Methodenartikel

Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo's

DOI:

10.3791/53747

⸱

19 februari 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technieken worden beschreven aan fosfo-epitopen geheel zebravis embryo immunostain en voert vervolgens twee kleuren fluorescerende confocale lokalisatie in cellulaire structuren zo klein als primaire cilia. De technieken voor de vaststelling en beeldvorming kan de locatie en de kinetiek van het uiterlijk of interactie met specifieke eiwitten te bepalen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De snelle proliferatie van cellen, de weefsel-specifieke expressie van genen en het ontstaan ​​van signaleringsnetwerken karakteriseren vroege embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. De kinetiek en de locatie van de signalen - zelfs binnen enkele cellen - in het zich ontwikkelende embryo een aanvulling op de identificatie van belangrijke ontwikkelingsstoornissen genen. Immunokleuring technieken beschreven die is aangetoond dat de kinetiek van intracellulaire en hele dieren signalen structuren zo klein als primaire cilia definiëren. De technieken voor het fixeren, beeldvorming en verwerking beelden met behulp van een laser-scanning confocale microscoop verbinding kan in slechts 36 uur worden voltooid.

De zebravis (Danio rerio) is een gewenst organisme voor onderzoekers die proberen om studies uit te voeren in een gewervelde soorten die betaalbaar is en voor de menselijke ziekten tegen te gaan. Genetische knockouts of knockdowns moet worden bevestigd door het verlies van de werkelijke eiwit product. Deze bevestiging van eiwitverlieskan worden bereikt met de hier beschreven technieken. Aanwijzingen in signaalroutes kunnen worden ontcijferd door gebruik van antilichamen die reageren met eiwitten die post-translationeel zijn gemodificeerd door fosforylering. Het behoud en het optimaliseren van de gefosforyleerde toestand van een epitoop is daarom van cruciaal belang voor deze vaststelling en wordt bereikt door dit protocol.

Deze studie beschrijft technieken voor embryo vast gedurende de eerste 72 uur van ontwikkeling en co-lokaliseren verschillende relevante epitopen met trilharen in Kupffer de blaasjes (KV), de nieren en het binnenoor. Deze technieken zijn eenvoudig, hoeft dissectie vereisen en kan in een relatief korte tijd worden voltooid. Projecteren image confocale stacks in een enkel beeld is een nuttig middel van de presentatie van deze gegevens.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven technieken zijn het resultaat van studies die hebben geprobeerd om downstream-doelen van Ca2+-signalen te definiëren tijdens gebeurtenissen die optreden tijdens vroege ontwikkeling, waaronder bevruchting, gastrulatie, somietogeneze en de vorming van romp, ogen, hersenen en organen.1-3 De oorspronkelijke ontdekkingen van embryonaal Ca2+-signalering waren afhankelijk van het gebruik van natuurlijke en gemodificeerde Ca2+-indicatoren, zoals aequorin4 en fura-2.5 Zelfs met de huidige technologie vereist de detectie van tijdelijke verhogingen van Ca2+ omslachtige analytische hulpmiddelen en onthult niet de doelen van dergelijke Ca2+-signalen.

Dit laboratorium onderzoekt Ca2+-signalen die werken via de Ca2+/calmodulin-afhankelijke (multifunctionele) eiwitkinase die bekend staat als CaMK-II, een enzym dat verrijkt is in het centrale zenuwstelsel en oorspronkelijk werd geïdentificeerd als een regulator van langdurige versterking.6 CaMK-II is niet hersenspecifiek, wordt wijd verspreid en is zeer geconserveerd gedurende het hele leven en de lichamen van soorten in het hele dierenrijk, inclusief ongewervelden.7,8 CaMK-II heeft de unieke capaciteit om zijn eigen activiteit te onderhouden, zelfs nadat de Ca2+-niveaus zijn verminderd vanwege zijn vermogen om zichzelf te autofosforyleren op Thr287. In deze autofosforyleringstoestand blijft CaMK-II actief op een Ca2+/CaM-onafhankelijke manier, totdat het wordt gedefosforyleerd.6 Dus, de lokalisatie van gefosforyleerd CaMK-II (Thr287) kan cellen identificeren waarin natuurlijke, relevante Ca2+-verhogingen hebben plaatsgevonden.

