Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van CD146

7.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53782

⸱

17 juni 2016

 ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een isolatietechniek voor het verkrijgen van primaire long resident mesenchymale stromale cellen van ratten, door middel van enzymatische digestie, dichtheidsgradiënt scheiding plastic hechting en CD146 + magnetische bead selectie.

Samenvatting

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) worden steeds meer erkend voor hun therapeutisch potentieel in een groot aantal ziekten, waaronder longziekten. Naast het gebruik van beenmerg en navelstreng MSC's voor exogene celtherapie, wordt er ook steeds meer belangstelling voor de reparatie en het regeneratieve potentieel van ingezeten weefsel MSC's. Bovendien hebben ze waarschijnlijk een rol bij normale orgaanontwikkeling en zijn toegewezen rol in ziekte, met name die met een fibrotische aard. De belangrijkste belemmering voor de studie van deze resident weefsel MSCs is het ontbreken van een duidelijke markering voor de isolatie en identificatie van deze cellen. De isolatie techniek die hier beschreven geldt meerdere kenmerken van de long resident MSC's (L-MSC). Bij het offer van de ratten, zijn longen verwijderd en gespoeld meerdere keren om bloed te verwijderen. Naar aanleiding van mechanische dissociatie door scalpel, worden de longen verteerd gedurende 2-3 uur met behulp van een mix van het type collagenase I, neutraal protease en het type DNase I. De obtained enkele celsuspensie wordt vervolgens gewassen en gelaagd over dichtheidsgradiënt medium (dichtheid 1,073 g / ml). Na centrifugatie worden cellen uit de interfase gewassen en uitgeplaat in kweek behandelde flessen. Cellen worden gekweekt gedurende 4-7 dagen in fysiologische 5% O2, 5% CO 2 condities. Om fibroblasten (CD146 -) afbreken en een bevolking van slechts L-MSC's (CD146 +), positieve selectie voor CD146 + cellen te waarborgen wordt uitgevoerd door middel van magnetische bead selectie. Samengevat, deze procedure levert betrouwbare een populatie van primaire L-MSC's voor verdere in vitro onderzoek en manipulatie. Vanwege de aard van het protocol, kan het gemakkelijk worden vertaald naar andere experimentele diermodellen.

Inleiding

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) worden steeds meer erkend voor hun therapeutisch potentieel in een groot aantal ziekten, waaronder longziekten. Naast het gebruik van beenmerg en navelstreng MSC's voor exogene celtherapie, wordt er ook steeds meer belangstelling voor de reparatie en het regeneratieve potentieel van ingezeten weefsel MSC's. Tijdens de ontwikkeling, waaronder de longen, het mesenchym is een belangrijke bron van ontwikkelings signalen en resident MSCs een waarschijnlijke kandidaat te zijn in het midden van dit. Bovendien is het bewijs in opkomst die inwoner MSC's worden verstoord bij volwassen ziekten, waaronder kanker 1,2 en fibrose 3. De belangrijkste belemmering voor de studie van deze resident weefsel MSCs is het ontbreken van een duidelijke markering voor de isolatie en identificatie van deze cellen 4. Stamcel antigeen-1 (Sca-1) werd geïdentificeerd bij muizen als een marker voor een verscheidenheid van weefsels stamcellen, en kan worden gebruikt voor de isolatie van L-MSC 5, maar heeft helaasgeen bekende orthologen uit andere soorten 6. Onderzoekers hebben een verschillende isolatiemethoden voor de isolatie van L-MSC's van ofwel longweefsel of vloeibare gerapporteerd. Deze variëren van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebaseerde methodes selecteren op CD31 - / CD45 - / CD90 + cellen 7, CD31 - / CD45 - / epitheliale cel adhesiemolecuul (EpCAM) - / Sca-1 + -cellen 8, multidrug resistentie transporter ATP bindende cassette G (ABCG2) positieve cellen 9 of Hoechst 33342 kleurstof efflux 10, kunststof hechting 11,12 en migratie uit gehakt weefsel 13.

