Methodenartikel

Het halen van Metrics voor Driedimensionale Root Systems: Volume en Surface Analysis van In-bodem X-ray Computed Tomography Gegevens

DOI:

10.3791/53788

⸱

26 april 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een methodologie voor het verkrijgen van visuele en kwantitatieve wortel structuur informatie van X-ray computertomografie data verkregen in de bodem wordt gepresenteerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plantenwortels spelen een cruciale rol in de plant-bodem-microbe interacties die plaatsvinden in de rhizosfeer, evenals processen met belangrijke implicaties voor de klimaatverandering en gewasbeheer. Kwantitatieve grootte informatie over de wortels in hun eigen omgeving is van onschatbare waarde voor het bestuderen van wortelgroei en ecologische processen met planten. X-ray computed tomografie (XCT) is aangetoond dat een effectief instrument voor in situ wortel scanning en analyse. Ons doel was om een ​​kosteloze en efficiënt instrument dat het oppervlak en het volume van de wortel benadert, ongeacht de vorm van driedimensionale (3D) tomografie gegevens te ontwikkelen. De wortel structuur van een Prairie dropseed (Sporobolus heterolepis) specimen werd in beeld gebracht met behulp van XCT. De wortel werd gereconstrueerd, en de primaire wortel structuur werd uit de gegevens gehaald met behulp van een combinatie van een licentie en open-source software. Een isosurface veelhoekige mesh werd vervolgens gemaakt voor het gemak van de analyse. We hebben ontwikkeld tHij standalone applicatie imeshJ, gegenereerd in MATLAB 1, root volume en de oppervlakte van de maas te berekenen. De uitgangen van imeshJ zijn oppervlak (in mm 2) en het volume (in mm 3). De werkwijze, gebruik van een unieke combinatie van instrumenten van beeldvorming wortel kwantitatieve analyse wordt beschreven. Een combinatie van XCT en open-source software bleek een krachtige combinatie om niet-invasief beeld De installatie wortel monsters, segment wortel data, en extract kwantitatieve informatie uit de 3D data. Deze methode van de verwerking van 3D-gegevens moet van toepassing zijn op ander materiaal / monster systemen waar sprake is van connectiviteit tussen componenten van soortgelijke X-ray demping en moeilijkheden ontstaan ​​met segmentatie zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wortels, als onderdeel van de rhizosfeer 2-5, vormen een "onzichtbare" deel van plantenbiologie omdat bodem bemoeilijkt beeld wortels niet-invasief 6, 7. Echter bestuderen wortelgroei en interactie in het bodemmilieu is cruciaal inzicht root / plantengroei en nutriënten cycli, die op hun beurt van invloed zijn bebossing, voedselzekerheid, en het klimaat. X-ray computertomografie (XCT) heeft zich bewezen als een waardevol instrument voor niet-invasieve beeldvorming van plantenwortels monsters in hun lokale omgeving 8 zijn. Om de ontwikkeling van de wortels en dimensionele veranderingen onder verschillende omstandigheden te meten, en in staat zijn om gegevens uit verschillende datasets / exemplaren te vergelijken, moet men kwantitatieve informatie uit de tomografie gegevens kan opvragen. Segmentatie van de wortel gegevens van die van de omringende grond, dat wil zeggen de isolatie beeld de wortel van alles heen (inclusief, bijvoorbeeld een naburige plant) is een belangrijke stap voor accusize analyse tarief kan worden gedaan. Echter, een eenvoudige drempelwaarde aanpak is vaak niet haalbaar voor root data. De uitdagingen in verband met beeldvorming plantenwortels in de bodem omvatten variaties in de X-ray verzwakkingseigenschappen van het wortelmateriaal en de overlap in dempingswaarden tussen wortels en bodem door water en organisch materiaal. Deze kwesties zijn prachtig onlangs aangepakt door Mairhofer et al. in hun visuele tracking tool RooTrak 7, 9. De volgende stap na een succesvolle segmentatie is de nauwkeurige bepaling van de root volume en de oppervlakte. Het volume kan worden geschat door het tellen van het aantal voxels en te vermenigvuldigen met de voxels 'size blokjes zoals vóór 7. Voor een meer nauwkeurige bepaling van wortel oppervlakte en volume, kunnen de isosurface van de gesegmenteerde wortelstelsel worden vertegenwoordigd door een netwerk van driehoeken, met behulp van een algoritme bekend als Marching Cubes 10. De open source ImageJ 11 kan worden gebruikt om e benaderene root volume op basis van de Marching Cubes algoritme. Voor zover ons bekend, slechts een beperkt aantal open-source software gewijd aan de berekening van tomografie op basis van volume / oppervlak gegevens voor root specimens aan de centimeter bereik en vooral is momenteel beschikbaar 12. Een open-source software hebben we gekeken naar 13 richt zich op de wortelgroei en is gericht op mobiele features waardoor kwantitatieve volume analyse op single-cell resolutie. Een aantal open-source software gewijd aan het hele wortelstelsel 14 is uitstekend geschikt voor kleine diameter buisvormige root-systemen op basis van de onderlinge dat hun vorm is eigenlijk buisvormig. Sommige werken met 2D beelden zijn en niet kunnen verwerken 3D stapels 14. Bovendien kan de buisvorm onderlinge ongeldig wanneer wortelsystemen met ruwe oppervlakken en niet-uniforme vormen, zoals bomen, bestudeerd. Een andere benadering 15 maakt gebruik van tweedimensionale (2D) image sequenties rotatie innovatief omzeilen the nodig heeft voor een dure CT-scanner. Het meet, records en displays wortelstelsel lengtes. De software die we hebben getest uit die alleen in de handel verkrijgbaar 16-18; men niet kunnen verwerken 3D beeld stapels 16, de tweede is een bladoppervlak en wortellengte meetinstrument 17, terwijl de derde is gebaseerd op kleuranalyse 18. Op basis van dit onderzoek, stellen we voor dat een kosteloze optie die het oppervlak en het volume van de wortel benadert, ongeacht de vorm van 3D tomografie data gewenst is.