Een antilichaam tegen autofosforyleerd (P-Thr287) zoogdier CaMK-II is goed gekarakteriseerd en werd aanvankelijk gebruikt om geactiveerd CaMK-II in hersenweefsel te lokaliseren.9 Zebravissen (Danio rerio) hebben zeven CaMK-II-genen10,11 waarvan de eiwitproducten een sequentie van MHRQE[pT287]VECLK bevatten in dit gebied.10,11 Deze sequentie is zeer vergelijkbaar met de fosfopeptide-antigeen die werd gebruikt om dit konijnenpolyklonaal antilichaam te maken (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) en daarom was het niet verrassend dat dit antilichaam cross-reageerde met zebravis CaMK-II. Dit laboratorium toonde aan dat dit antilichaam reageert met zebravis CaMK-II in verhouding tot autofosforylering en Ca2+/CaM-onafhankelijke activiteit.12 Aanvullende pan-specifieke CaMK-II-antilichamen zijn ook gebleken cross-te reageren met zebravis CaMK-II.13

Dit antilichaam is gebruikt om aan te tonen dat zebravis CaMK-II preferentieel wordt geactiveerd in cellen aan één kant van de Kupffer's Vesicle (KV) van de zebravis, het gecilieerd orgaan dat noodzakelijk is voor het vaststellen van links/rechts asymmetrie.12 Dit antilichaam werd gebruikt om aan te tonen dat CaMK-II tijdelijk wordt geactiveerd in vier aangrenzende cellen aan de linkerkant van de KV tijdens exact dezelfde ontwikkelingsfase dat de orgaanpositionering wordt bepaald.12 Naast de Kupffer's Vesicle (KV) werd autofosforyleerd (P-T287) ook gevonden op specifieke intracellulaire locaties in andere gecilieerd weefsel, waaronder de nier, neuromasts en binnenoor.12,13 In de nier van de zebravis is P-T287-CaMK-II verrijkt langs de apicale rand van gecilieerd ductaal cel en binnen cloacaal cilia waar het hun samenstelling beïnvloedt.13 Ten slotte, in het zich ontwikkelende binnenoor, is P-T287-CaMK-II intens geconcentreerd aan de basis van cilia en beïnvloedt het celdifferentiatie via de Delta-Notch signaalweg.14 Samenvattend, heeft de detectie van geactiveerd CaMK-II locaties van intracellulaire Ca2+-afgifte geïdentificeerd en potentiële nieuwe signaalroutes verlicht.

Deze ontdekkingen waren volledig afhankelijk van de ontwikkeling van een gevoelige en nauwkeurige methode om geactiveerd (P-T287-autofosforyleerd) CaMK-II te lokaliseren. De methoden om de zebravis KV, nier en binnenoor te fixeren en immunokleuring zijn beschreven. De beperkingen van deze techniek worden ook beschreven. Deze technieken zouden nuttig moeten zijn voor elke onderzoeker die hoge resolutiebeelden in twee fluorescentiekanalen wil verkrijgen, niet alleen van fosfo-epitopen, maar van elk epitoop, tijdens vroege ontwikkeling van gewervelde dieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis procedures in dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Virginia Commonwealth University.

1. Bereiding van reagentia

  1. 4% PFA / PBS. Weeg 8 g paraformaldehyde (PFA) in de zuurkast. Hoewel nog steeds in de zuurkast, Los de droge PFA in ~ 80 ml ​​gedestilleerd H 2 O onder roeren en verwarmen tot 50 ° C. Voeg al roerend 3-10 druppels verse 1N NaOH totdat PFA volledig is opgelost en oplossing verduidelijkt. Haal van het vuur en voeg 100 ml 2x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Breng het volume op 200 ml met gedestilleerd H2O Afkoelen tot kamertemperatuur en bevestigen pH van 7,4 voor gebruik. Bewaren in het donker bij 4 ° C, maar binnen één week.
  2. Gebruik 100% methanol zonder supplementen. Gebruik 95% ethanol zonder supplementen.
  3. Bereid fosfaat gebufferde Tween (PBT). Supplement fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% Tween-20. Voeg 0.5 ml van een 20% Tween-20 stockoplossing aan 100 ml 1x PBS. Bewaar bij kamertemperatuur.
  4. Bereid fosfaat gebufferde Triton-X (PBTx). PBS aangevuld met 0,1% Triton X-100. Voeg 0,5 ml van een 20% Triton X-100 bouillon aan 100 ml PBS. Bewaar bij kamertemperatuur.
  5. Bereid 10% NGS / PBTx. Normaal geitenserum (NGS) blokkeert aspecifieke bindingsplaatsen. WINKEL NGS in aliquots bij -20 ° C. Om gebruik te maken, voeg 1 ml tot 9 ml PBTx.
  6. Bereid 50% glycerol / PBS. Meng gelijke delen van 2x PBS en 100% glycerol. Bewaar bij kamertemperatuur.