De voordelen van de hierin voorgestelde werkwijze zijn meervoudig. Door middel van een zachte enzymatische digestie en dichtheidsgradiënt 14, verkrijgt men alle cellen van het dichtheidbereik dat MSC's omvatten maar exclusief epitheel- en endotheelcellen. De daaropvolgende plastic hechting maatregel wordt bereikt dat alleen de mesenchymal cellen hechten en verblijf in de cultuur, waardoor leukocyten. Belangrijker echter, de CD146 + selectiestap maakt de eliminatie van fibroblasten, aangezien deze cellen niet CD146 tot expressie. Expressie van de celadhesie molecuul CD146 is positief gecorreleerd met multipotentie, en is daarom een goede marker om onkruid uit fibroblasten van een mesenchymale celpopulatie 15-19. Dit is een voordeel boven het gebruik van CD90 als een selectiemerker, omdat het niet alleen uitgedrukt in MSC's maar ook in lipofibroblasts 5,20. In dit protocol hebben we nadrukkelijk gekozen voor een magnetisch bolletje selectie, omdat het zachter op de cellen, en de gehele procedure kan worden uitgevoerd in steriele omstandigheden. Een ander belangrijk voordeel van deze isolatiemethode in plaats van de uitgroei methode is dat het relatief snel, 6-10 dagen in tegenstelling tot een maand of meer voor de uitgroei methode. Drie tot vijf dagen na de oorspronkelijke isolatie de mesenchymale populatie is gereed voor CD146 + sele ction; Na nog drie tot vijf dagen de CD146 + cellen direct worden gebruikt voor experimenten of kan worden ingevroren voor later gebruik. De verminderde tijd cultuur verbetert de kwaliteit van de cellen als MSCs transdifferentiëren richting fibroblasten verlengde ex vivo kweken 19. Tenslotte vanwege de aard van het protocol, is het mogelijk om deze methode toe te passen op andere soorten door simpelweg geschikte antilichamen te kiezen of zelfs andere orgaansystemen door aanpassing van de keuze van verteringsenzymen en incubatietijd.

Een gedetailleerd protocol van deze isolatiewerkwijze wordt hieronder gegeven, en een schematisch overzicht van de isolatie en daaropvolgende selectie van de CD146 + subpopulatie wordt respectievelijk gegeven in Figuur 1A en 1B. Bovendien worden gegevens welke voor passage, invriezen en ontdooien van deze cellen.

ad / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematisch overzicht van de isolatie van pulmonale mesenchymale cellen (A) en daaropvolgende CD146 + celselectie (B) min = minuten.; EDTA = Ethyleendeniaminetetraacetaat; 2 e Ab = secundair antilichaam; a-CD146 Ab = primaire anti-CD146 antilichaam; ve cellen = CD146 negatieve cellen; + ve cellen = CD146 positieve cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Ottawa (dierethiek protocol OHRI-1696). Dierenzorg werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen.