Voortbouwend op de vrij beschikbare RooTrak en ImageJ, hebben we een programma, genaamd imeshJ ontwikkeld (zie Aanvullende Code File), die een isosurface mesh (oppervlakte stereolithografie file) gegenereerd uit gesegmenteerde wortel data verwerkt, en berekent het volume en de oppervlakte van de wortel van het doen van eenvoudige geometrische berekeningen op de maas driehoek index data. Hier beschrijven we een werkwijze die het gebruik van XCT-beelden worden gecombineerd,data reconstructie en visualisatie (software CT Pro 3D en VG Studio), segmentatie van de wortel van het monster uit de bodem in de 3D-data (open-source software ImageJ en RooTrak), en extractie van het oppervlak en het volume van informatie uit een driehoekige mesh (ImageJ en de computer code imeshJ).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Let op: De werking van een X-ray tomografie scanner vereist zowel algemene straling opleiding en instrument-specifieke veiligheidseisen straling training. Alle bijbehorende procedures om het laboratorium van de experimentator relevant moet worden gevolgd.

1. Root Imaging

Opmerking: deze stap wordt de beeldvorming van een gras specimen gehouden in de oorspronkelijke bodem in een buisvormige plastic pot (een plastic buis met een diameter van 40 mm, een hoogte van 210 mm en een wanddikte van ongeveer 2 mm).

  1. Plaats potplant op het monster manipulator van het instrument op een gewenst voor het doel vergroting afstand. Voor een installatie in een diameter houder 2-inch, moet het monster bron afstand ongeveer 3 inch (7 cm).
  2. Stel de X-ray scan-instellingen om een ​​optimale kleur (grijs-niveau) contrast image detector bereiken. Opmerking: Deze instellingen zijn beschikbaar in het instrument besturingssoftware gebruikt.
    1. Set X-ray energie-instellingen; 85 kV en 190 uA werden bij dit examenple.
    2. Stel belichtingstijd. Hier, een relatief lange belichtingstijd van 1 seconde werd gebruikt voor een betere signaal-ruisverhouding.
    3. Stel het aantal projecties en frames per projectie; 4 frames per projectie voor een totaal van 3142 projecties wordt voorgesteld voor een goede data statistieken.
    4. Voer een schaduw correctie met behulp van de meting bovenvermelde voorwaarden door het tabblad "Shading correctie", en klikken op "Maak".
      Opmerking: De arcering compenseert voor de variatie in de respons van pixels van de beeldvormende inrichting wanneer verlicht met een constante reeks X-ray flux. Het proces duurt lege foto's (met voorbeeld uit stralengang) met de röntgenbundel ingeschakeld en met de bundel uitgeschakeld. Deze correctie wordt toegepast op alle foto's verzameld.
    5. Kies de optie 'Minimaliseer ring artefacten "(ook wel" pendelen mode "); het monster zal worden gedraaid in hoekig stappen, terwijl de projectie-beelden worden verkregen. Dit leidt tot DATeen overname in een trager tempo, maar helpt bij het elimineren ring artefacten.
    6. Start de scan door te klikken op de "Acquire" knop onder het tabblad Acquisition (met de hierboven geschetste instellingen, afbeelding collectie zal ongeveer 4 uur duren).