2. Embryo Fixatie

  1. . (Bijv., Β-actine: CAAX-GFP) vermeerderingsbedrijf verkrijgen wild type (AB en WIK) of transgene embryo's door middel van natuurlijke paringen. Desgewenst injecteren embryo's met constructen of morfolino's, zoals beschreven. 15,16
  2. Verhogen embryo. Verzamel embryo en incuberen bij 28,5 ° C bij aanwezigheid van 0,003% 1-fenyl-2-thioureum (PTU) pigmentatie te blokkeren zoals beschreven. 17 p>
  3. Fix. Wanneer embryo's het gewenste ontwikkelingsstadium, 18 hebben bereikt,   verdoven van de embryo's met behulp van MESAB, verwijder zoveel systeem mogelijk water en voeg vers 4% PFA / PBS gedurende 3-4 uur bij kamertemperatuur. LET OP: Op sommige momenten minder dan 20 uur na de bevruchting (HPF), vast te stellen voorafgaand aan dechorionation. Op sommige momenten na 20 HPF, dechorionate voorafgaand aan de fixatie met behulp van twee paren van fijne punt pincet onder een dissectie microscoop.
  4. Het veranderen van oplossingen. Transfer embryo's met behulp van een breed boring pipet, zoals beschreven. 17 Change oplossingen in 1,5 ml afgesloten microcentrifugebuizen, simpelweg doordat embryo's om zich te vestigen door de zwaartekracht zonder centrifugeren.
  5. Post-fixeermiddel na 3 -. 4 uur, verwijder PFA / PBS, te vervangen door 100% methanol en bewaar bij -20 ° C gedurende ten minste 48 uur. LET OP: Voor maximale P-CaMK-II immunoreactiviteit, beperken de totale methanol opslagtijd een week.
"> 3. Immunokleuring Whole Embryo's

  1. Plaats een minimum van 10 embryo's voor elke experimentele conditie in bedekte 1,5 ml microcentrifugebuis en label ze.
  2. Laat de embryo's om zich te vestigen. Verwijdert en weggooit methanol en hydrateren met progressieve wassen met 0,5 ml van afnemende concentraties ethanol, zoals aangegeven in de volgende stap. Elke stap is een 5 minuten wassen met schommelen.
  3. Geleidelijk te hydrateren met deze 5-oplossingen: 66% ethanol / 33% PBTx, 33% ethanol / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (dit is de eerste herhaling van PBTx), 100% PBTx (dit is de tweede herhaling van PBTx).
  4. Verwijder laatste PBTx wassen. Voeg 0,5 ml 10% NGS / PBTx. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij RT met zachte wiegen en verwijder en gooi oplossing.
  5. Bereid primaire antilichaam-oplossing door verdunning in 10% NGS / PBTx. Als co-immunokleuring, gebruik hogere affiniteit antilichaam eerste. Voor deze studie incuberen met muis anti-geacetyleerde tubuline monoklonaal antilichaam verdund 1: 500. voor example, als er 10 monsters Combineer 6 pi van de stock antilichaamoplossing met 3 ml 10% NGS / PBTx en distribueren 0,3 ml van het in elke buis.
  6. Voeg 0,2-0,5 ml van het verdunde primaire antilichaam aan elke buis om alle embryo dompelen. Incubate met zachte rockende O / N bij RT.
  7. In de ochtend, te verwijderen en gooi antilichaam oplossing. Voeg 0,5 ml 2% NGS / PBTx weg te wassen overtollige primaire antilichaam. Schud gedurende 5 minuten. Verwijder en gooi oplossing. Herhaal dit twee keer.
  8. Dim verlichting en vul de juiste fluorescent-geconjugeerd secundair antilichaam in 10% NGS / PBTx zodat elke conditie ten minste 0,5 ml. Met muizen anti-geacetyleerde tubuline primair antilichaam, gebruikt de groene fluorescente kleurstof geit anti-muis IgG bij een 1: 500 verdunning.
  9. Incubeer secundair antilichaam gedurende 4 uur met zachte schommelen bij kamertemperatuur in het donker. Van nu af aan, het proces monsters onder gedimd licht en incubeer in een donkere container of door het wikkelen in aluminiumfolie.
  10. Aan het einde van de incubatie Verwijder de secundaire antilichaamoplossing. Voeg 0,5 ml 2% NGS / PBTx te wassen. Schud gedurende 5 minuten. Verwijder en gooi oplossing. Herhaal dit twee keer.
  11. Als gelijktijdige immunokleuring op door het tweede primaire antilichaam van een andere soort dan de eerste primaire antilichaam. In deze studies, volgt het konijn anti-fosfo CaMK-II antilichaam door de rode fluorescerende kleurstof-geconjugeerd geit anti-konijn IgG secundair antilichaam.
  12. Verdun konijn anti-fosfo CaMK-II-antilichaam 01:20. Voor elke buis van embryo's, op te schorten in 0,3 ml 10% NGS / PBTx, voeg dan 15 ul van de voorraad antilichaam oplossing.
  13. Zorg ervoor dat de embryo's worden ondergedompeld en de lichten worden gedimd. Incubate met zachte rockende O / N bij kamertemperatuur in het donker.
  14. In de ochtend onder dimlichten, te verwijderen en gooi antilichaam oplossing. Voeg 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Schud gedurende 5 minuten. Verwijder en gooi oplossing. Herhaal dit twee keer.
  15. Houd overhead lichten dimmen en verdun genoeg van de juiste fluorescent-conjugated secundair antilichaam zodat elke conditie ten minste 0,5 ml. In deze studie verdunnen rood-fluorescerende kleurstof-geconjugeerd geit anti-konijn IgG secundair antilichaam (rood kanaal) 1: 500 in 10% NGS / PBTx.
  16. Incubate tweede secundaire antilichaam gedurende 4 uur met zachte schommelen bij kamertemperatuur in het donker.
  17. Aan het einde van deze incubatie en onder dimlichten, Verwijder de secundaire antilichaamoplossing. Voeg 0,5 ml PBTx. Schud gedurende 5 minuten. Verwijder en gooi oplossing. Herhaal dit twee keer. Store in beide PBTx of 50% glycerol / PBS, afhankelijk van de beeldvorming procedure.

