijk een rol spelen tijdens pre-volwassen stadia, evenals genen die in beperkte aantallen cellen worden uitgedrukt in volwassen muggen. We beschrijven een methode voor de injectie van Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA tijdens het vroege popstadium en valideren SRPN2-eiwituitdoving door observatie van verlaagde doeleiwitniveaus en de vorming van melanotische pseudotumoren in SRPN2 knockdown volwassen muggen. Dit duidelijke fenotype is eerder beschreven voor knockdown van SRPN2-functie in het volwassen stadium, en we hebben dit volwassen fenotype gerepliceerd door SRPN2 knockdown geïnitieerd tijdens de popontwikkeling. Wanneer gebruikt in combinatie met een kleurstof-gelabelde dsRNA-oplossing, maakt deze techniek eenvoudige visualisatie mogelijk door eenvoudige lichtmicroscopie van de injectiekwaliteit en verdeling van dsRNA in de hemocoel.

Inleiding

Malaria is een door muggen overgebrachte infectieziekte die vele miljoenen mensen elk jaar treft. De World Health Organization (WHO) meldt dat in 2013 waren er ongeveer 584.000 sterfgevallen als gevolg van malaria, 78 procent die zich in kinderen onder de leeftijd van vijf jaar 1. De ziekteverwekkers die menselijke malaria veroorzaken apicomplexa parasieten van het geslacht Plasmodium en tussen hun menselijke gastheren worden overgedragen door vrouwelijke Anopheles muggen. Transmissie treedt op wanneer de mug neemt een bloedmaaltijd van een persoon die is geïnfecteerd, en dan deposito infectieuze parasieten in een niet-geïnfecteerde individu in een volgende bloedmaaltijd. Binnen het geslacht Anopheles, Anopheles gambiae is de soort met de grootste vectoriële capaciteit en is de meest prominente malaria vector in sub-Sahara Afrika 1-3.

Momenteel, mosquito vector controle door toepassing van insecticiden blijft be de belangrijkste toegepaste methode om de last van de menselijke malaria terug te dringen. Hoewel het gebruik van insecticiden sinds 1960 is gebleken zeer succesvol te zijn, heeft de opkomst van insecticide resistentie behoefte aan ontwikkeling van nieuwe insecticiden en alternatieve vectorcontrole strategieën 4-7 aangedreven. In 2010, in totaal 49 van de 63 landen rapporteren aan de WHO aangegeven het vóórkomen van resistentie tegen insecticiden in malariavectoren 1. Daarnaast is de IR Mapper tool, die peer-reviewed literatuur weerstand data in Afrotropische regio's te beoordelen gebruikt, meldt dat tussen 2001 en 2012 waren er 46% en 27% verhoging van de weerstand tegen pyrethroïden en dichloordifenyltrichloorethaan (DDT), respectievelijk 7.

RNA interferentie (RNAi) werd geïdentificeerd in de vroege jaren 1990 als een techniek die kan worden toegepast om genen in de planten Petunia 8,9 en in de schimmel Neurospora crassa 9,10 inactiveren. Kort daarna,in 1998, werd RNAi eerst gedocumenteerd in Caenorhabditis elegans als middel om genexpressie in een diermodel door het inbrengen van antisense of dubbelstrengs RNA (dsRNA) via injectie of voedingswijze 9,11. Sinds zijn ontdekking, is RNAi het streven naar functional genomics revolutie teweeggebracht doordat onderzoekers reverse genetics gebruiken om de functionele rol van genen van belang snel te onderzoeken via een zeer selectieve post-transcriptionele gene silencing mechanisme. In sommige organismen, zoals Drosophila melanogaster is het gebruik van transgene organismen die interfererende RNA constructen zeer succesvolle voor gentherapie knockdown (KD) geweest. Hoewel het gebruik van transgenen in An. gambiae voor RNAi is gebruikt en kunnen nuttig zijn voor grootschalige schermen tonen, het genereren van transgene muggen stammen is zowel arbeids- en tijdsintensief, algemeen vanuit twee tot drie maanden om van de identificatie van een gen van belang voor de Generatiop een geschikte transgene voorraad 12. Momenteel is de belangrijkste methode van gen KD An. gambiae via injectie in de hemolymfe gedurende het volwassen stadium van dsRNA specifiek voor een bepaald gen 12,13. Dit duurt gewoonlijk ongeveer een maand om van identificatie van een gen van belang voor de beoordeling van gen KD, blijkt veel sneller dan transgene werkwijzen 12 zijn. Methoden voor larvale stadium RNAi zijn onlangs opgericht in An. gambiae en Aedes aegypti via nanodeeltjes voeden 14-17 of door orale toediening van microalgen-gebaseerde dsRNA moleculen 18, het aanbieden van mogelijkheden om functionele genomische analyses uit te voeren tijdens de vroege stadia van ontwikkeling. In de directe injectie, het voeden, en nanodeeltjes levering methoden wordt dsRNA autonoom overgenomen door het doel cel en gesplitst door het enzym Dicer in 21-25 nucleotide-lange "short interfererende RNA" (siRNA's) 19,20. Deze siRNA's worden vervolgens incorporated in de RNA-geïnduceerd silencing complex (RISC), waarvan één streng worden genegeerd, zodat de RNA-gebonden RISC complex binden en splitsen het doel-mRNA en daardoor het niveau te reduceren en remmen de vertaling 19,20.