Reconstructie 2. Gegevens

Opmerking: Dit deel beschrijft de reconstructie van 3D-volume gegevens van het RAW-afbeeldingen (röntgenfoto van de CT-scan).

  1. Laad de ruwe gegevens in het programma.
  2. Eerste en laatste beeld te vergelijken (ze moeten bijna identiek als het laatste beeld is genomen na een 360 o rotatie van het monster) om te zorgen dat het model niet verplaatsen of de scaninstellingen niet veranderen tijdens data-acquisitie.
  3. Bereken het draaipunt (COR) door het tabblad "Center of rotation", en te klikken op "Start"; gebruik opties "Automatic" COR vinden met "hoge kwaliteit" nauwkeurigheid, en de "Dual" (boven en onder) slice sverkiezing voor COR berekening.
  4. Selecteer het monster volume te reconstrueren: selecteer het tabblad "Volume", en het volume selectie ramen met behulp van de miniaturen te bewerken.
  5. Voer de wederopbouw van het volume-bestand met 3D-data te creëren door te klikken op "Start".

3. Data Processing / Segmentatie

Opmerking: Dit deel beschrijft de stappen die moeten worden genomen om de gereconstrueerde gegevens voor verdere verwerking in het programma RooTrak wortels volgen bereiden zoals ze vertakken in de bodem, en het isoleren van de wortels van alle omringende materiaal om een ​​stapel van binaire beelden van alleen de productie van wortel zelf.

  1. Verwerking van datavolume in ImageJ een RooTrak afbeelding verwerkbare stapel te bereiden:
    1. Laad het volume-bestand in ImageJ.
    2. Optimaliseer het contrast tussen de wortel en de bodem door het aanpassen van de helderheid en contrast (Klik op de afbeelding / Aanpassen / Helderheid / Contrast). Wanneer de regio van belang binnen het beeld zichtbaar is en clearly onderscheiden, worden de instellingen beschouwd geoptimaliseerd.
    3. Opslaan als een afbeelding stapel in jpeg, bmp of png-formaat.
  2. Verwerking in RooTrak segmenteren de wortel:
    1. Load image stapel in RooTrak (ga naar het tabblad "Extra", en druk op "Tracker").
    2. Stel zaad punten binnen root: klik op een aantal punten in elk van de betreffende baanvakken zichtbaar in de top slice van het datavolume uitzicht.
    3. Stel tracker parameters "gladheid" en "Gelijkenis" naar 0,3 en 0,8, respectievelijk.
    4. Voer de tracking-functie. Dit zal de wortel volgen vanaf de bovenkant slice helemaal naar de bodem slice.
    5. Na het bekijken van de hoeveelheid data, selecteer het aantal schijfjes op basis van de bruikbare hoeveelheid gegevens; in dit geval werd het volgen gestopt bij 200 segmenten, overeenkomt met een diepte van 6,2 mm, waarbij wortel grenzen werd slecht gedefinieerd (het beeld van het gevolgde wortel begon te mengen in dat van de bodem).
      Merk opafbeeldingsstapel geproduceerd wordt automatisch opgeslagen naar de plaats waar de output directory is gemaakt.

4. Volume en Surface Analysis

Opmerking: Deze stap beschrijft de isosurface maas generatie uit de afbeelding stapel gecreëerd door RooTrak.

