Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Samenvatting

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Samenvatting

Evolutie in Saccharomyces cerevisiae biedt vele aantrekkelijke voordelen bij het ​​ontwerpen van enzymen voor biotechnologische toepassingen, een proces dat de constructie, klonering en expressie van mutante bibliotheken, gekoppeld met hoge frequentie homologe DNA recombinatie in vivo omvat. Hier presenteren we een protocol en het scherm mutante bibliotheken in gist hand van het voorbeeld van een schimmel aryl-alcohol oxidase (AAO) om haar totale activiteit verhogen creëren. Twee eiwitsegmenten werden onderworpen aan gerichte gerichte evolutie door willekeurige mutagenese en DNA in vivo recombinatie. Overhangen ~ 50 bp flankerend elk segment kon de juiste montage van de AAO-fusiegen in een gelineariseerde vector waardoor een volledig autonoom replicerend plasmide. Mutant bibliotheken verrijkt met functionele AAO varianten werden vertoond in S. cerevisiae supernatanten met een gevoelige high-throughput assay gebaseerd op de Fenton reactie. Het algemene proces vanbibliotheek bouw in S. cerevisiae beschreven kunnen gemakkelijk worden toegepast op vele andere eukaryote genen evolueren vermijden extra PCR reacties, in vitro DNA recombinatie en ligatiestappen.

Inleiding

Gerichte moleculaire evolutie is een robuuste, snelle en betrouwbare methode om enzymen ontwerpen ^{1, 2.} Door iteratieve ronden van willekeurige mutatie, recombinatie en screening, verbeterde versies van enzymen kan worden gegenereerd die inwerken op nieuwe substraten in nieuwe reacties, in niet-natuurlijke omgevingen of zelfs de cel te helpen nieuwe metabole doelen ^3-5 bereiken. Onder de gastheren gebruikt in gerichte evolutie, van de brouwer gist Saccharomyces cerevisiae heeft een repertoire van oplossingen voor de functionele expressie van complexe eukaryote eiwitten die anders niet beschikbaar in prokaryotische tegenhangers ^6,7 zijn.

Uitvoerig gebruikt in celbiologische Dit kleine eukaryotische model heeft vele voordelen in termen van posttranslationele modificaties, gemakkelijke manipulatie en transformatie-efficiëntie, die allemaal belangrijke eigenschappen om enzymen te construeren door gerichte evolutie ^8. Bovendien is de hoogfrequentevan homologe DNA recombinatie in S. cerevisiae gekoppeld aan een efficiënte proof-leesapparaat opent een breed scala aan mogelijkheden voor de bibliotheek creatie en gen-assemblage in vivo, het bevorderen van de ontwikkeling van verschillende systemen van enkele enzymen om complexe kunstmatige paden ^9-12. Ons laboratorium heeft de afgelopen tien jaar van het ontwerp gereedschappen en strategieën voor de moleculaire evolutie van verschillende ligninasen in gist (oxidoreductases betrokken bij de afbraak van lignine in het hout verval) ^13-14. In deze mededeling, presenteren we een gedetailleerd protocol voor te bereiden en het scherm mutant bibliotheken in S. cerevisiae een model flavooxidase, -aryl-alcohol oxidase (AAO ¹⁵⁾ -, welke gemakkelijk vertalen vele andere enzymen. Het protocol gaat om een gerichte-evolutie methode (MORPHING: Mutageen Organized Recombinatie Process door homologe in vivo Groepering) bijgestaan ​​door het gistcel apparaat ^16, eenda zeer gevoelige screening assay gebaseerd op de Fenton reactie om AAO activiteit afgescheiden in het kweekmedium ¹⁷ te detecteren.