Veel intrinsieke eigenschappen van elementaire mosquito biologie moduleren vectoriële capaciteit, met inbegrip van gastheer voorkeur (bijvoorbeeld reukzin, gustation), paring, voortplanting en immuniteit. Gezien het belang van deze biologische processen, is het waarschijnlijk dat hun differentiatie op genetische of farmacologische niveau van nieuwe mogelijkheden voor vectorcontrole, waaronder omzeiling van insecticide weerstand bieden, en nieuwe instrumenten voor breder geïntegreerde benaderingen vectormanagement. Het gebruik van functionele genomica om de rol van genen die ten grondslag liggen aan deze intrinsieke biologische functies te beoordelen zal de identificatie van nieuwe doelstellingen mogelijk te maken en bieden nieuwe inzichten in hoe we effectief kunnen nieuwe, efficiëntere controle strategies. We beschrijven de ontwikkeling en het gebruik van een snelle injectie methode voor het initiëren van RNAi in het popstadium van An. gambiae. We constateren dat popstadium injectie van een RNAi trekker maakt observatie van de resulterende fenotypes in een vroeg stadium volwassenen, dat wil zeggen, vroeg na het opkomen dan zou worden waargenomen als gen knockdown bij volwassenen werden gestart na opkomst. Deze methode maakt gen knockdown aanvangt het popstadium ontwikkeling interval en verlenging in volwassen stadia, zodanig dat gen knockdown gang gebracht popstadium ontwikkeling kunnen aanhouden en invloed jongvolwassen hemolymfe toegankelijke celtypen, alsook celtypen die meer hemolymfe-toegankelijk tijdens metamorfose dan bij volwassenen, zoals sensorische neuronen in volwassen aanhangsels na opkomst.

Protocol

1. Synthese en Voorbereiding dsRNA

  1. Identificeer 200-800 bp knockdown gebied (de overeenkomstige dsRNA produceren) binnen het gen van interesse dat wordt voorspeld dat geen aanwijsbaar off-target effecten (bijvoorbeeld geen sequentiehomologie ≥18 bp binnen een gen) en een negatieve controle (bv een heterologe sequentie die niet aanwezig is in doelinsect genoom, zoals Escherichia coli lacZ-gen (GenBank Gene ID: 945.006). Of gebruik een positieve controle (bijvoorbeeld, die een gemakkelijk waargenomen fenotype oplevert, zoals SRPN2 21,22 GenBank Gene ID. 1270169) de sequentie van het dsRNA gericht SRPN2 gedefinieerd in Michel et al (2005) 21..
    Opmerking: E-RNAi is een open-source bioinformatica middelen die bruikbaar zijn voor de identificatie van dergelijke regio's en voor het ontwerpen oligonucleotide primers 23 is.
  2. Voer standard PCR amplificatie (bijv uitgevoerd met Taq DNA polymerase met behulp 30-35 cycli) onder toepassing van een genomisch DNA of cDNA sjabloon om dsRNA synthese template geflankeerd door een T7-promoter-sequentie (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') en vul dsRNA voorbereiding en clean-up met een commerciële in vitro transcriptie kit volgens instructies van de fabrikant. Gebruik SRPN2 PCR amplificatie omstandigheden en primer informatie zoals opgenomen in An et al. (2011) 22.
  3. Kwantificeren gezuiverde RNA amplicon opbrengst door ultraviolet absorptie spectroscopie bij een golflengte van 260 nm en op de gewenste concentratie (bijvoorbeeld 3 ug / ul) in RNase-vrij water.
    1. Voor het oplossen van RNA lage concentraties verminderen vloeistofvolume door het draaien van monsters in een vacuüm centrifuge bij kamertemperatuur of door vriesdrogen en reconstitueren monsters in kleinere hoeveelheden water. De tijd die nodig is voor monster lyofilisatie hangt afop de eerste steekproef volumes en dsRNA concentraties.
  4. Controleer de kwaliteit en de lengte van het dsRNA op een 2% agarose gel bereid met 1x TBE of TAE buffer en gekleurd met ethidiumbromide (EtBr), samen met het matrijs-DNA voor de transcriptiereactie. De dsRNA langzamer migreren dan matrijs-DNA. Kwaliteit en lengte kan worden bepaald door te zorgen er geen niet-specifieke dsRNA producten en producten door vergelijking met een standaard DNA merker, respectievelijk.
    Let op: EtBr is een krachtige mutagene stof en dienovereenkomstig worden behandeld.
    Opmerking: Bij een dsRNA concentratie van 3 ug / ul, 0,5 ui van het monster meer dan voldoende voor weergave op de EtBr-gekleurde agarosegel.
  5. WINKEL dsRNA bij -20 ° C totdat het nodig is. Meerdere vries / ontdooi cycli kan degradatie veroorzaken, zodat porties moeten worden voorbereid voor grote hoeveelheden dsRNA.

