Het doel van dit protocol is om de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker in vitro die gemengde kweken die zowel tumor- en non-tumorcellen beoordelen.
Methodenartikel
Het beoordelen van specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een methode voor de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker in vitro middels kweken die zowel tumor- en non-tumorcellen aangetoond. Centraal staat de kwantitatieve bepaling van een tumor-specifieke genetische verandering ten opzichte van een universele sequentie met een dual-probe digitale PCR en de daaropvolgende berekening van het percentage van tumorcellen. De test wordt uitgevoerd op een kweek die tumorcellen van een gevestigde lijn en droeg spiked-in niet-tumorcellen. De gemengde kweek wordt behandeld met een testgeneesmiddel in verschillende concentraties. Na de behandeling wordt DNA rechtstreeks bereid uit de overleefden klevende cellen in putjes van 96-putjes platen met behulp van een eenvoudige en goedkope werkwijze en onderworpen aan een dual-probe digitale PCR-test voor het meten van een tumor-specifieke genetische verandering en referentie universele sequentie . In deze demonstratie wordt een heterozygote deletie van het NF1 gen als tumor-specifieke genetische verandering eneen RPP30 gen als het referentie-gen. De verhouding NF1 / RPP30, werd het percentage tumorcellen berekend. Aangezien de dosis-afhankelijke verandering van het aantal tumorcellen verschaft een in vitro indicatie voor specificiteit van het geneesmiddel, dit genetische en op cellen gebaseerde in vitro assay waarschijnlijk toepassingsmogelijkheden in drug discovery. Verder is het voor gepersonaliseerde kanker-care kan dit genetisch en op cellen gebaseerde hulpmiddel een bijdrage leveren aan het optimaliseren van adjuvante chemotherapie door middel van het testen van de werkzaamheid en de specificiteit van kandidaat-medicijnen met behulp van primaire kweken van individuele tumoren.
Inleiding
De therapeutische effecten van geneesmiddelen tegen kanker op tumorcellen worden geassocieerd met verschillende ongewenste toxische effecten op niet-tumorcellen. Giftige effecten zijn moeilijk te beoordelen in het laboratorium, grotendeels vanwege het ontbreken van geschikte hulpmiddelen1. Celculturen die zowel tumor- als niet-tumorcellen bevatten, zouden een potentiële in vitro bron kunnen zijn voor het beoordelen van de specificiteit of selectiviteit van een geneesmiddel, wat licht kan werpen op klinische toxiciteit. Echter, conventionele in vitro assays zoals proliferatie- of levensvatbaarheidsassays meten het effect van een geneesmiddel op het totaal aantal cellen, maar kunnen het effect niet verdelen in het deel op tumorcellen en het deel op niet-tumorcellen. Bijvoorbeeld, een 50% reductie van het totale aantal cellen in een cultuur bestaande uit 50% tumorcellen en 50% niet-tumorcellen kan de dood van alle tumorcellen betekenen, de dood van alle niet-tumorcellen of, waarschijnlijker, de dood van delen van beide in verschillende verhoudingen.
Ook vanwege dit technische probleem zijn primaire culturen die tumor- en niet-tumorstromacellen bevatten, vaak ongeschikt voor het testen van geneesmiddelen. Aan de andere kant, vanwege deze cellulaire heterogeniteit, lijken primaire culturen veel beter op hun oorspronkelijke tumoren dan klonale cellen in gevestigde cellijnen2. Belangrijker nog, primaire culturen zijn patiëntspecifiek en kunnen geïndividualiseerd geneesmiddelentesten mogelijk maken2-4.
Een essentiële kwestie is daarom de ontwikkeling van een methode voor het bepalen van het aandeel tumorcellen in gemengde culturen, inclusief primaire culturen. Om deze uitdaging aan te gaan, werd een genetische oplossing bedacht die gebaseerd is op de bepaling van de kwantitatieve verhouding van een tumorspecifiek genetisch kenmerk tot een universele referentiesequentie. Uit deze verhouding kan het aandeel tumorcellen in een gemengde cultuur worden berekend.
