Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ex vivo Live-Imaging van Lung metastase en hun Microenvironment

12.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53741

⸱

3 februari 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende het tumorcel-stroma interacties binnen longmetastasen, gebruik fluorescente reporters in muizen. Gebruik draaiende schijf confocale microscopie Deze techniek maakt visualisatie van levende cellen gedurende ten minste 4 uur en kan worden aangepast om andere inflammatoire longaandoeningen bestuderen.

Samenvatting

Metastase is een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit. Metastase is een multi-step proces en als gevolg van de complexiteit, de precieze cellulaire en moleculaire processen die metastatische verspreiding en groei regeren zijn nog steeds ongrijpbaar. Levende beeldvorming maakt visualisatie van de dynamische en ruimtelijke interactie van cellen en hun micromilieu. Vaste tumoren vaak uitzaaien naar de longen. De anatomische locatie van de longen vormt een uitdaging voor intravitale beeldvorming. Dit protocol verschaft een relatief eenvoudige en snelle werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende de dynamische interacties tussen tumorcellen en de omliggende stroma binnen longmetastasen. Door deze methode kan de beweeglijkheid van kankercellen en interacties tussen kankercellen en stromale cellen in hun micromilieu worden gevisualiseerd in realtime enkele uren. Door het gebruik van transgene fluorescerende reporter muizen, een tl-cellijn, injecteerbare fluorescent gelabeldemoleculen en / of antilichamen, verschillende onderdelen van de long micro kan worden gevisualiseerd, zoals bloedvaten en immuuncellen. Om het beeld verschillende celtypen, is een draaiende schijf confocale microscoop die langdurige continue beeldvorming met een snelle, vier kleuren beeldacquisitie maakt gebruikt. Time-lapse filmpjes samengesteld uit beelden verzameld over meerdere posities en focale vliegtuigen tonen interactie tussen live-metastatische en immuuncellen gedurende ten minste 4 uur. Deze techniek kan verder worden gebruikt voor chemotherapie of gerichte therapie testen. Bovendien kan deze werkwijze worden aangepast voor de studie van andere long-gerelateerde pathologieën die de long micro beïnvloeden.

Inleiding

Het dodelijkste aspect van kanker is metastase, die verantwoordelijk is voor meer dan 90% van kankergerelateerde morbiditeit en mortaliteit1. Metastase is een proces in meerdere stappen en vanwege de complexiteit ervan, zijn de exacte cellulaire en moleculaire mechanismen die de metastatische verspreiding en groei beheersen nog steeds ongrijpbaar. Om te metastaseren, moeten tumorcellen in de primaire tumor loskomen van hun aangrenzende cellen en basaal membraan, door de extracellulaire matrix gaan, intravaseren, via bloed- of lymfevat reizen, extravaseren op de secundaire locatie en uiteindelijk overleven en secundaire tumoren vestigen. Naast de eigenschappen van de tumorcellen, is de bijdrage van de micro-omgeving, die het aangrenzende stroma omvat samen met de normale tegenhangers van de kankercellen, cruciaal voor het zaaien en vestigen van metastatische laesies2.

Traditionele methoden om metastatische zaaien en groei te bestuderen, onderzoeken statische toestanden, omdat weefsels worden uitgesneden en gesneden voor histologie. Deze gegevens genereren slechts een momentopname van dit zeer dynamische proces. Hoewel er enige bruikbare informatie uit deze studies kan worden gehaald, kan het complexe proces waarbij tumor- en stromacellen interageren tijdens de metastatische vorming niet adequaat worden beoordeeld met deze methoden. Bovendien is het niet mogelijk om inzicht te krijgen in migratiepatronen van tumor- of stromacellen, die belangrijk zijn voor het vestigen van een kolonie op de verre locatie. Om het metastatische proces effectief te bestuderen, is het essentieel om verschillende interacties tussen kankercellen en hun micro-omgeving op een continue manier en in real time te visualiseren.