2. Bereid Fast Green FCF Dye (FGD) Tubes

  1. Verdun Fast Green FCF dyeuit voorraad-oplossing (≥85% kleurstof inhoud) tot 0,1% (v / v) (werkoplossing) in RNase-vrij water.
  2. Pipetteer 1 ul van kleurstof in de bodem van een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  3. Plaats buizen in een 65 ° C warmteblok gedurende ongeveer 3 uur tot vloeistof, dan plaats buizen verdampen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min, afkoelen alvorens te gebruiken. Deze droge vaste kleurstof reconstitueren in dsRNA resuspensie oplossing.

3. Trek injectienaalden

  1. Trek borosilicaatglas naalden met behulp van een verwarmde naald puller een tip diameter van 10-30 urn. Trek instellingen komen overeen met: Heater aanpassing nee. 1 = 100, Heater aanpassing nee. 2 = 70.
  2. Om schade aan de fijne punt van de naald te voorkomen, plaatst u alle trok naalden horizontaal in een petrischaal op een strook van het gieten van stopverf.
    Opmerking: Aanvullende informatie voor capillaire naald trekken methoden zijn te vinden in meer detail in de Malaria Research and Reference Reagent Resource Center MR4 handleiding 24.

4. Bereid Injection Station

  1. Verzamel benodigde materialen: glas microcapillaire naalden getrokken om fijne tip, microinjector, dun filter papier en dik filterpapier, petrischaaltjes, overdracht pipetten, penseel en ontleden lichtmicroscoop.
  2. Bereid de microinjector volgens de instructies in de microinjector handleiding, en stel injectievolume het gewenste volume per puls (bv maximaal 69 nl per puls).
  3. Op een platform dat is gemakkelijk te manoeuvreren onder een microscoop (bijvoorbeeld platte kant van een piepschuim buis rek), stapelen de twee filter papiervellen met de dunne filter papier op de top, en veilig met tape rond de randen.
  4. Resuspendeer 10 pi van elke dsRNA oplossing in aparte gekleurde kleurstof buizen, en leg ze op ijs.

5. Verzamelen Poppen voor injectie

  1. Vul een kleine 60 mm x 15 mm petrischaal met 10 ml gedemineraliseerd water, en het verzamelen van ~ 50 bleke poppen (during de eerste 24 uur na verpopping) uit een insectary tray met behulp van een wegwerp plastic overdracht pipet.
  2. Verwijder alle poppen die midden tot donker cuticula looien hebben.
    Opmerking: Als de cuticula begint te bruinen, wordt het moeilijker om de cuticula en injectie tot penetreren in veel hogere letaliteit.

6. dsRNA Injectie

  1. Onder de dissectiemicroscoop breken uit de distale punt van de injectienaald met een paar fijne pincet.
  2. Bereid de injectienaald door het opvullen van de naald met minerale olie (met behulp van een injectiespuit met een 3-inch, 30 gauge naald), en het verdrijven van overtollige olie met de microinjector.
  3. Voorzijde vullen injectienaald met een maximum bedrag van dsRNA, en werpen één puls onder de microscoop om de afgifte van vloeistof te waarborgen. In het geval dat er geen vloeistof wordt opgenomen en / of verdreven, controleer dan de distale punt van de naald voor eventuele verstopping en ervoor zorgen dat de naald stevig vastzit in de microinjector.
  4. Pick 1-3 poppen, en leg ze op het filter papier.
  5. Met behulp van het penseel, de positie van de poppen op het filter papier met dorsale cuticula toegankelijk, en het gebruik van de verfkwast aan te dringen op de filter papier en absorberen van het overtollige water.
  6. Stabiliseer de pop met de punt van het penseel, en steek de naald in de dorsale cuticula tussen de thorax en de buik onder een hoek van ongeveer 30 ° ten opzichte van het dorsale oppervlak van de pop. Injectie moet worden gericht op het achterste uiteinde van de pop en de naald moet worden verplaatst in een anterior naar posterior richting.
  7. Injecteer twee pulsen (69 nl per puls) van 3 ug / ul dsRNA oplossing in de hemolymfe en controleer de verdeling van de kleur in het lichaam. Als er geen kleur is geïdentificeerd, een verschuiving van de injectienaald positie iets naar de top te verwijderen van obstakels en herhaal vloeistof levering.
  8. Gebruik de bevochtigde penseel om voorzichtig te verplaatsen pop van de naald in het water voor het kweken. THij Pupa moet vasthouden aan de verfkwast op licht contact.