1. Isolatie van Lung mesenchymale stromacellen

  1. Bereid het enzym mix in een 50 ml tube: wegen 30 U neutraal protease, 2500 AL Collagenase I en 500 U DNAse I. Deze bedragen volstaan ​​voor de longen van een volwassen muis of rat pup. Bereid op dag van isolatie en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
  2. Offer ratten op dag 13 door een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (0,2 ml, 65 mg / ml). Gebruik de teen knijpen reflex tot bewusteloosheid vast te stellen. Dood van het dier wordt verzekerd door het openen van de borstkas, zoals hieronder beschreven.
  3. Ontsmetten van de huid van het dier sproeien met 70% ethanol en open voorzichtig de ribbenkast gebruik chirurgische schaar, vanaf het membraan en snijden naar de rostrale zijde, zeer voorzichtigde longen beschadigen. Spreid de ribbenkast geopend met behulp van hemostatische klemmen, of als alternatief weggesneden de borstkas om de toegang tot de thorax te bieden.
  4. Exsanguinate het dier door het verwijderen van het hart. Om het hart te verwijderen, pakt u de thymus en hart met kleine tang en snijd deze weg met chirurgische schaar. Onmiddellijk daarna, absorberen het bloed met een gaasje tot er geen bloed meer komt uit de afgehakte aorta en longslagader.
  5. Verwijder de longen uit de thorax als volgt: houd de luchtpijp met kleine tang, dan scheiden de luchtpijp met chirurgische schaar op de rostrale kant. Terwijl voorzichtig uit de thorax trekken van de longen pakket wegsnijden elke bindweefsel aan de rugzijde langs de ribbenkast naar de longen te bevrijden.
  6. Scheiden de longen van de aorta en de slokdarm door snijden langs het membraan met chirurgische schaar. Nu de longen zijn volledig vrij van de thorax te verwijderen alle resterende bloed voorzichtig met een gaasje.
  7. Verwijder de luchtpijp en de bronchiën met surgische schaar en zorgvuldig de longkwabben overgebracht in een 50 ml buis met koude 35 ml 30% citraat-fosfaat-dextrose Adenine (CPDA-1) anticoagulant (26,30 g trinatriumcitraat dihydraat, 3,27 g ascorbinezuur monohydraat, 2,22 g mononatriumdiwaterstoffosfaat, 31,80 g D-glucose, 0,275 g adenine in 1 L gezuiverd H 2 O, steriele filter de oplossing onder toepassing van een 0,22 urn membraanfilter voor gebruik) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om bloed en vuil te verwijderen.
  8. Na 5 min spoelen bij 30% CPDA-1 / PBS, breng de long een nieuwe 50 ml buis met 35 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (RT), keren zachtjes citraat verwijderen. Transfer naar een buis met 35 ml Dulbecco's PBS + Natrium-pyruvaat + Glucose (DPBS ++) (RT). Elke spoelen stap moet ongeveer 5 minuten duren.
    Opmerking: DPBS ++ kan commercieel worden besteld of als volgt opgebouwd 21: calciumchloridedihydraat 132,4 mg, magnesiumchloridehexahydraat 100 mg, kaliumchloride (watervrij) 200 mg monobasisch kaliumfosfaat (watervrij) 200 mg, natriumchloride (watervrij) 8000 mg, dibasisch natriumfosfaat (watervrij) 1,144.5 mg, D-glucose 1000 mg, 36 mg natriumpyruvaat in 1 L gezuiverd H2O, pH 7,3. Filtreer steriel de oplossing onder toepassing van een 0,22 urn membraanfilter voor gebruik.
  9. Los het enzymmengsel door toevoeging van 10 ml DPBS ++ (voorverwarmd tot 37 ° C) en inverterende voorzichtig tot opgelost.
  10. Breng de longen in nieuw 50 ml buis en hak de long aan de wand van de buis met behulp van een scalpel tot fijn gehakt. Voeg het enzym mix aan het weefsel (10 ml enzym mix / per volwassene muis / rat pup long), sluit de buis stevig en incubeer bij 38 ° C onder zacht schudden (hetzij in een thermische mixer, een schuddend waterbad, of een water bad met regelmatig handmatig agitatie). De tijdsduur hangt af van het type weefsel: foetaal weefsel 60 min, juveniele / volwassen weefsel 90-120 min, fibrotische volwassen weefsel 120-150 min.
  11. Stop de spijsvertering door het chelerende het bivalente kationen wi 200 pl ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Filtreer steriel de oplossing onder toepassing van een 0,22 urn membraanfilter voor gebruik).
  12. Voeg 20 ml 5% foetaal runderserum (FBS) / PBS en laat de gehele suspensie door 100 urn cel zeef in een nieuwe 50 ml buis. Spoel de buis cel zeef met 10 ml 5% FBS / PBS, waardoor het totale volume op 40 ml.
  13. Centrifugeer 5 min bij 500 xg, RT.
  14. Verwijder de bovenstaande vloeistof (pellet moet duidelijk zichtbaar zijn), resuspendeer in 40 ml 5% FBS / PBS en herhaal centrifugeren stap 1.13.
  15. Resuspendeer in 4 ml 5% FBS / PBS (RT) en laag voorzichtig over 3 ml dichtheidsgradiënt media (1,073 g / cm 3) in een 15 ml buis 14. Om een ​​goede interfase verkrijgen, is het cruciaal dat de laagvolgorde van de enkele celsuspensie optreedt bij a> 45 ° hoek zeer lage snelheid.
  16. Centrifugeer 20 minuten bij 900 xg, medium (5/10) versnelling, zonder vertraging, 19 ° C.
  17. Verzamel de cellen in de interphase en resuspendeer ze in 10 ml steriel PBS.
  18. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 xg, 21 ° C.
  19. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml voorverwarmde aangevuld L-MSC kweekmedium (minimaal essentieel medium Eagle, alfa modificatie (aMEM), aangevuld met 2 mmol L-glutamine per 500 ml aMEM, 20% vol / vol FBS en 1% vol / vol penicilline / streptomycine / Amfotericine B.
  20. Herhaal het centrifugeren stap 1.18. Vervolgens, verwijder supernatant en resuspendeer in 10 ml voorverwarmde vers kweekmedium.
  21. Aantal cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller en plaat met een hoge dichtheid, aangezien de meeste cellen in dit stadium niet hechtende kunststof. De exacte uitplaatdichtheid afhankelijk van de diersoort en de leeftijd, bijvoorbeeld, zijn de cellen van een volwassen muislong gezaaid met 10 5 cellen / cm2, terwijl cellen van een rattenpup long voldoende dicht bij een zaaidichtheid van 1-2 x 10 4 cellen / cm 2 . Gebruik 0,2 ml L-MSC kweekmedium / cm2.
  22. Cultuur L-MSC's in een bevochtigde 5% O2, 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C.
  23. Veranderen medium 24 uur na de eerste enting, en vervolgens om de 3 dagen na eenmaal spoelen met PBS. De cellen moeten gekweekt tot 80-90% confluentie, die 3-5 dagen duurt gemiddeld afhankelijk van het dier van herkomst. Hogere samenloop zal differentiatie te bevorderen in fibroblasten.