De long is een veelvoorkomende locatie voor metastasen van solide tumoren zoals borst-, darm-, pancreaskanker, melanoom en sarcoom3. Intravitale beeldvorming werd eerder gebruikt om cel-cel interactie te bestuderen in verschillende primaire tumor- en metastasemodellen4,5. Methoden van longbeeldvorming bij muizen, inclusief intravitale beeldvorming, longsectiebeeldvorming en een ex vivo pulmonaire metastase assay zijn gepubliceerd6–9. Intravitale beeldvorming van muizenlongen maakt gebruik van een thoracale zuigvenster om de longen te stabiliseren6. Deze methode wordt gebruikt voor time-lapse beeldvorming van de longmicrocirculatie en alveolaire ruimtes. De anatomische locatie van de longen vormt een uitdaging voor intravitale beeldvorming. Om toegang tot de longen te krijgen, moet de borstholte worden geopend, wat leidt tot verlies van negatieve druk en ingezakte longen. Deze methode stelt alleen de visualisatie van een klein deel van de longen mogelijk en is technisch veeleisend; een onnodige complicatie in studies die processen onderzoeken die onafhankelijk zijn van de bloedstroom. Bovendien vereist deze methode ook het uitsluiten van beweging veroorzaakt door ademhaling. Dit wordt gedaan door het verzamelen van beelden tussen ademhalingen of tijdens post-beeldverwervingsanalyses10. De alternatieve ex vivo longsectiebeeldvorming biedt stabiliteit en diepte, en bereidt ook het longparenchym voor op immunokleuring7. Echter, het langdurige snijproces leidt tot een uitgebreide vertraging tussen het moment van het doden van het dier en het begin van de beeldvormingssessie. Bovendien veroorzaakt het proces van het snijden van een muizenlong aanzienlijke celdood8, waardoor de kwaliteit en kwantiteit van beeldvormingsmonsters wordt verstoord en misschien onnodig tumor-stroma interacties worden gewijzigd. Om technisch een brug te slaan tussen de methoden van intravitale beeldvorming en longsectiebeeldvorming, terwijl de voordelen van de twee technieken worden benut, werd een relatief snelle en eenvoudige methode voor ex vivo longbeeldvorming ontwikkeld. Deze methode werd bereikt door beeldvorming van niet-gesneden hele longkwabben. Met behulp van deze methode kunnen de mobiliteit van kankercellen evenals interacties tussen kankercellen en stromacellen in hun micro-omgeving in real time gedurende enkele uren worden gevisualiseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle beschreven procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, met inbegrip van de voorafgaande goedkeuring door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Generatie van longmetastasen voor ex vivo Live-Imaging (Transgene of staartader Injection)

OPMERKING: longmetastasen kan worden gegenereerd door gebruik te maken van genetisch gemanipuleerde muismodellen of door intraveneuze (iv) injectie van kankercellen.

  1. Genereer longmetastasen voor de beeldvorming door het kruisen van een genetisch gemanipuleerde tumor muismodel in een transgene reporter muis, bijvoorbeeld, steek de borstkanker muismodel, muis borsttumor virus lange terminale repeat-polyoma midden T-antigeen (MMTV-PyMT) 11 in ACTB-ECFP muismodel 12.
    LET OP: De ACTB-ECFP model tot expressie versterkt cyaan fluorescente eiwit (ECFP) onder de β-actin promotor zodanig dat alle cellen fluoresceren in de blauwe, CFP-kanaal. Maar kankercellen zijn veruit de belangrijkste en verschijnen als een bulk van ECFP-positieve cellen onder de microscoop. De MMTV-PyMT muismodel ontwikkelt progressieve ziekte, waarbij borsttumor groei geassocieerd met de verspreiding van kankercellen naar de omtrek, met name voor de longen. In MMTV-PyMT muizen op de FVB / n achtergrond kan worden waargenomen micrometastasen ongeveer 10-11 weken oud. Over het algemeen zijn deze vooruitgang macrometastases bij ongeveer 14 weken oud 13.
    OF
  2. Genereer experimentele metastasen met behulp van primaire cellen of syngene cellijnen. Gebruik in vitro gemanipuleerde primaire tumorcellen of cellijnen (bijv., Transductie) gevolgd door iv injectie 14.
    1. In het kort, in dit protocol, injecteren een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen (+) MMTV-PyMT cellijn in tl-reporter muizen (ACTB-ECFP) of wild-type muizen. Dan,visualiseren van deze aangeduid als VO-PyMT cellen 15 cellen met behulp van de groene, GFP-kanaal.
      LET OP: De originele VO-PyMT cellijn werd afgeleid aan de Vanderbilt Orthopedie in Nashville, TN. VO staat voor Vanderbilt Orthopedie.
    2. Na de injectie van 10 6 cellen (in 200 pl), acht kankercel extravasatie onmiddellijk tot een paar uur na injectie; observeren micrometastasen tussen 1-3 weken na de injectie en op te sporen macrometastases 3 weken na de injectie 15.
      OPMERKING: Minder cellen kunnen worden geïnjecteerd en het moment van injectie metastatische groei verlengen.