7. Post-injectie Voorwaarden

  1. Plaats de petrischaal met ingespoten poppen in een mug kooi met geschikte luchtstroom (bijvoorbeeld gaas kooi of container met gaas deksel). Pupal kweekomstandigheden moet consequent blijven op 27 ± 3 ° C temperatuur van 75 ± 5% luchtvochtigheid en onder een licht: donker-cyclus van 16: 8 uur.
  2. Bereid een 10% (w / v) glucoseoplossing en plaats een verzadigde oplossing watje op de mug kooi gaas voor volwassen voeding.

8. Assess Knockdown

  1. Op gewenste tijdpunt (s), beoordeelt fenotypes experimentele dsRNA geïnjecteerde insecten, in vergelijking met controles.
    1. Evalueren dsSRPN2 en dsLacZ insecten dagelijks door koeling omlaag volwassenen voor ongeveer 2-3 minuten bij -20 ° C, over te dragen naar een koude plaat bij 2 ° C en de eventuele vorming van pseudo-tumor door het gebruik van een dissectie microscoop bij 15Xvergroting met helderveld verlichting. Na beoordeling terug volwassenen insectary condities (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% vochtigheid).
      Opmerking: de experimentele en controle dsRNA's die werkzaam zijn in dit protocol zijn dsSRPN2 en dsLacZ, respectievelijk. Er zijn vele opties die geschikt zijn voor de controles; echter voorgesteld dat een positieve controle waarvoor fenotype en / of expressie kan gemakkelijk gevisualiseerd (bijvoorbeeld door ontleden microscopie) en / of gekwantificeerd [bv kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR), Western blot] worden gebruikt bij het ​​leren van deze techniek. SRPN2 eiwit en transcript kwantificering via Western blot en qRT-PCR worden respectievelijk beschreven in Michel et al. (2005) 21.

Resultaten

Pupal injectie voor gen KD levert optimale resultaten injectie wordt uitgevoerd gedurende de vroege popstadium, wanneer opperhuid looien laag zijn (Figuur 1A, links en 1B). Verhoogde looien en verharding van cuticula, meestal na 24 uur, leidt tot verhoogde pupal dood na injectie (Figuur 1A, midden en rechts). De snelheid van pupal ontwikkeling kan variëren afhankelijk van insectary omstandigheden en dierdichtheid 24,25; Daarom is het het beste om pigmentatie visueel beoordelen.

Tijdens het injectieproces wordt de capillaire naald in de dorsale cuticula aangebracht onder een hoek van ongeveer 30 ° in de anterior posterior richting (Figuur 2A). Wanneer de naald wordt ingebracht en het dsRNA + 0,01% (w / v) FGD wordt afgegeven, de verdeling van de kleurstof duidelijk in de hemolymfe (Figure 2B).

Beoordeling van volwassen exemplaar voor poppen geïnjecteerd met 0,01% (w / v) FGD onthulde een gemiddelde van 70% ontstaan, vergeleken met 96,7% daarbij van niet-geïnjecteerde controles (Figuur 3A). Opmerkelijk, gedeeltelijk uittreden uit het popstadium werd waargenomen voor een groot aantal niet overlevende muggen (Figuur 3B). Geïnjecteerde dieren vertonen geen vertragingen in opkomst tijd (Figuur 4A) of bevooroordeeld impact op zowel mannen als vrouwen (Figuur 4B). Aanvullende beoordeling van de volwassen overleving uitgevoerd tot op dag 10 na opkomst blijkt geen duidelijk effect op de na-opkomst adult overleving (Figuur 4C).