2. Selectie van CD146 + Lung mesenchymale stromale cellen

  1. Coating van Magnetic Beads met secundair antilichaam
    1. Laag de magnetische kralen met gebiotinyleerd secundair antilichaam, in een verhouding van 10 ug secundair antilichaam / 100 gl magnetische beads in een ronde bodem steriel 2 ml cryovial onder steriele omstandigheden. Gebruik 10 ul secundair antilichaam per verwachte 0,5 x 10 6 cellen en gebruik minste 100 gl magnetische korrels en 10 ug antilichaam.
      Opmerking: De verhouding van eentibodies gebruikt per volume van kralen kunnen verschillen tussen de fabrikanten, volg dan de instructies van de fabrikant voor de kralen van uw keuze. Voor dit protocol, zie tabel 1 voor de kralen en antilichamen die werden gebruikt in de optimalisatie van dit protocol.
    2. Incubeer in een roterende steekproef mixer gedurende 30 minuten bij 30 omwentelingen / min (rpm), bij kamertemperatuur.
    3. Resuspendeer de kralen in 1,5 ml steriele 0,1% runderserumalbumine (BSA) / PBS en transfer naar een 3 ml ronde bodem buis (flow cytometrie buis). Spoel de cryovial met een extra 1,5 ml 0,1% BSA / PBS en plaats het 3 ml buisje.
    4. De buis wordt op geschikte magneet en wacht 2 min totdat alle korrels zijn bevestigd aan de achterwand van de buis en de oplossing blijft helder. Verwijder afvoer en herhaal wassen met 3 ml 0,1% BSA / PBS twee keer.
    5. Resuspendeer de kralen in 3 ml 0,1% BSA / PBS en bewaar bij 4 ° C, beschermd tegen licht. Gebruik binnen 5 dagen.
  2. Etikettering CD146 + L-MSC's
    1. Oogst de mesenchymale cellen na spoelen met PBS met behulp van een zachte niet-trypsine oplossing.
      Opmerking: Volumes afhankelijk van de grootte van kweekfles (0,2 ml / cm 2 medium of PBS).
      1. Verwijder kweekmedium en spoel de cellen drie keer met steriele PBS.
      2. Voeg de juiste hoeveelheid zachte niet-trypsine oplossing (zie tabel 1). Incubeer bij 37 ° C in de incubator totdat de cellen losgemaakt, ongeveer 10 minuten bij gebruik van de oplossing in tabel 1.
      3. Inactiveren enzym door toevoeging van L-MSC kweekmedium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g.
    2. Verwijder supernatant, resuspendeer cellen in 0,1% BSA / PBS en tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde cel tegen te gaan.
      Opmerking: Het volume van 0,1% BSA / PBS afhankelijk van de grootte van kweekfles: streven naar 5 of 10 ml 0,1% BSA / PBS.
    3. Herhaal stap 2.2.2 en resuspendeer de specifieke hoeveelheid cellen in 3 ml 0,1% BSA / PBS (blokken unspecifieke binding sites en houdt de cellen in leven). Houd cellen op ijs.
    4. Bereid een 3 ml ronde bodem buis met de primaire anti-CD146 antilichaam, en blijf op ijs.
      Opmerking: De concentratie van primair antilichaam dat wordt toegevoegd aan de specifieke hoeveelheid cellen afhankelijk van het antilichaam dat wordt gebruikt. Voor een adviesprijs anti-rat CD146 antilichaam zie tabel 1.
    5. Voeg het totale volume van de cellen uit stap 2.2.3 aan de buis met het primaire antilichaam. Sluit en incubeer 30 min op een roterende steekproef mixer bij 15 rpm, 4 ° C.
    6. Centrifugeer cellen gedurende 5 min bij 500 xg, 4 ° C, verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS. Herhaal stap centrifuge.
    7. Resuspendeer de cellen in 3 ml oplossing die secundair antilichaam beklede kralen die werd bereid volgens de instructies in paragraaf 2.1 en incubeer 30 min op een roterende steekproef mixer bij 15 rpm, 4 ° C.
  3. Het selecteren van CD146 + L-MSC's
    1. Plaats de buis met het label CD146 + L-MSCs op de magneet. De positieve cellen wordt gevestigd op de achterkant van de buis. Zonder het verplaatsen van de buis of het aanraken van de kralen, de oogst van de bovenstaande vloeistof met de negatieve cellen langzaam met een steriele Pasteur pipet (deze kunnen ofwel worden afgehaald of weggegooid op basis van de experimenteel design).
    2. Haal de buis uit de magneet en resuspendeer de cellen in 3 ml 10% BSA / PBS. Herhaal de selectieprocedure in stap 2.3.1 beschreven. vier keer (Σ 5 selectie stappen).
    3. Resuspendeer de CD146 + L-MSC in voorverwarmde L-MSC kweekmedium en terug naar de magneet.
    4. Verwijder supernatant, resuspendeer in L-kweekmedium en MSC plaat in een geschikt formaat kolf (0,2 ml / cm 2). Als vuistregel plaat cellen in dezelfde grootte kolf waaruit de cellen werden vóór bead-selectie opgeheven. Het aantal CD146 + L-MSC's, en derhalve de plaatdichtheid, zalafhankelijk van de leeftijd, soort en stam van de dierlijke bron. Streven altijd naar een plating dichtheid van ~ 5000 cellen / cm2.
      Opmerking: De kralen zal niet verstoren de celgroei en zal geleidelijk verdwijnen als de cellen vermenigvuldigen.