4. Confocale Imaging and Processing

  1. Mount embryo's voor imaging. Place 1-5 embryo's op een glasplaatje. Een ruimte tussen de belangrijkste dekglaasje en schuif gebruik dekglaasje fragmenten aan weerszijden van de kamer. Gewoonlijk worden vier # 1 dekglaasjes gebruikt om deze spacer stapels te maken zonder dat ze sluiten.
    OPMERKING: Geen montage medium nodig is.
  2. Gebruik een 100X olie-immersiedoelstelling enkel embryo in beeld te brengen met behulp van uitgezonden licht. Schakel het licht. Schakel de confocale microscoop. Zorg ervoor dat de juiste lasers (groen en / of rood) worden ingeschakeld en op afstand de focus medeplichtige is ingeschakeld.
  3. Zet de confocale programma. In de "Acquire bar," selecteert u de eigenlijke doel. In de "XY Basic" bar, ingesteld beeldformaat 1024 door te klikken op de knop 1024.
  4. In de "Laser en Detector" bar, klikt u op de rode 488 doos en de groene 568 box aan te zetten laser en de detector voor elk kanaal. Stel pinhole tot medium en pas de winst in de "Gain" bar van elk kanaal te visualiseren.
  5. In de "Acquire Settings" bar, klikt u op "Live" om te beginnen met het verwerven van beelden. In de "View Settings" bar, vinkt u het vakje "Force Integral Zoom" naar het centrum in het venster "Live".
  6. In de "Acquire Settings" bar, onder het tabblad "Z", stap door de lagen van het beeld. Na het selecteren van de number optische secties op te nemen in het beeld te verplaatsen naar een bepaald punt in het "centrum" van de z-vlak.
  7. Onder het tabblad "Z", klikt u op de kleine rode "Reference" box. Dit zal de RFA nul op het gekozen als het "centrum" point. In het vak "Step Size", selecteert u de dikte van de lagen (tussen 0,25 pm en 2,0 um is ideaal). Besteed aandacht aan de box "File Size" en proberen te beperken tot 1 GB.
    OPMERKING: Gewoonlijk tot 40 optische secties van 0,5-1,0 urn verkregen, maar het aantal secties kan empirisch worden bepaald.
  8. Naar de top uiterste van de afbeelding te vinden, klikt u op de cirkel naast "Top" en bewegen door de z-lagen. Klik nu op de cirkel naast "Bottom", zal de computer het beeld terug naar de laag in het midden. Weer bewegen door de lagen onder extreme van de afbeelding te vinden.
  9. Klik op "leven" opnieuw in de "Acquire Settings" in om de laser te stoppenovername. In dit paneel, klik op de rode dozen gelabeld Gemiddeld en Z-stack. Deze dozen wordt groen.
  10. In het vak "Acquire Settings", klik op "Single" om de hele serie beelden te verwerven. U kunt de voortgang te bewaken als het scant in beide kanalen en door de gehele z-stack.
  11. Om op te slaan, klikt u op het venster volume en klik op "opslaan als" en de naam van het bestand. Opslaan als een ".ids" bestand. Om het volume van het bestand te maken, terwijl de z-stack is nog open, selecteert u de gegevens pull-down menu en klik op "volume te maken". Sla het bestand weergegeven als een tiff-bestand. Dit is het geprojecteerde beeld die worden getoond in deze publicatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimale voorwaarden voor het visualiseren Phospho-epitopen