Validatie van KD kwaliteit werd beoordeeld door de melanotisch pseudo-tumor (donkergekleurde weefsels cluster) fenotype geassocieerd met SRPN2 knockdown 21,22 als een positieve controle voor knockdown en Aangezien fenotypen geassocieerd met dsLacZ injectie als een negatieve controle. Volwassen muggen die ontstond werden gescoord op dag 8 na de injectie (dag 6-7 na opkomst). Melanotisch pseudo-tumoren (figuur 5A en 5B) werden waargenomen door de cuticula van 93,5% van de dsSRPN2 vs. 0% van de dsLacZ volwassen muskieten (figuur 6A). Clusters van donker gemelamineerde weefsel werden geïdentificeerd na dissectie van pigmentvlekken (figuur 5C). Pseudo-tumoren waren zichtbaar op de volwassen cuticula al op dag 3 na het opkomen en waren ook aanwezig in een subset van dsSRPN2 hemolymfe en dierlijke weefsels (gegevens niet getoond). Op 5 na de injectie (vroeg volwassen stadium), aanzienlijk gedaald SRPN2 niveaus in dsSRPN2, maar niet dsLacZ of niet-gespoten hemolymph eiwit isolaten werd waargenomen (figuur 6B).

ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg "/>
Figuur 1: Developmental staging voor pupal dsRNA injectie Vroege pupal injectie van dsRNA resulteert in een optimale overleving en progressie in volwassen stadium.. Lage niveaus van de cuticula pigmentatie (A, links, en B) kunnen binnen de eerste 0-24 uur na verpopping in acht worden genomen. Looien van de pupal cuticula voorgaande injectie (A, midden en rechts) resulteert in een matige tot slechte overleving.

figure-results-1
Figuur 2:. Injectiepositie en verspreiding van kleurstof gemerkte dsRNA (A) Capillaire naald injectie van kleurstof gemerkte dsRNA in de dorsale cuticula onder een hoek van ongeveer 30 °, in anterior naar posterior richting. (B) De kleurstof zichtbaar verdeeld in het popstadium hemolymfe. dsRNA injectie volume van 138 nl, gelabeld met 0,01% FGD (w / v).

figure-results-2
Figuur 3:. Na injectie volwassen exemplaar (A) 70% van poppen geïnjecteerd met 0,01% FGD (w / v) succesvol gebleken (n = 60), vergeleken met 96,7% van de niet-geïnjecteerde controles (n = 60). Drie biologische herhalingen werden uitgevoerd. (B) gedeeltelijk uittreden uit het popstadium werd waargenomen voor een groot aantal niet overlevende muggen. Fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM).

figure-results-3
Figuur 4: Emergence rate, geslacht evaluatie en volwassen overleving (A) Vergelijkbare doorbraaktijden waargenomen na popstadium injectie met 0,01% FGD (24 hr = 80% en 48 uur = 20%), in vergelijking met niet-geïnjecteerde poppen (24. h = 83% en 48 hr = 17%). (B ) ongeveer gelijk mannelijke en vrouwelijke volwassen exemplaar werd waargenomen voor 0,01% FGD geïnjecteerd poppen (vrouwelijk = 48% en mannelijke = 52%) en niet-geïnjecteerde poppen (vrouwelijk = 52% en mannelijke = 48%). (C) Survival analyse blijkt dat de injectie met 0,01% FGD heeft geen invloed op overleving van volwassen dieren, geëvalueerd tot op dag 10 na opkomst. Resultaten representeren gegevens van drie onafhankelijke experimenten met 0,01% FGD geïnjecteerd (n = 60) en niet-geïnjecteerd (n = 60) poppen (gelijk aantal mannen en vrouwen). Fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM).

figure-results-4
Figuur 5: Pseudo-tumor positieve controle fenotype weerspiegelt succesvolle knockdown Pseudo-tumoren werden waargenomen op de (A) en buik (B) thoracale cuticula van dsSRPN2 -injected, maar niet dsLacZ -injected volwassen muggen op dag 8 na injectie..(C) Hogere vergroting (400X) beeldvorming (a) cuticula en dissectie van pigmentvlekken (b) onthult clusters van donker gemelanizeerd cellen.

figure-results-5
Figuur 6: Kwantificering van pseudo-tumorvorming en verlaagde SRPN2 eiwitgehalte (A) popstadium injecties leiden tot pseudo-tumorvorming in 93,5% van dsSRPN2 volwassenen (n = 21) vergeleken met 0% van dsLacZ controles (n = 19). . De resultaten dag 8 na de injectie. (B) Western blot (links) shows daalde SRPN2 niveaus in dsSRPN2, maar niet dsLacZ of niet-gespoten hemolymfe eiwit isolaten (dag 5 na de injectie). Resultaten zijn verkregen met drie onafhankelijke experimenten. Anti-SRPN2 21 en anti-SRPN3 26 antilichaam verdunningen gebruikt waren 1: 1000 en 1: 2000, respectievelijk. Geit anti-raBBIT IgG-HRP (Product sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) werd gebruikt bij 1: 5000. Alle eiwit niveaus werden gekwantificeerd (rechts) door band intensiteit (ImageJ software, NIH, Bethesda, MD), genormaliseerd naar SRPN3, en statistisch vergeleken door ongepaarde t-test. P <0,05: *, p ≥0.05: ns (niet significant). Fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM).