2. Etikettering van componenten van belang in de gemetastaseerde Microenvironment (Transgene en / of Injectables)

OPMERKING: Labeling kan worden bereikt door transgene muizen en / of door verschillende injecties. Zorg ervoor dat u verschillende fluorescerende kleuren te gebruiken voor de etikettering van verschillende celtypen.

  1. Label onderdelen van de metastatische micro-omgeving met behulp van transgene muizen. Steek de eerder genoemde muizen tumormodel (bijv., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) in een transgeen muizenmodel waarin de stromale cellen van belang worden gelabeld door een fluorescerend eiwit dat niet ECFP, bijv., C-fms-EGFP 4,16.
    OPMERKING: Naast de visualisatie van kankercellen in de GVB kanaal, dit maakt visualisatie van myeloïde cellen in de GFP kanaal 4.
    EN / OF
  2. Label verschillende onderdelen van de metastatische micro via injecties in transgene muizen of fluorescente reporter (niet fluorescerende) wildtype muizen.
    OPMERKING: Verschillende verbindingen kunnen worden geïnjecteerd om verschillende onderdelen van de metastatische micro bijvoorbeeld is een AF647-geconjugeerd Gr-1 antilichaam hier gebruikt om neutrofielen label en een aantal monocyten 13 en verschillende moleculaire dextranen worden gebruikt etiketlong haarvaten labelen. Voor de bereiding van deze injecteerbare zie stap 4.

3. Voorbereiding van Materialen Voordat Dissection

  1. 2% Agarose
    1. Weeg 0,2 g agarose en toe te voegen aan 10 ml 1 x PBS. Verwarm de oplossing om de agarose op te lossen. Agarose stollen bij kamertemperatuur, zodat handhaven in een 37 ° C waterbad voor inflatie.
  2. CO 2 en temperatuurregelaar
    1. Controleer DDH 2 O in de bevochtigingskamer. Bijvullen wanneer nodig. Steek configuratie plaat in temperatuur fase plaat houder (klimaatkamer). Schakel de CO 2 controller set CO 2 bij 5%. Zorg ervoor dat de luchtstroom is vastgesteld op 0,4 Nl / min.
    2. Open de lucht en de CO 2 kleppen. Zet de temperatuurregelaar. Zorg ervoor dat de temperatuur van de klimaatruimte en het deksel worden ingesteld op 37 ° C.
    3. Laat de luchtdruk op CO 2 meter. Raadpleeg CO 2 toe, equilibration kan tot 30 min.
  3. Draaiende schijf confocale microscoop
    LET OP: Details van de microscoop set-up zijn eerder beschreven 4,17.
    1. Zet de lasers (argon laser van 488 nm excitatie en het vaste stof 405 nm, 561 nm en 640 nm lasers). Schakel de microscoop, de camera, de draaiende schijf besturingseenheid, de AOTF, de laser besturingseenheid en de camera controller.
    2. Open de microscoop sluiter, zet de computer waarop de microscoop en de software te openen.
  4. Voorbereiding van de tools en dissectie platform.
    1. Schakel de hete kraal sterilisator en laat het bereik 250 ° C. Clean 2 paar chirurgische schaar en pincet met water en zeep. Steriliseer de instrumenten ten minste 30 sec. Laat de instrumenten afkoelen. Gebruik een polystyreen deksel dissectie platform. Bedek het met een stuk van lab soaker.