Protocol

1. Mutant Bibliotheek Construction

1. Kies de regio's moeten worden onderworpen aan MORPHING met behulp van algoritmes op basis van de beschikbare kristalstructuur of homologie modellen ^18.
   1. Hier targeten twee gebieden van AAO van Pleurotus voor willekeurige mutagenese en recombinatie (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), terwijl de rest amplificeren van het gen (844 bp) van high-fidelity PCR (figuur 1).
      Opmerking: Meerdere segmenten kunnen worden bestudeerd door MORPHING op een onafhankelijke of gecombineerde manier ^16.
2. Versterken de doelgebieden door mutagene PCR. Maak overlappende gebieden tussen segmenten (~ 50 bp elk) door superpositie van PCR-reacties van de gedefinieerde regio's.
   1. Bereid mutagene PCR gerichte segmenten in een eindvolume van 50 pl bevattende DNA matrijs (0,92 ng / ul), 90 nM oligo zin (RMLN voor segment MI en AAO-BP segment M-II), 90 nM eenntisense primer (AAO-92C voor segment MI en RMLC voor segment M-II), 0,3 mM dNTPs (0,075 mM elk), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO), 1,5 mM _MgCl2, 0,05 mM _MnCl2 en 0,05 U / ul Taq DNA polymerase. Primers sequenties zijn beschreven in figuur 1.
   2. Gebruik de volgende PCR-programma: 95 ° C gedurende 2 min (1 cyclus); 95 ° C gedurende 45 seconden, 50 ° C gedurende 45 seconden, 74 ° C gedurende 45 seconden (28 cycli); en 74 ° C gedurende 10 min (1 cyclus).
3. Versterken de niet-mutagene regio's met een ultra-high fidelity polymerase en omvatten de desbetreffende gebieden overlappen de mutagene segmenten en / of lineair vector overhangen.
   1. Bereid reactiemengsels in een eindvolume van 50 pl bevattende: DNA template (0,2 ng / ul), 250 nM oligo zin HFF, 250 nM oligo antisense HFR, 0,8 mM dNTPs (0,2 mM elk), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) en 0,02 U / pl iProof DNA polymerase. Primers sequenties worden beschreven in Figuur 1.
   2. Gebruik de volgende PCR-programma: 98 ° C gedurende 30 sec (1 cyclus); 98 ° C gedurende 10 sec, 55 ° C gedurende 25 sec, 72 ° C gedurende 45 seconden (28 cycli); en 72 ° C gedurende 10 min (1 cyclus).
      Opmerking: Met de in 1.2 beschreven omstandigheden en 1,3 overlappingen van 43 bp (regio plasmide-M1); 46 bp (M1 regio-HF regio); 47 bp (HF regio-M2 gebied) en 61 bp (M2 regio- plasmide) worden gemaakt (Figuur 1) begunstigen in vivo in gist splicing.
   3. Zuiveren de PCR-fragmenten (mutagene en niet-mutagene) met een commerciële gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant.
4. Lineariseren de vector zodanig dat flankerende gebieden van ongeveer 50 bp worden gecreëerd die homoloog zijn aan de 5'- en 3'-uiteinden van het doelgen is.
   1. Bereid een linearisatie reactiemengsel dat 2 ug DNA, 7,5 U BamHI, 7,5 U XhoI, 20 ug BSA en 2 ui buffer Bam HI 10x in een eindvolume van 20 pl.
   2. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 2 uur en 40 minuten. Daarna verder met inactivatie bij 80 ° C gedurende 20 min.
5. Zuiver het gelineariseerde vector door agarose gel extractie om besmetting met de resterende circulair plasmide (figuur 2) te voorkomen.
   1. Laad de digestie reactiemengsel in de mega-putje van een semi-preparatieve laag smeltpunt agarose gel (0,75%, w: v) en een monster (5 pl) van het reactiemengsel in de aangrenzende en een reporter.
   2. Run DNA elektroforese (5 V / cm tussen de elektroden, 4 ᵒC) en scheid de agarosegel die overeenkomt met de mega-goed en het op 4 ᵒC in 1x TAE.
   3. Vlekken op de baan met het molecuulgewicht ladder en de verslaggever. Visualiseer de banden onder UV-licht. Nick de positie waar de gelineariseerde vector plaatsen.
      Opmerking: Als de kwaliteit van het gezuiverde gelineariseerde vector een critical factor voor een succesvolle recombinatie en assemblage in gist, vermijd gel kleuring voor semi-voorbereidende DNA elektroforese. Het gebruik van kleurstoffen en UV-belichting voor gelextractie kan de stabiliteit van de DNA vector beïnvloeden compromitteren de in vivo recombinatie efficiëntie. Als alternatief voor EtBr giftige kleurstoffen worden Gel Red en SYBR kleurstoffen gebruikt voor gel kleuring.
   4. Bij afwezigheid van UV-licht, identificeren van de gelineariseerde vector in de mega-goed-fragment met behulp van de leiding van de inkepingen in het gebrandschilderde verslaggever rijbaan, zodat deze kunnen worden geïsoleerd.
   5. Extraheer de gelineariseerde vector uit agarose en zuiveren met een commerciële gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant.
      Noot: Gebruik high-episomale shuttlevectoren met antibiotica en auxotrofie markers: In dit voorbeeld gebruikt de uracil onafhankelijke en ampicillineresistentie pJRoC30 vector, onder controle van de gist GAL1 promoter.
6. Bereid een equimolaire mixture van de PCR-fragmenten en meng dit met de gelineariseerde vector met een 2: 1 verhouding van niet minder dan 100 ng gelineariseerde plasmide (test verschillende verhoudingen van equimolaire bibliotheek / openen vector voor transformatie goede opbrengst te bereiken).
   1. Meet de absorptie van de PCR-fragmenten en de lineair gemaakte vector bij 260 nm en 280 nm voor de concentratie en zuiverheid te bepalen.
7. Transformeren gist competente cellen met het DNA-mengsel met een commerciële gist transformatie kit (zie Tabel voor leveringen) volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Hier, gebruik dan een protease deficiënt URA3 en ^- afhankelijk van S. cerevisiae stam, BJ5465. Transformeer de cellen met de parentale gecirculariseerde vector als interne standaard bij screening (zie hieronder). Bovendien, controleer dan de achtergrond door het transformeren van de gelineariseerde vector in de afwezigheid van PCR-fragmenten.
      Opmerking: In het geval van het detecteren van de eerste laag secretie niveaus, gebruiken S.cerevisiae protease deficiënte stammen BJ5465 zoals de accumulatie van actieve eiwitten in kweeksupernatanten bevorderen. Als het doel enzym ondergaat hyperglycosylering, het gebruik van glycosylering-deficiënte stammen (bijvoorbeeld Δ kre2 dat alleen kan hechten kleinere mannose oligomeren) kan een geschikte optie.
8. Plaat de getransformeerde cellen op SC drop-out platen en incubeer ze op 30 ° C gedurende drie dagen. Plaat (op SC drop-out platen, aangevuld met uracil) URA3 ^- S. cerevisiae cellen zonder het plasmide als een negatieve controle voor screening (zie hieronder).