Discussie

De huidige methoden voor het induceren van niet-transgene RNAi in muggen te betrekken directe injectie van dsRNA in de volwassen hemocoel 12,13 of larven voeden van RNAi-trigger-gecoate nanodeeltjes 14-17 of-microalgen gebaseerde dsRNA moleculen 18. Gericht op de volwassen mug, terwijl grote waarde, kan een groot aantal genen die functioneren in eerdere ontwikkelingsperiodes sluiten. Knockdown geïnitieerd door larven inconsistent fenotypen opleveren tijdens het volwassen stadium ten dele, om het potentieel van variabele eiwit persistentie door het popstadium. Derhalve instelling van een aanvullende methode die specifiek is gericht op het initiëren van RNAi in popstadium ontwikkeling een middel om genfuncties bij pre volwassen ontwikkelingsstadia, alsmede verbeterde capaciteiten vollediger beoordeling van genfunctie beoordelen op volwassen stadia verschaffen. Zoals met gen knockdown aanpak op basis van dsRNA injectie of uitdrukking, het voortbestaan ​​van gen knockdownkan niet worden voorspeld. Daarom moet transcript of eiwit niveaus worden beoordeeld op gen van belang tijdens de ontwikkelings periodes van belang. Hoewel we een voortzetting waar van verlaagde eiwitniveaus op dag 5 na injectie van SRPN2 in SRPN2 dsRNA-geïnjecteerde dieren kunnen factoren zoals eiwitten omzet en halfwaardetijd verschillen voor verschillende doelen. Is het essentieel om te garanderen en die de dsRNA te gebruiken voor injectie goed geconcentreerd en wordt intact op een agarosegel. Wij adviseren onderzoekers herwaarderen deze factoren als knock-down resultaten zijn niet voldoende, en de respectieve concentraties van dsRNA kan nodig zijn om empirisch worden getest voor specifieke gen-targets.

We beschrijven een werkwijze voor de initiatie van RNA interferentie in het popstadium van An. gambiae ontwikkeling. Deze werkwijze berust op de invoering via micro-injectie van dsRNA direct in de hemocoel vroege poppen en maakt de beoordeling van de kwaliteit van de injectiegebruik van kleurstof gemerkte dsRNA. De mogelijkheid om injectie kwaliteit visualiseren vormt een belangrijke verbetering voor een geslaagde knockdown en vormt een aspect van injectie genexpressie knockdown dat niet is overwogen meeste eerder gerapporteerd dsRNA-gebaseerde protocollen gericht op het volwassen stadium. Door zich te richten de pop aan het begin van deze ontwikkelingsperiode, genen die een rol spelen in deze kritieke ontwikkeling interval of tijdens het begin van de volwassenheid kan functioneel worden geëvalueerd. Bovendien kan deze werkwijze dsRNA levering aan cellen en vaststelling van RNA interferentie in cellen die toegankelijk tijdens metamorfose zijn mogelijk, maar minder toegankelijk in volledig gevormde volwassen muskieten.

Een recent microarray analyse door Harker et al. (2012) geïdentificeerd 560 An. gambiae transcripten die werden opgereguleerd of down-gereguleerd door ten minste 4-voudig tijdens verschillende ontwikkelingsstadia, van het embryo tot volwassene. De 560 transcripten geïdentificeerd, een set van 309 werd up-gereguleerd tijdens pupal ontwikkeling 27. Deze bevindingen suggereren dat er veel eisen differentiële genexpressie gedurende mug ontwikkeling, waaronder die welke optreden tijdens het popstadium, een interval waarin het organisme ondergaat metamorfose. In veel insectensoorten, waaronder An. gambiae, genen betrokken bij processen zoals ontwikkeling (dat wil zeggen, pupal cuticulaire en chitine-bindende eiwitten) 27-31 en immuunrespons (dwz Toll receptor-achtige eiwitten) 27,32-34 zijn sterk uitgedrukt tijdens de popstadium. Zodra een volledig gevormd volwassene is ontstaan, wordt voortgezet genexpressie als reactie op milieu- en fysiologische veranderingen 35. Met name tijdens de vroege ontwikkeling van volwassenen, is er een toename in de expressie van genen ontwikkelingsstoornissen (dwz volwassen cuticulaire en sarcoplasmische eiwitten) 36, alsook andere belangrijke genen (dwz , Sperma specifiek eiwit en cytochroom P450 metabolisme enzymen) 27,36.