4. Voorbereiding van de injecties

Opmerking: Afhankelijk van de halfwaardetijd en de gewenste respons, injecteren fluorescerend gemerkte antilichamen en / of fluorescente moleculen hetzij onmiddellijk vóór dieroffer of enkele uren tot dagen voor.

  1. Aan te Gr1-positieve neutrofielen en monocyten, bereidt een injectiespuit met 7 pl stock AF647-geconjugeerd Gr-1-antilichaam (1 mg / ml) in 100 pl steriel PBS onder de motorkap. Plaats een 27 G ½ naald op de spuit.
  2. Aan te long- capillairen, stelt een tweede en derde spuit met 100 ui ofwel 70 kD rhodamine geconjugeerde dextran (4 mg / ml) of 10 kD AF647-geconjugeerde dextran (4 mg / ml). Plaats een 27 G ½ naald op de spuiten.
  3. Spuit de AF647-geconjugeerd antilichaam oplossing iv 5 uur voorafgaand aan de uitsnijding longen '.
  4. Injecteer één of beide dextranen iv onmiddellijk voorafgaand aan excisie longen.

5. Voorbereiding van de longen voor ex vivo Live-Imaging

OPMERKING: Probeer zo steriel en zorgvuldig mogelijk te werken om onnodige uitdagingen van de immuuncellen in de longen te voorkomen.

  1. Injecteer de muis intraperitoneale (ip) met een letale overdosis van een verdovingsmiddel toegelaten door het dier protocol IACUC goedgekeurd, bijv., 1 ml 2,5% Avertin. Wacht tot de muis om te stoppen met ademhalen en zijn volledig niet-reagerend op schadelijke stimuli (achterpoot knijpen).
    OPMERKING: cervicale dislocatie en kooldioxide euthanasie moet worden vermeden omdat dit nadelig kan beïnvloeden long cellevensvatbaarheid.
  2. Immobiliseren de muis op een dissectie board en steriliseer de muis met 70% ethanol.
  3. Gebruik chirurgische schaar eerst een dwarse epigastrische incisie door de huid, gevolgd door een vergelijkbare ingesneden buikvlies maken. Houd de dissectie in verticale stand en snijd de dalende aorta, waardoor bloed zich in de buik en niet in de borstholte.
  4. Ssmoren een kleine opening in het membraan vacuüm op te heffen. Snijden langs de rib 10 en 12 het membraan te snijden en visuele toegang krijgen tot de longen.
  5. Gebruik chirurgische schaar om de huid tot gesneden om de luchtpijp over de ribbenkast, maar laat de ribbenkast intact. Scheid de huid tegen de ribbenkast. Expose de luchtpijp door het verwijderen van het omringende bindweefsel, zorg dat u de luchtpijp zelf (figuur 1a) niet te beschadigen.
  6. Knip een kleine opening van ongeveer 1 mm diameter in het belichte trachea evenwijdig aan de kraakbenige ringen zo dicht mogelijk bij het ​​strottenhoofd mogelijk (Figuur 1B). Wees voorzichtig om niet volledig dwars door de luchtpijp.
  7. Neem een 20 G naald en voorzichtig steek de naald 4-5 mm in de luchtpijp zonder tegenkracht (figuur 1D). Het einde van de naald moet zichtbaar door de luchtpijp (figuur 1C) zijn. Tang om de naald in de luchtpijp te stabiliseren. Alternatief, kan een hechting worden gekoppeld around de luchtpijp om de naald op zijn plaats houden.
    OPMERKING: Door het inbrengen te diep, kan de carina getraumatiseerd of slechts één zijde van de longen kan worden opgeblazen.
  8. Vul een spuit met 400 ul van 37 ° C 2% laagsmeltende temperatuur agarose (rechtstreeks uit een bad van constante temperatuur gehouden). Controleer de dissectie bord staat en langzaam wekt de warme agarose door de naald in de longen Gebruik ~ 400 ul naar de longen op te blazen.
    LET OP: Let op de longen opblazen in de ribbenkast. Niet over-opblazen van de longen als het zal scheuren.
  9. Zodra de longen worden opgeblazen, vullen ~ ⅔ van de ribbenkast, verwijder de spuit en houd de naald in de luchtpijp om te voorkomen dat agarose lekken.
  10. Giet ongeveer 50 ml 20 ° C PBS via opgeblazen longen naar de agarose in de longen te richten en vast laten. Verwijder langzaam de naald en sluit de luchtpijp met een tang om te voorkomen dat niet-gestolde agarose lekken.
  11. Expose de longen door het uitvoeren van een sternotomie en vervolgens de longen te snijden. Voor excisie van de longen, vasthouden aan de trachea terwijl snijden door de luchtpijp geheel. Trek de luchtweg, snijd het bindweefsel en de slokdarm verwijderd en trek de longen uit de borstholte totdat de longen wordt gescheiden van de muis (Figuur 1E).
  12. Dompel de longen in warme RPMI-1640 te wassen excessieve bloed en voorzichtig scheiden de lobben door met een schaar en een tang om de belangrijkste stam bronchiën de lobben 'cut op navel (Figuur 1F).
  13. Plaats de lobben, met het platte vlak naar beneden om beeldvorming oppervlak te maximaliseren, in een putje van een 24-well imaging plaat (figuur 1G). Voeg 100 ul van 37 ° C RPMI-1640 bovenop de lobben. Door diverse 15 mm ronde dekglaasjes microscoop bovenop de lobben om te voorkomen drijven.
  14. Giet warm PBS in de omringende putten de RPMI-1640 media uit evap voorkomenOrating. Plaats de 24-wells plaat in de geëquilibreerde klimaatruimte en onderhouden longkwabben bij 37 ° C met lucht en 5% CO2. Plaats de klimaatruimte op het stadium van de confocale microscoop.
    LET OP: Andere gasmengsels (bijvoorbeeld 5% O 2, 5% CO 2 in N 2 naar cel gedrag onder omstandigheden van hypoxie / lager zuurstofgehalte onderzoeken) kan ook worden overwogen.