  1. Omzetten image stapel uit RooTrak in een binair beeldformaat in ImageJ. Selecteer "Process", dan "Binary", dan "Make Binary".
  2. Gebruik de open-source ImageJ plugin, BoneJ, de driehoekige mesh te creëren; in ImageJ selecteer "Plugins", dan "BoneJ", dan "isosurface".
  3. Stel "Resampling" en "Threshold" tot en met 6 en 120, respectievelijk (standaardinstellingen). Vink "Show oppervlak", en druk op de knop "OK".
  4. Op de "3D-viewer" klik op het tabblad Bestand en vervolgens op "Export vlakken", vervolgens opslaan als 'STL (binary) ".
  5. Open imeshJ, selecteer het STL bestand en voert voxel grootte in micron. Klik op 'Calculate Oppervlakte "naar de totale steekproef wortel oppervlakte Op dezelfde manier te verwerven in 2 mm., klikt u op" Bereken Volume "om de totale steekproef rootvolume verkrijgen mm 3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het monster bestaat uit twee stammen van het natieve grasprairie dropseed (Sporobolus heterolepis) en de oorspronkelijke bodem eromheen is gemaakt van een woonwijk en in een kleine buisvormige houder gezien in figuur 1. De gereconstrueerde data voxel ongeveer 31 um x 31 urn x 31 urn. De gereconstrueerde volume file werd gebruikt om een stapel foto's maken op basis van een gekozen oriëntatie (bovenaanzicht) met behulp van de open-source beeldbewerkingsprogram...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een combinatie van X-ray computertomografie en diverse open-source programma's bleek een krachtige combinatie om niet-invasief beeld De installatie wortel monsters, segment wortel data, en extract kwantitatieve informatie (oppervlakte en volume) van de 3D-gegevens. Ons vermogen om te visualiseren en meten functies altijd beperkt door scanresolutie, en door beperkingen van de RooTrak software. Echter scanresolutie voldoende om de meeste van de kenmerken van het monster in deze studie vangen en RooTrak kon succesvol s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd uitgevoerd in het Environmental Molecular Sciences Laboratory, een nationaal wetenschappelijk gebruikersfaciliteit gesponsord door het Department of Energy's Office of Biological and Environmental Research en gelegen in het Pacific Northwest National Laboratory.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
X-Tek/Metris XTH 320/225 kV Nikon MetrologyX-ray tomografiescanner
Inspect XNikon MetrologyInstrumentbesturingssoftware
CT Pro 3DNikon MetrologyReconstructiesoftware, versie XT 2.2
VG Studio MAXVisual Graphics GmbHVisualisatiesoftware voor 3D-volumes, versie 2.1.5
ImageJOpen-sourceAfbeeldingsverwerkings- en analysesoftware, versie 1.6
RooTrakOpen-sourceWortelsegmentatiesoftware, versie 0.3.1-b1 beta
imeshJEMSLMATLAB-script ontwikkeld door de auteurs
Prairie dropseed grass sampleMonster verkregen uit de grond in een woonwijk

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. MATLAB. , The Mathworks, Inc. Available from: http://www.mathworks.com/products/matlab (2015).
  2. McKenzie, B. M. The Rhizosphere: An Ecological Perspective. Eur. J. Soil Sci. 59 (2), 416-417 (2008).
  3. Farrar, J., Hawes, M., Jones, D., Lindow, S. How roots control the flux of carbon to the rhizosphere. Ecology. 84 (4), 827-837 (2003).
  4. Gregory, P. J. Roots rhizosphere and soil: the route to a better understanding of soil science? Eur. J. Soil Sci. 57 (1), 2-12 (2006).
  5. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., van der Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
  6. Gregory, P. J., Hutchison, D. J., Read, D. B., Jenneson, P. M., Gilboy, W. B., Morton, E. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant and Soil. 255 (1), 351-359 (2003).
  7. Mairhofer, S., et al. RooTrak: Automated Recovery of Three-Dimensional Plant Root Architecture in Soil from X-Ray Microcomputed Tomography Images Using Visual Tracking. Plant Physiol. 158 (2), 561-569 (2012).
  8. Soil-Water-Root Processes: Advances in Tomography and Imaging. Anderson, S. H., Hopmans, J. W. , Soil Science Society of America. United States. (2013).
  9. Mairhofer, S., et al. Recovering complete plant root system architectures from soil via X-ray mu-Computed Tomography. Plant Methods. 9, 8(2013).
  10. Lorensen, W. E., Cline, H. E. Marching cubes: a high resolution 3D surface construction algorithm. Comput. Graph. 21 (4), 163-169 (1987).
  11. ImageJ: Image Processing and Analysis in Java. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2014).
  12. Lobet, G., Draye, X., Perilleux, C. An online database for plant image analysis software tools. Plant Methods. 9 (38), (2013).
  13. Schmidt, T., et al. The iRoCS Toolbox - 3D analysis of the plant root apical meristem at cellular resolution. Plant J. 77 (5), 806-814 (2014).
  14. Galkovskyi, T., et al. GiA Roots: software for the high throughput analysis of plant root system architecture. BMC Plant Biol. 12, 116(2012).
  15. Clark, R., et al. 3-Dimensional Root Phenotyping with a Novel Imaging and Software Platform. Plant Physiol. 156, 455-465 (2011).
  16. RootSnap!. , CID Bio-Science. Available from: https://www.cid-inc.com (2013).
  17. Skye Leaf Area and Analysis Systems and Root Length Measurement System. , Skye Instruments Limited. Available from: http://www.skyeinstruments.com/products/plant-analysis-systems/leaf-arearoot-length-systems (2014).
  18. Arsenault, J. L., Pouleur, S., Messier, C., Guay, R. WinRHIZO™ a root-measuring system with a unique overlap correction method. HortSci. 30, 906-906 (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

X ray Computed TomographyRoot Volume AnalysisSurface Area Measurement3D Tomography DataIn soil ImagingRoot SegmentationIsosurface MeshIMESHJ ApplicationRooTrak TrackingBoneJ Plugin

Gerelateerde artikelen