De positieve controle gebruikt bij de ontwikkeling van dit protocol, SRPN2, is An. gambiae serineproteaseremmer (serpine). SRPN2 speelt een belangrijke rol bij de negatieve regulatie van insecten melanisatie een breed spectrum aangeboren immuunrespons bij insecten 21,22. Knockdown van SRPN2 bij volwassen muggen leidt tot pseudo-tumorvorming 21,22, een fenotype dat gemakkelijk wordt waargenomen door het gebruik van licht microscopie. Gezien het feit dat deze verschillende fenotype eenvoudig kan worden gescoord in levende insecten, gebruikten we SRPN2 voor de initiële popstadium RNAi injecties. Bovendien wordt SRPN2 die tijdens alle ontwikkelingsstadia 37, waardoor een goed doelwit voor popstadium RNAi injectie en evaluatie van de functie in de jonge volwassene. We laten zien dat de methode die wij ontwikkeld hebben is kan induceren vergelijkbare volwassen melanotisch pseud vorming o-tumor ten gevolge van dsRNA injecties uitgevoerd tijdens het popstadium ontwikkelingsstadium. Bij de ontwikkeling van dit protocol, hebben we dat de injectie waargenomen tijdens de vroege pupal ontwikkeling (dat wil zeggen, de eerste 24 uur na de larvale-popstadium molt) is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een optimale volwassen opkomst. In het geval dat de slechte opkomst is verkregen na de injectie, raden we enscenering larven met grotere nauwkeurigheid, om poppen te verkrijgen met minder uitgebreid cuticula verharding en verzeker vroege popstadium injectie wordt bereikt. Bovendien, het minimaliseren van schade aan de cuticula resulteert in een optimale opkomst en de toenemende vergroting tijdens de injectie kan ervoor zorgen dat alleen de beoogde regio van het dier wordt aangeprikt. Als de naald door moet prikken aan de ventrale cuticula, bundeling van kleurstof gemerkte vloeistof zichtbaar aan de buitenzijde van de pop worden of zal filtreerpapier verzadigen. Het is ten zeerste aanbevolen om alle poppen die meer dan één cuticula lekke band hebben weggooien.

jove_content "> Met de uitgebreide ervaring van veel laboratoria over de prestaties van volwassen muskieten injecties, kunnen eerder geïdentificeerde micro-injectie benaderingen worden aangepast met eenvoudig protocol aanpassingen voor gebruik in pupal RNAi experimenten. Kortom, het doel van deze methode is onderzoekers de mogelijkheid bieden uitbreiden van de periode gedurende welke reverse genetische analyses kunnen worden uitgevoerd, hierdoor is verdere onderzoek dat de ontwikkeling van nieuwe vector regelstrategieën ondersteunt. Interessant experimenten in andere soorten, zoals Rhodnius prolixus en Spodoptera frugiperda, blijkt dat gen silencing effecten de neiging om veel te groter wanneer gestart tijdens de pre-volwassen stadia 38,39. bij alle ontwikkelingsstadia, RNAi-gemedieerde gen knockdown afhankelijk is van overwegingen met betrekking tot de snelheid en persistentie van genuitschakeling, en de stabiliteit van eiwitten waarvoor gerichte genen. het ideale doel RNAi genen vaak die een Protei coderen zijnn of RNA dat een korte halfwaardetijd en een hoge omloopsnelheid 11,40 heeft.

Terwijl transgene RNAi strategieën eveneens kunnen worden toegepast om overwegingen betreffende snelheid en persistentie van RNAi in pre-volwassen stadia pakken, transgene technieken veel nadelen (bijvoorbeeld tijd nodig voor het genereren van transgene lijnen, experimenteel tijdsbestekken voor muggen paringen insecten genereren met gereguleerde dsRNA meningsuiting, en het onderhoud van transgene aandelen). Daarentegen ons protocol biedt een eenvoudigere en snellere methode voor het initiëren gen knockdown tijdens popstadium ontwikkeling en celtypen die afkomstig zijn toegankelijk tijdens metamorfose maar minder toegankelijk bij volwassenen. Het gebruik van kleurstof gemerkte dsRNA suspensies maakt een eenvoudige evaluatie van injectie succes en verspreiding van geïntroduceerde materiaal in poppen. Onze gegevens betreffende het optreden van tumorvorming in pupal geïnjecteerde volwassenen, vergeleken met dieren geïnjecteerd als volwassenen, is met initiation van RNAi-gemedieerde knockdown tijdens het popstadium. Met behulp van onze G3 mosquito lijn en onder onze insectary voorwaarden, we zien de melanotisch formatie volwassen pseudo-tumor zo vroeg als 10 dagen na de injectie van de volwassenen geïnjecteerd drie tot vijf dagen na opkomst. Door het uitvoeren pupal vroeg stadium injectie, zien we zichtbare melanotische pseudo-tumorvorming al vijf dagen na injectie (dwz 03:57 dagen na opkomst). Deze gegevens impliceren dat deze methode maakt het mogelijk de start van gen knock-down tijdens een eerder onder-bestudeerde ontwikkelingsperiode (dwz pupal ontwikkeling). Onze dye labeling werkwijze kan ook nuttig zijn voor de ontwikkeling van nieuwe larvale injectie protocollen blijken, vanwege de doorschijnende aard van de cuticula gedurende alle larvale stadia. Terwijl de controlegroep in deze studie progressie nodig in volwassen stadium een ​​knockdown fenotype, toekomstige experimenten om popstadium-specifieke fenotype te na injectie van vroege poppen voorzietwaardevol inzicht met betrekking tot de uitbreiding van deze methode in extra ontwikkelings periodes, zoals late pupal ontwikkeling. Kortom, deze methode levert een waardevolle RNAi-protocol voor het popstadium initiatie van RNAi-gemedieerde gen knockdown en breidt de functionele genomische hulpmiddelen beschikbaar voor gebruik binnen de vector insect onderzoeksgemeenschap.