figure-protocol-1
Figuur 1. Protocol voor het bereiden van longen levende beeldvorming. (A) Blootstelling van de trachea na bereiding van de muis. (B) Kleine knip gemaakt in de blootgestelde luchtpijp parallel aan het kraakbeen ringen. (C) 20 G naald 4-5 mm in de luchtpijp. (D) instillatie van 400 gl 2% laagsmeltend agarose temperatuur in de longen. (E) Inflated gescheiden longen van de muis. (F) Kwabben gescheiden na inflatie. (G) lobben geplaatst in een putje van een 24-well imaging plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Verwerving en beeldanalyse

OPMERKING: Beelden kunnen met verschillende draaiende schijf confocale microscopen ondersteund door verschillende softwareprogramma's worden verkregen. In dit protocol wordt ofwel μManager met een op maat gemaakte draaiende schijf confocale microscoop of Zen met een in de handel verkrijgbare draaiende schijf confocale microscoop gebruikt voor het verwerven, terwijl Imaris wordt gebruikt voor filmbewerking en analyse.

  1. Acquire beelden met behulp van μManager. Een gedetailleerde stap voor stap protocol voor het verwerven van beelden met behulp van μManager software is eerder beschreven 18.
    OF
  2. Acquire beeldenmet behulp van beeldanalyse-software zoals Zen (zie figuur S1).
    1. Klik op het tabblad 'Zoeken' en kies doelstelling (10x of 20x) in de 'Light Path' gereedschap (figuur S1A, rode doos). Vervolgens klikt u op 'Eyes - DAPI' te kijken naar de GVB-kanaal door het oculair (figuur S1A, blauwe doos). Lokaliseren het monster handmatig met behulp van de microscoop. Klik op 'All Off'after het weefsel is in het midden van het gezichtsveld.
    2. Klik op het tabblad 'Overname' om alle parameters voor het verwerven te stellen.
    3. In de functie 'Channels', klikt u op de knop '+' (figuur S1B, rode doos). Een pop-up menu verschijnt en zoek naar de kleurstof (s) in het monster aanwezig in de 'Dye Database' (figuur S1B). Selecteer de kleurstof en klik op 'Toevoegen'.
      NB: Het programma zal stel alle filters worden geoptimaliseerd. Een kleurstof kan worden verwijderddoor het te selecteren, gevolgd door te klikken op de knop prullenbak (figuur S1B, geel kader).
    4. In de 'Acquisition Mode' menu, set 'Binning' naar 5x5. Dubbelklik op ECFP in het menu kanalen om deze te selecteren. Verlaag het laservermogen tot 20%, zodat het monster niet wordt gebleekt, terwijl het instellen van de parameters voor het overname.
    5. Vink het vakje 'Tiles' in het gedeelte 'Experiment Manager' en de tegels gereedschap verschijnt in de 'Multidimensional Acquisition' hulpmiddel groep (Figuur S1C). Klik op 'Advanced Setup' om de live-beeld te zien van de camera. Klik op de knop 'Add' in de sectie 'Positions' 4 tot 6 posities toe te voegen aan het experiment. Om een ​​positie te verwijderen, selecteert u die positie en klik op de knop prullenbak.
    6. In de 'Acquisition Parameter' gereedschap groep, opent u de 'Focus-strategie' tool, en selecteer 'Absolute Vaste Z-positie 'uit de keuzelijst.