Deze studie illustreert de procedure van het genetische en cel-gebaseerde hulpmiddel voor het beoordelen van de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker, inclusief (1) het voorbereiden van een gemengde cultuur van tumorcellen van een gevestigde lijn en niet-tumor fibroblasten, (2) het behandelen van de gemengde cultuur met een testgeneesmiddel, (3) het voorbereiden van DNA voor digitale PCR, (4) het bepalen van de verhouding van een tumorspecifieke heterozygote deletie tot een referentiesequentie met behulp van een dual-probe droplet digitale PCR-assay, (5) het berekenen van de verhoudingen van tumorcellen bij elke geneesmiddelconcentratie en (6) het opstellen van dosisafhankelijke veranderingen in het aandeel tumorcellen.
Protocol
1. Voorbereiding Mix Cultuur die zowel tumorcellen en niet-tumorcellen
- Gebruik tumorcellen uit een gevestigde cellijn MPNST S462 5. Gebruik fibroblasten de niet-tumorcellen 6,7
- Cultuur zowel tumorcellen en fibroblasten in standaard DMEM-medium met 10% foetaal runderserum (BSA), 3 mM glutamine, 0,1 mM 2-mercaptoethanol, 500 U / ml penicilline, 500 g / ml streptomycine en 1 mM natriumpyruvaat bij 37 ° C en 5% CO 5-7 februari. Op sub-samenvloeiing, de oogst van de cellen met 0,05% trypsine en tel ze met behulp van een hemocytometer.
- Meng 400 tumorcellen en 1600 niet-tumorcellen samen in elke well van een 96-well kweekplaat in 0,2 ml medium. Gezien snellere groei van tumorcellen bij de behandelingsperiode van 5 dagen, de initiële percentage van tumorcellen werd vastgesteld op 25%. Opgezet 4 replica voor elke concentratie geneesmiddel. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 O / N.
2. Drug De behandeling
- Gebruik nilotinib als de test drug. Bereid voorraad oplossingen van 0, 2, 4 en 20 mm nilotinib in DMSO. Vul telkens hunner 200-voudig in 5 ml DMEM medium, die 2-voudig geconcentreerde drug-oplossingen van 0, 10, 20 en 100 uM 6,7.
- Verwijder 0,1 ml medium uit elk putje en voeg 0,1 ml medium met geneesmiddel. De uiteindelijke concentraties 0, 5, 10 en 50 uM. Verder incuberen van de cellen in medium met geneesmiddel gedurende 5 dagen.
- Na afloop van de behandeling Controleer de aangehechte cellen met behulp van een fasecontrastmicroscoop en foto's nemen. Zuig het medium weg, was de overleefde lijm cellen eenmaal met 0,2 ml PBS.
3. Voorbereiden van DNA voor Digital PCR
- Lyseren cellen met behulp HotShot 8.
- Voeg 50 ul alkalische lysis-oplossing (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) aan elk putje. Verzegeling van de putten met folie. Incubeer de plaat bij 95 ° C in een oven of op een verwarmingsplaat gedurende 30 min. Controleer onder een MICRoscope ervoor zorgen dat niet meer intacte cellen bleven aan het oppervlak van de putjes. In het geval dat niet de cellen niet volledig lyseren, verhoging van de opwarmtijd of voeg wasmiddel. Vries ze eenmaal bij -20 ° C verhoogt ook het breken van cellen.
- Voeg 50 ul neutraliserende oplossing (40 mM Tris-HC, pH 4,0) aan elk putje. Breng alle lysaten in U-vorm putjes van een PCR-plaat en droog in een PCR cycler bij 95 ° C gedurende 10 tot 30 min. Reconstitueer de lysaten met 20 pi gedestilleerd water.
- Ontzouten met behulp van Drop-Dialyse 9
- Gebruik membraanfilters met een gemiddelde poriegrootte 0,025 micrometer.
- Drijven het filter aan gedestilleerd water met glanzende zijde in putjes van een 12-wells plaat. Nat filter 5 min. Besteed aandacht aan luchtbellen tussen de filter en het water te vermijden.
- Pipet de opgeloste lysaten van elk monster uit stap 3.1.4 voorzichtig op op elk van de gebieden 4 van het filter. Bedek de plaat en dialyseer gedurende 30 tot 60 minuten.
- Zuigen weg het water onder de filter zonder flippen over het filter noch het verstoren van de druppels.
- Breng de lysaat-druppels in putjes van een nieuwe PCR-plaat. Droog de DNA-drops door verwarming bij 95 ° C gedurende 10 tot 30 minuten in een PCR cycler. Reconstitueer de lysaten in 10 pi water.