3. vriescellen

  1. Gebruik de volgende vriesmedium: 60% pentazetmeel-oplossing (10% pentazetmeel in 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% dimethylsulfoxide (DMSO) 22.
    Opmerking: Indien niet alle ingrediënten zijn, een oplossing die 5% DMSO, 30% FBS en 65% aMEM is een goed alternatief.
  2. Resuspendeer cellen bij 0,5 x 10 6 cellen / ml, in cryovials hoeveelheid van 1 ml elk en vries O / N bij -80 ° C met een bevriezing container.
  3. Verwijzing naar een vloeibare stikstof opslagtank de volgende dag.

4. Ontdooien Cellen

  1. Dooi een flacon van cellen in een 37 ° C waterbad gedurende 5 min.
  2. Resuspendeer cellen in 10 mlvoorverwarmd kweekmedium en centrifugeer 5 min bij 500 xg, 21 ° C.
  3. Verwijder supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml kweekmedium. Zaadcellen in een ontluchtingsdop celkweek behandeld kolven bij 5000 cellen / cm2 in 0,2 ml / cm2 media (bijvoorbeeld 15 ml voor een 75 cm2 kolf).
  4. Kweekcellen in 5% O2, 5% CO2 totdat 80-90% confluent voor het oogsten en / of experimenteel gebruik. Over-confluentie zal differentiatie induceren. Wanneer zaaien bij 5.000 cellen / cm 2, zal L-MSC's 80-90% confluentie bereiken binnen 3-4 dagen van de cultuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Twee van de meest betrouwbare fysische eigenschappen van MSCs, dichtheid en kunststof hechting, worden in het eerste deel van dit protocol om de mesenchymale celfractie van de long die L-MSC's bevat te verkrijgen. Hoewel de dichtheidsgradiënt interfase omvat monocyten en macrofagen naast long mesenchymale cellen, de plastic hechting gevolgd door 3-5 dagen kweken zorgt ervoor dat alleen de long mesenchymale cellen blijven. Inderdaad deze celpopulatie drukt de klassieke MSC oppervlak m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De isolatie en de cultuur van primaire L-MSC's biedt een kans om hun functie en hun interactie met andere celpopulaties op cellulair niveau, en hun rol in de ontwikkeling van de longen, gezondheid en ziekte beter te begrijpen. Dit is vooral belangrijk omdat het ontbreken van één specifieke marker van deze cellen maakt het bijna onmogelijk om deze cellen te bestuderen in situ. Zoals bij alle primaire cel populaties, moet men in gedachten houden dat deze cellen meer kans om hun karakter te veranderen hoe lang...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