2. High-throughput screeningstest (figuur 3)

1. Vul een passend aantal steriele 96-putjesplaten (23 platen een bibliotheek van 2000 klonen analyseren) met 50 ul minimaal medium per putje met behulp van een robot pipetteren.
2. Pick individuele kolonies van de SC-uitval platen en overbrengen naar de 96-well platen.
   1. In elke plaat, te enten kolom nummer 6 met de ouderlijke soort als een interne standaard en goed H1 met URA3 ^- S. cerevisiae cellen (SC in medium aangevuld met uracil) zonder plasmide als een negatieve controle.
      Opmerking: Nou H1 is speciaal gevuld met drop-out media, aangevuld met uracil. Een blanco putje medium zonder cellen kunnen ook worden bereid als extra controle steriliteit.
3. Bedek de platen met hun deksels en wikkel ze in Parafilm. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 30 ° C, 225 rpm en 80% relatieve vochtigheid in een vochtige shaker.
4. Verwijder de Parafilm, voeg 160 pl expressie medium aan elk putje met behulp van de robot pipetteren, bedek de platen en incubeer ze nog eens 24 uur.
   Let op: minimaal medium en expressie medium worden bereid als elders ¹⁹ gerapporteerd. Uitscheidingsniveaus kan afhankelijk van het gen bestudeerde variëren en dienovereenkomstig tHij incubatietijden geoptimaliseerd moet worden telkens de celgroei synchroniseren alle putjes.
5. Centrifugeer de platen (meesterplaten) bij 2800 x g gedurende 10 min bij 4 ° C.
6. Overdracht 20 ul van de supernatant uit de putjes in de moederplaat de replica plaat met een vloeistofverwerking robot meerdere stations.
   Opmerking: Om enzym secretie bevorderen verdient het aanbeveling het natieve signaalpeptide van het doelwiteiwit te vervangen door signaalpeptiden gebruikt voor heterologe expressie in gist (bijvoorbeeld de α-factor prepro-leader, de leider van de K ₁ killer toxine van S. cerevisiae, of chimère versies van beide peptiden ^13). Als alternatief kan het natieve signaalpeptide uitsluitend ontwikkeld voor uitscheiding in gist.
7. Voeg 20 ul van 2 mM p -methoxybenzylalcohol in 100 mM natriumfosfaatbuffer pH 6,0 met behulp van de robot pipetteren. Roer de platen kort met een 96-well plaat mixer en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
8. Het pipetteren robot, voeg 160 ul van de FOX reagens aan elke replica plaat en roer kort met de mixer (eindconcentratie van FOX mengsel in de put: 100 uM xylenol oranje, 250 uM Fe _{(NH4) 2 (SO4) 2} en 25 mM H ₂ SO _4).
   1. Voeg enkele additieven voor reagens gevoeligheid, zoals organische hulpoplosmiddelen (DMSO, ethanol, methanol) of sorbitol ¹⁷ verbeteren. Hier, versterken de reactie door toevoeging van sorbitol tot een uiteindelijke concentratie van 100 mM (Figuur 4).
9. Lees de platen (end-point mode, t ₀₎ bij 560 nm op een plaatlezer.
10. Incubeer de platen bij RT tot de kleurontwikkeling en opnieuw meten van de absorptie (t _1).
    1. Bereken de relatieve activiteit van het verschil tussen de waarde na incubatie Abs en die van de eerste meting in dat van de parental soort voor elke plaat (At ₁ - t _0).
11. Betreft de beste mutant hits op twee opeenvolgende re-screenings uit te sluiten valse positieven.
    Opmerking: Meestal opnieuw screenings omvatten plasmide isolatie van gist, amplificatie en zuivering van Escherichia coli, gevolgd door transformatie van verse gistcellen met plasmide ^19. Elke geselecteerde kloon wordt opnieuw gescreend pentaplicate.