4. Digitale PCR
- Ontdooi bevroren componenten zoals DNA, buffer en het analysemengsel bij kamertemperatuur, het afsluiten gedurende 10 s bij maximale kracht van elke beschikbare centrifuge (bijvoorbeeld VWR mini centrifuge) en bewaar ze op ijs.
- Bereid meester mengsel dat alle componenten met uitzondering van DNA (tabel 1). Denk aan dood volume en bereken meester mengsel ongeveer 10% meer dan het vereiste bedrag.
OPMERKING: Gebruik de primers en probes gebruikt in de commerciële kit. - Vortex de meester mengsel, spin down gedurende 10 seconden op maximale kracht van alle beschikbare centrifuge (bijvoorbeeld VWR mini-centrifuge) en afzien 15 pi aan elkputje van een 96-PCR plaat. Voeg alle lysaat van elk monster aan de putjes die de master mengsel (die DNA bevat). Overdracht 20 pi van elke reactie mengsel in een put aan de monsterzijde van een patroon bij KT.
- Verdeel 70 ui druppelgenerator olie in elke put op de olie-kant van een patroon. Sluit de cartridge met de pakking en plaats de hele omgeving in een druppel generator. Start druppel generatie.
- Overdracht 40 ul druppel-oplossing in putjes van een 96-well PCR plaat. Seal de plaat met een folie en zet de plaat in een PCR cycler. Stel de lid-temperatuur bij 105 ° C en oprit snelheid 2 ° C / sec. Voer PCR met de instellingen in Tabel 2. Na de PCR, breng de plaat in een druppel lezer en begint te lezen. Alternatief bewaar de plaat bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur.
5. Het berekenen Aandeel van tumorcellen
- Laad de digitale PCR data en het uitvoeren van automatische analysis.
- Controle van de resultaten van elke test handmatig door inspectie van de één-dimensionale en 2-dimensionale verdeling van de positieve en negatieve druppeltjes en bevatten goed gescheiden en de drempel lijnen waren in de juiste posities. Uitsluiten resultaten niet aan de criteria bijvoorbeeld geen duidelijke scheiding tussen positieve en negatieve druppeltjes, verder onderzocht. Kopieer de resulterende verhouding NF1 / RPP30 in een Excel-sheet.
- Bereken het aandeel van de tumorcellen als: 2 x (1- NF1 / RPP30).
6. Dosisafhankelijke Verandering van Aandeel van tumorcellen
- Voor elk geneesmiddel-concentratie berekent het gemiddelde en de standaardafwijking van 4 herhalingen. Teken de middelen en de standaarddeviaties tegen drug-concentraties.
Resultaten
Kwaliteit van DNA bereid met de gecombineerde HotShot / Drop-Dialyse is voldoende voor bevredigende digitale PCR (Figuur 1B). Voor 2000 fibroblasten ongeveer 3000 ± 500 positieve druppeltjes verkregen, overeenkomend met 75% van de verwachte 4000 kopieën (twee exemplaren in een cel). In deze studie, de tumorcellen waren van een gevestigde lijn MPNST S462 waarvan bekend is dat een heterozygote deletie van het NF1 gen 5 hebben. Dit gen dosering reductie van 50% werd duidelijk waargenomen door de dubbele digitale PCR-test (Figuur 1B). Daarentegen werden twee kopieën van dit gen gemeten in fibroblasten. Deze genetische verschillen tussen tumor- en non-tumorcellen maakt berekening van het percentage van tumorcellen in gemengde kweken (figuur 2). Door de relatieve gendosage van NF1 tot RPP30 kan hoeveelheid tumorcellen in een gemengde kweek vastgesteldbij elk geneesmiddel-concentratie (Figuur 3).