JJPC wordt ondersteund door een postdoctorale beurs van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR). MAM ontvangt een verdienstebeurs van de German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes en wordt ondersteund door een subsidie van de EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT wordt ondersteund door CIHR, de Canadian Lung Association, het Stem Cell Network en het Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Neutral ProteaseWorthington Biochemical CorporationLS02104Bereiden op de dag van isolatie en bewaren bij 4 °C tot gebruik
Collagenase IWorthington Biochemical CorporationLS004196Bereiden op de dag van isolatie en bewaren bij 4 °C tot gebruik
DNAse ISigma-AldrichD5025Bereiden op de dag van isolatie en bewaren bij 4 °C tot gebruik
Pentobarbital sodium (Euthanyl)Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland-Gebruik 0,2 ml voor rattenpups tussen 20-30 g; grotere dieren kunnen meer nodig hebben.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + GlucoseLife Technologies14287-072Zeer cruciaal om dit type D-PBS te gebruiken, omdat het calcium en magnesium dat aanwezig is in deze D-PBS de enzymatische vertering vergemakkelijken
Ficoll-Paque PREMIUM (1,073 g/cm3)GE Healthcare17-5446-52Dichtheidsgradiënt media. Om een goede interfase te verkrijgen, is het cruciaal dat de laagvorming van de enkellaags cellensuspensie plaatsvindt onder een hoek van >45° op zeer lage snelheid, en dat de daaropvolgende centrifugatie wordt gedaan bij 19 °C.
αMEMSigma-AldrichM8042Verwarm in een 37 °C waterbad voor gebruik
200 mM L-GlutamineLife Technologies25030-164
100x Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062Penicilline/Streptomycine/Fungizone
M-280 DynabeadsLife Technologies11205DMagneetkralen
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgGDako, Agilent TechnologiesE0464Biotinyleerde secundair antilichaam dat overeenkomt met het anti-rat CD146 antilichaam beschreven hieronder
DynaMag5-magneetLife Technologies12303DMagneet die wordt aanbevolen voor gebruik met Dynabeads. OPMERKING: magneet moet worden gekozen op basis van de instructies van de fabrikant van de magneetkralen van keuze.
TrypLE express Life Technologies12605-028Zachte niet-trypsine alternatief, gebruik 1 ml TrypLE express/25 cm2 oppervlakte. Na loskoppeling is 10 ml L-MSC kweekmedium voldoende om 3 ml TrypLE te inactiveren
anti-rat CD146 antilichaamLifespan Biosciences Inc.C3584112,5 μl per 0,5 x 106 cellen
Pentaspan (pentastarch oplossing)Bristol-Myers Squibb Canada-Kan worden verkregen via lokale bloedgeversorganisaties of hematologieafdelingen. Als alternatief zou men de PSI 20% Pentastarch oplossing (Preservation Solutions, PST001) kunnen gebruiken, verdund 1:1 met 0,9% NaCl.
Mr. Frosty invriescontainerThermoFisher Scientific5100-0001Verbetert de levensvatbaarheid bij het invriezen van L-MSC's 's nachts bij -80 °C

Referenties

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498(2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CD146 positieve cellenenzymatische digestiedichtheidsgradi ntcentrifugatieselectie met magnetische beadsplasticadherentieisolatie van rattenlongencelkulturprotocolMSC oppervlaktemarkersweefseldigestie
Isolatie van CD146
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.