Openbaarmakingen

Open Access voor deze video-artikel wordt betaald door Biogen.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Flaminia Catteruccia en haar onderzoeksgroep (Harvard School of Public Health, Boston, MA) bedanken voor het ter beschikking stellen van ons laboratorium van de G3 kolonie die in dit onderzoek werd gebruikt en voor de LacZ sjabloon DNA. We danken Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) voor zijn hulp bij het onderhouden van het insectarium. Het Biologie Department van Boston College heeft de onderzoekskosten geassocieerd met de ontwikkeling van deze techniek genereus gefinancierd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MEGAscript RNAi kitAmbionAM1626
Nanoject II injectorDrummond3-000-204
Nanoject II foot switchDrummond3-000-026
Borosilicate glass capillariesDrummond3-000-203-G/X
Glass micropipette pullerNarishignePB-7
Fast Green FCF dyeSigmaF7258Kan vervangen worden door een niet-toxische voedselkleurstof.
Plastic transfer pipettesThermo Scientific13711501/4 inch van de punt afgesneden om een bredere opening te creëren.
Whatman "thin" filter paperGE Healthcare1001-090Dit is een diameter van 9 cm Grade 1, maar kan worden aangepast afhankelijk van de grootte van de injectiepad.
Western blot "thick" filter paperBioRad107-3931Dit is het filterpapier dat gewoonlijk wordt gebruikt voor Western blots.
Petri schotels (60 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875713A
Verfkwast (maat 0)Michael's Art10474940Kwastenmaat en merk kunnen variëren op basis van beschikbaarheid en gebruikersvoorkeur.
Dissectielichtmicroscoop---------Dit kan variëren op basis van beschikbaarheid en gebruikersvoorkeur.

Referenties

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , Available from: http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa. Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).
  3. The malERA Consultative Group on Vector Control. A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control. PLoS Med. 8 (1), e1000401(2011).
  4. Enyati, A., Hemmingway, J. Malaria Management: Past, Present, and Future. Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).
  5. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genet. 10 (3), 1004236(2014).
  6. Mitchell, S. N., et al. Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (3), e92662(2014).
  7. Knox, T. B., et al. An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region. Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).
  8. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes. Plant Cell. 2, 279-289 (2002).
  9. Sen, G. L., Blau, H. M. A brief history of RNAi: the silence of the genes. FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).
  10. Romano, N., Macino, G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).
  11. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  12. Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols. Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).
  13. Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A). gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230(2007).
  14. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).
  15. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523(2015).
  18. Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes. Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).
  19. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review. J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).
  20. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: Future in insect management. J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).
  21. Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei. EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).
  22. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  23. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).
  24. Benedict, M. Q. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center. (2014).
  25. Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae. Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).
  26. Michel, K., et al. Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).
  27. Harker, B. W., et al. Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).
  28. Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).
  29. Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization. Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).
  30. Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori. BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).
  31. Zhou, X., Riddiford, L. M. Broad specifies pupal development and mediates the "status quo" action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca. Development. 129, 2259-2269 (2002).
  32. Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).
  33. Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -L. Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).
  34. Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae. Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).
  35. Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus. Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).
  36. Cook, P. E., Sinkins, S. P. Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation. Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).
  37. Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. The serpin gene family in Anopheles gambiae. Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).
  38. Araujo, R. N., et al. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).
  39. Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph. J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).
  40. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

dsRNA injectiegen knockdownpopstadiumontwikkelingmelanotische pseudotumorenSRPN2 eiwithemolymfe injectiekleurstofgelabeld dsRNAfunctionele genomische studies

Gerelateerde artikelen