Figuur 1. Digitale PCR. (A) illustratie van het principe. (B) een dual-probe-test onthult verminderde hoeveelheid van een doel (NF1) gen in de tumorcellen MPNST S462 ten opzichte van een referentie (RPP30) gen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Berekende Percentage tumorcellen. Tumorcellen en niet-tumorcellen werden gemengd in verschillende verhoudingen en geënt in elk putje van een 96-plaat. Na hechting O / N werden de cellen gelyseerd with HotShot / Drop-dialyse en ontzout lysaten werden onderworpen aan digitale PCR waarin de verhouding van NF1 / RPP30 gaf. Basis van deze verhouding, percentage tumorcellen in elk putje werd berekend. Gemiddelde en standaarddeviatie van percentage tumorcellen werden berekend uit 4 replicaten van elke set-up verhouding. De berekende verhoudingen van tumorcellen (Y-as) werden uitgezet tegen de set-up proporties (X-as). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Dosisafhankelijke Verandering van Aandeel van tumorcellen. (A) dosis-afhankelijke reductie van zichtbare vitale cellen. (B) hoeveelheid tumorcellen (gemiddelde en standaarddeviatie van 4 herhalingen) berekend uit de verhouding NF1: RPP30, daalde in het bereik van 0-10 uM. Bij de hoogste dosis 50 pm, werden enkele vitale cellen verlaten, waarschijnlijk als gevolg van toxische effect op alle cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 4. Scheiden Reactie tumorcellen van die van niet-tumorcellen (A) de levensvatbaarheid en / of proliferatie van totale cellen kan worden gemeten met conventionele testen; Percentage van tumorcellen kan worden vastgesteld volgens de procedure aangetoond in deze studie. (B) met de twee parameters, kan reactie van totale cellen in een gemengde kweek van een geneesmiddel worden verdeeld in respons van de tumorcellen en de respons van de niet-tumorcellen..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 1 Reactie | ||
| 2 x ddPCR supermix | 12 | |
| Analysemengsel voor NF1 | 1.2 | |
| Analysemengsel voor RPP30 | 1.2 | |
| HaeIII | 0.6 | |
| Subtotaal | 15 | modelmengsel |
| DNA | 9 | |
| Totaal | 24 | Uiteindelijke PCR Mengsel |
Tabel 1 instellen Dual ddPCR Reaction
| Stap | Actie | Temperatuur | Tijd | Cycles |
| 1 | Polymwissen activering | 95 ° C | 10 min | 1 |
| 2 | DNA denaturatie | 94 ° C | 30 sec | 40 |
| 3 | Annealing / exetension | 60 ° C | 1 minuut | |
| 4 | polymerase deactivering | 98 ° C | 10 min | 1 |
| 5 | Hold (optioneel) | 4 ° C |
Tabel 2 PCR Cycler Instellingen
Discussie
De belangrijkste stap in deze genetisch en op cellen gebaseerde instrument voor de beoordeling van geneesmiddelen specificiteit in vitro bepaling van de hoeveelheid tumorcellen via een of meer tumor-specifieke genetische eigenschappen. In tegenstelling tot conventionele fenotypische kenmerken 7, genetische kenmerken zijn bepaald, stabiel en gemakkelijk te kwantificeren. Bijvoorbeeld een tumor-specifieke mutatie of copy number variation aanwezig uitsluitend de tumorcellen, maar niet in niet-tumorcellen. Een dergelijke genetische stigma betrouwbaar en precies gekwantificeerd, bijvoorbeeld onder gebruikmaking van digitale PCR zoals aangetoond in deze studie.
Voor digitale PCR, hoge zuiverheid van DNA is niet essentieel. Echter, ontzouten en verwijderen van remmende moleculen nodig die kunnen worden bereikt door een drop-dialyse met een geschikt filter. De gecombineerde lyse en drop-dialyse is eenvoudig en snel, vereist geen speciale instrumenten en derhalve kan op elke standaard laboratorium worden uitgevoerd. Als de cellen niet breaen k, kunnen aanvullende behandeling worden genomen zoals het bevriezen van de cellen bij -20 ° C, het toevoegen van detergens en / of gebruiken protease.
In deze studie, de heterozygote deletie van het NF1-gen werd gebruikt als tumor-specifieke eigenschap voor de kwantificering. Evenzo deleties van andere genen of loci kunnen ook worden gebruikt. Verder kunnen mutaties ook worden gebruikt voor het kwantificeren van tumorcellen. In dat geval digitaal PCR assays voor de mutant en de normale allelen moeten grondig worden gevalideerd hun specificiteit voor elk daarvan waarborgen.
Dosisafhankelijke percentage tumorcellen een indicatie voor drug-specificiteit of selectiviteit. Voorts maakt ook toe respons van tumorcellen uit de reactie van totale cellen van een gemengde kweek van een geneesmiddel (figuur 4). Deze extractie strategie verschaft een oplossing voor het technische probleem bij het gebruik van primaire kweken (die zowel tumor en bevat geenn-tumorcellen) voor drug-testen.