    7. Controleer de Z-Stack box aan de sectie 'Experiment Manager' en de Z-Stack hulpmiddel verschijnt in de 'Multidimensional Acquisition' hulpmiddel groep (Figuur S1D). Dubbelklik op een van de posities in de rubriek 'Posities' en druk op 'Live'. Eerst handmatig instellen en laatste positie van het veld imaging. Stel het interval 4 urn.
      NB: Het programma zal het aantal plakken voor het gekozen bereik en de interval te bepalen. Idealiter 5-7 schijfjes zijn handig om voldoende visualisatie en snelle beeldacquisitie mogelijk te maken.
    8. Controleer de doos van de 'Time Series' in de sectie 'Experiment Manager'. Stel de gewenste 'Duur' en 'Interval' keer in instrument van de 'Time Series', dat verscheen in de 'Multidimensional Acquisition' hulpmiddel groep (Figuur S1E).
    9. In de 'acquisitietie Mode 'menu, set' Binning 'naar 2x2. Dubbelklik op een fluorofoor in het menu kanalen om deze te selecteren en verhoging van de laservermogen tot 100%. Druk op 'Live' en stel de 'Exposure Time'. Herhaal dit voor elke fluorofoor.
    10. Controleer de 'Enable Auto Save' box. Selecteer een map en typ de naam van het bestand. Alle verkregen beelden wordt automatisch opgeslagen in deze map.
    11. Klik op 'Start Experiment' in het gedeelte 'Experiment Manager' om het beeld acquisitie te beginnen.
  3. Na beeldacquisitie, compileren de ruwe data in Imaris software. Afbeeldingen converteren bestanden ims en aanpassingen kunnen worden gemaakt. Een gedetailleerde stap voor stap protocol voor het omzetten van bestanden, het maken van aanpassingen en het opslaan van films met behulp van Imaris is eerder beschreven 18.
  4. Bij het opslaan van de film, zet de 'Frame Rate' tot 5 frames per seconde (fps).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van spinning-disk confocale microscopie, diverse muismodel systemen en injectables, kan de metastatische micro-omgeving worden gevisualiseerd en bijgehouden in de tijd. Met een MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP triple transgeen muismodel, verschillende cellulaire componenten worden fluorescent gelabelde (Figuur 2A, Movie 1). De typische structuur van het longparenchym kan worden gevisualiseerd in de GVB kanaal omdat alle cellen brengen ECFP onder β-actine promoter. Gr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerde methode voor ex vivo live-beeldvorming van de long metastase in muismodellen van metastase. Deze beeldprotocol een directe visualisatie van de dynamische en ruimtelijke tumorcel-stroma interacties binnen de long micro. Het is een relatief eenvoudige en snelle methode die betrouwbare beeldvorming van longmetastase gedurende ten minste 4 uur mogelijk maakt. Films verkregen uit deze experimenten kan worden gebruikt om dynamische processen celmotiliteit en cellulaire int...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met IACUC goedgekeurde protocollen, UCSF.