Methoden beschrijven de immuunlokalisatie eiwit epitopen in zebravisembryo's relatief dun vergeleken met die voor het lokaliseren via mRNA in situ hybridisatie. Fixeermiddelen gebruikt lokaliseren eiwit epitopen haarcellen van zebravis embryo's onder 4% PFA / PBS en Dent's fixatief, dat een mengsel van methanol en DMSO. 19

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De PFA / methanol methode die in dit laboratorium met het hoofddoel van optimale immuunlokalisatie van de fosfo-T 287 -CaMK-II epitoop in zebravis ontwikkeling. Deze methode succesvol gelokaliseerde P-CaMK-II tijdens de vorming van verschillende trilharen organen waaronder de zebravis KV, 12 binnenoor 14 en nieren. 13 Met name in het stadium KV Deze techniek noodzakelijk was. Het succes van deze werkwijze is waarschijnlijk te wijten aan een combinatie van a) beperking van auto...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation subsidie ​​IOS-0817658.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-phenyl-2-thioureum (PTU)SigmaP-76290.12% Stockoplossing. Verdun 1:40 in systeemwater
Alexa488 anti-muis IgGLife TechnologiesA11001Geiten polyklonaal, gebruik bij 1:500
Alexa488 anti-konijn IgGLife TechnologiesA11008Geiten polyklonaal, gebruik bij 1:500
Alexa488 phalloidinLife TechnologiesA12379Bindt bij voorkeur aan F-actine
Alexa568 anti-muis IgGLife TechnologiesA11004Geiten polyklonaal, gebruik bij 1:500
Alexa568 anti-konijn IgGLife TechnologiesA11011Geiten polyklonaal, gebruik bij 1:500
anti-acetyleerde α-tubulineSigmaT7451Muis monoklonaal, gebruik bij 1:500
anti-fosfo-T287 CaMK-IIEMD Millipore06-881Konijn polyklonaal, gebruik bij 1:20
anti-totaal CaMK-IIBD Biosciences611292Muis monoklonaal, gebruik bij 1:20
EthanolFisherS96857Labkwaliteit, 95% gedenatureerd
PincettenFine Science Tools11252-20Dumont #5
Glazen dekglasjesVWR16004-330#1  dikte
Glazen microscoopglaasjesFisher12-550-15Standaard glasplaatjes
MethanolFisherA411Bewaar in de vriezer
MicrocentrifugebuisjesVWR20170-038Buisjes met dop, niet steriel
Normaal geitenserumLife Technologies16210-064Deel in 1 ml buisjes, bewaar in de vriezer
ParaformaldehydeSigmaP-6148Reagenskwaliteit, kristallijn
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Quality Biological119-069-13110x stockoplossing of zelf gemaakt
Triton X-100SigmaBP-15110% oplossing in water, bewaar bij RT
Tween-20Life Technologies8511310% oplossing in water, bewaar bij RT
Compound microscoopNikonE-600Gemonteerd op trillingsvrije tafel
C1 Plus twee-laser scanning confocalNikonC1 PlusWordt aangestuurd door EZ-C1 programma, maar upgrades gebruiken "Elements"

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113(2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115(2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644(2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Confocale microscopiePFA methanolfixatiegeacetyleerd tubulinegefosforyleerd CaMKIIblaasje van Kupfferwhole mount imaginglaserscanning

Gerelateerde artikelen