De genetisch en cell-based in vitro hulpmiddel gedemonstreerd in de huidige studie kan daarom toepassingsmogelijkheden (1) in drug-discovery, waar het biedt een platform voor de beoordeling van geneesmiddelen specificiteit of selectiviteit in vitro en (2) in gepersonaliseerde oncologische zorg waar het maakt het testen van drugs in primaire kweken en dus kan bijdragen aan drugs-selectie in adjuvante chemotherapie 4. Verder kunnen farmacologisch mechanisme van een geneesmiddel worden bestudeerd met dit hulpmiddel, aangezien bepaalde genetische verandering of meer genetische veranderingen in de drug-behandeling kan worden gevolgd.
Een moeilijkheid bij het gebruik van individuele primaire kweken is het ontbreken van een universele genetische eigenschap voor de kwantificering van de tumorcellen. Echter, met de huidige vooruitgang in hele genoom, de meest veranderde genen en gebieden zijn bekend voor zachte tumoren. Bijvoorbeeld, onder het hoofd en de nektumoren, 71%, 23% en 22% hebben mutaties in de TP53, FAT1 en CDKN2A genen en 60%, 34% en 26% hebben deleties in het gen regio CDKN2A, STK11 en PTEN, respectievelijk 10. Screening 5 tot 10 dergelijke genen en / of gebieden door gerichte sequencing en / of digitale PCR zal daarom waarschijnlijk identificeren van één of meer genetische veranderingen die kunnen worden gebruikt voor de kwantificering van tumorcellen in de verkregen primaire kweek. Een andere beperking is het vaak onvoldoende hoeveelheid weggesneden tumoren opzetten primaire kweken.
Ondanks de voordelige eigenschappen en veelbelovende toepassing potentieel van de genetisch en op cellen gebaseerde in vitro tool, maar heeft haar beperkingen in het achterhoofd worden gehouden en de in vitro aard moet worden benadrukt. Bijvoorbeeld, de differentiële effecten of cytotoxiciteit van geneesmiddel op tumorcellen plaats als gevolg van verschil in celtypes (fibroblasten versus Schwann-cellen) of hunverschillende oorsprong (uit verschillende individuen). Hoe sterker effect van een geneesmiddel op tumorcellen dan op niet-tumorcellen kan ook worden verklaard door het feit dat de eerstgenoemde sneller groeien dan de laatste. Belangrijker, cellen in vitro gedrag verschilt dan cellen in het menselijk lichaam en dus de resultaten van in vitro assessment vaak niet of slechts gedeeltelijk overeen met de werkelijke klinische situatie. Daarom werkzaamheid, specificiteit en cytotoxiciteit van geneesmiddelen verkregen gekweekte cellen zijn eerder biomarker van aard, maar niet de betrouwbaarheid van gemeten preklinisch werkzaamheid van antibiotica. Niettemin verplaatsen van cellijnen gemengde kweken en / of primaire kweken is een stap voorwaarts bij de beoordeling drug-effect en specificiteit / selectiviteit in vitro. Met grote inspanningen, in vitro omstandigheden te vinden die redelijk correlatie van in vitro gegevens met echte reacties van patiënten, althans voor sommige geneesmiddelen mogelijk maakt.
Openbaarmakingen
De procedure is octrooibeschermd (10 2013 221 452, Duitsland)
Dankbetuigingen
Mevrouw Alster, de heer Honrath en Dr. Jiang worden gewaardeerd om hun uitstekende technische bijstand. Ook gewaardeerd is Dr. Volz en de onderzoeksgroep van Dr. Dandri voor het verstrekken van de toegang tot hun digitale PCR-apparaat.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Membraanfilter van 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | Voor druppel-dialyse |
| ddPCR-assay voor NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-gelabeld |
| ddPCR-assay voor RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-gelabeld |
| QX200 | BioRad | 186-4001 | De vorige versie QX werd in het onderzoek gebruikt, die niet meer beschikbaar is. De vervanger is QX200 |
| Droplet olie | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridges | BioRad | 186-3004 | |
| Pakkingen | BioRad | 186-3009 | |
| Cartridge houder | BioRad | 186-3051 | |
| Doorboorbaar folie | BioRad | 181-4040 |
Referenties
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).
- McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Edwards, A. M., et al. Preclinical target validation using patient-derived cells. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).
- Frahm, S., et al. Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients. Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).
- Jiang, W., et al. Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro. J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).
- Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures. J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).
- Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).
- Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation. Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).
- Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).
Herprints en machtigingen