Resultaten

AAO van P. eryngii is een extracellulair flavooxidase dat schimmel peroxidasen voorziet van H ₂ O ₂ beginnen aanvallen lignine. Twee segmenten van AAO werden onderworpen aan gerichte evolutie van MORPHING om de activiteit en de expressie in S. verbeteren ¹⁹ cerevisiae. Ongeacht de buitenlandse enzymen koesterde door S. cerevisiae, de meest kritieke punt bij de bouw mutant bibliotheken in gist betreft de engineering van ...

Discussie

In dit artikel hebben we samengevat het grootste deel van de tips en trucs die werkzaam zijn in ons laboratorium om enzymen ingenieur door gerichte evolutie in S. cerevisiae (met AAO ter illustratie) zodat ze kunnen worden aangepast voor gebruik met vele andere eukaryote enzymsystemen door simpelweg na de gemeenschappelijke benadering beschreven.

Qua bibliotheek schepping MORPHING is een snel-pot methode te introduceren en recombineren willekeurige mutaties in kleine stukjes eiwit t...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1. Cultuur media
Ampicillin natriumzout	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramfenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydraat	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Pepton	Difco	211677
Kaliumfosfaat monobasicum	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Gist Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base zonder aminozuren	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements zonder uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2. PCR-reacties
dNTP-mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM elk
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Mangaan(II)chloride tetrahydraat	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	Voor foutgevoelige PCR
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3. Plasmide linearisatie
BamHI restrictie-enzym	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumine	New England Biolabs	B9001S
XhoI restrictie-enzym	New England Biolabs	R0146S
Not I restrictie-enzym	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	Voor het kleuren van DNA
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4. FOX-assays
Ammonium ijzer(II)sulfaat hexahydraat	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Waterstofperoxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standaardcurve
Xylenol Orange dinatriumzout	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5. Agarose gel materiaal
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA-analysekleurstof
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standaard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Laagsmeltende agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6. Kits en cellen
S. cerevisiae stam BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease-deficiënte stam met genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competente cellen	Agilent genomics	200150	Voor plasmide-zuivering en amplificatie
NucleoSpin Gel en PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extractie
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Inclusief DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmidecodextractie uit gist
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
7. Platen
96-well platen	Greiner Bio-One	655101	Helder, niet-steriele, polystyreen (voor activiteitsmetingen)
96-well platen	Greiner Bio-One	655161	Helder, steriele, polystyreen (voor microfermentaties)
96-well platen deksel	Greiner Bio-One