Dankbetuigingen

We danken Nguyen H. Nguyen voor haar technische hulp en Audrey O’Neill voor ondersteuning met de Zeiss Cell Observer spinning-disk confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door een postdoctorale fellowship van het Department of Defense (W81XWH-11-01-0139) en het Weizmann Institute of Science-National Postdoctoral Award Program for Advancing Women in Science (voor V.P.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MMTV-PyMT/FVB muizenJackson Laboratory2374Vrouwelijke muizen
ACTB-ECFP/FVB muizenUCSF Werb labVrouwelijke muizen
c-fms-EGFP/FVB muizenUCSF Werb labVrouwelijke muizen
FVB muizenJackson Laboratory1800Vrouwelijke muizen
GFP+ VO-PyMT cellenUCSF Werb lab
70.000 kDa Dextran, rhodamine-geconjugeerdInvitrogenD1818Verdun tot  4mg/ml in 1 x PBS en bewaar bij -20  °C. Gebruik 0,4 mg per dier. 
10.000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 geconjugeerdInvitrogenD22914Verdun tot  4mg/ml in 1 x PBS en bewaar bij -20  °C. Gebruik 0,4 mg per dier. 
Anti-muis Gr-1 antilichaam Alexa Fluor 647UCSF Monoklonaal antilichaamkernVoorraad 1mg/ml. Gebruik 7 ug per dier.
Anesthetisch middelAnesthesie goedgekeurd door IACUC, gebruikt voor anesthesie en/of euthanasie
1X PBSUCSF cellcultuurfaciliteit
PBS, USP steriele Amresco INCK813-500MLUltra zuivere kwaliteit voor i.v. injectie
Styrofoam platformWordt gebruikt als dissectiebord
Fijne schaar scherp Fine Science Tools14060-11
PincetRoboz Surgical StoreRS-5135
Hete parel sterilisatorFine Science Tools18000-45AAN 30 minuten voor gebruik inschakelen
LuchtUCSF
ZuurstofUCSF
KoolstofdioxideUCSF
1 mL spuit zonder naald BD309659
27 G x 1/2 naald  BD305109voor i.v. injectie
20 G x 1 naald, kort snijvlak  BD305178
Laag smeltende temperatuur agarose Lonza50111Om 10 ml oplossing te maken, weeg 0,2 g agarose, voeg toe aan 10 ml 1 x PBS en verwarm om op te lossen. Agarose zal bij kamertemperatuur stollen, dus houd het in een 37 °C waterbad tot het wordt gebruikt voor inflatie.
RPMI-1640 medium zonder fenolroodLife Technologies11835-030
24 wel imagingplaat E&K scientificEK-42892
Glazen dekglas, 15 mm Fisher Scientific22-031-144
Digitale CO2- en temperatuurregelaarOkolabDGTCO2BXhttp://www.oko-lab.com
KlimaatkamerOkolabhttp://www.oko-lab.com
Cell Observer draaiende schijf confocale microscoopZeiss
Zen softwareZeiss
Omgekeerde microscoopCarl Zeiss IncZeiss Axiovert 200M
ICCD cameraStanford PhotonicsXR-Mega-10EX S-30
Confocale scankop met draaiende schijfYokogawa CorporationCSU-10b
ImarisBitplane
mManagerVale lab, UCSFOpen-source software

Referenties

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  7. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
  8. Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
  9. Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  10. Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
  11. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  12. Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  13. Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
  14. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
  15. Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
  16. Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  17. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
  18. Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
  20. Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
  21. Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
  23. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  24. Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
  25. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
  26. Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
  27. Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
  28. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
  29. Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Interacties tussen tumor en stromaspinning disk confocale microscopiefluorescente reportermuizentime-lapse imagingmobiliteit van kankercelleninteracties tussen immuuncellenagarose longinflatievisualisatie van de micro-omgeving
Ex vivo Live-Imaging van Lung metastase en hun Microenvironment
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.