Methodenartikel

Myeloïde Cell Isolatie van Mouse Skin en aftappen lymfkliertest Na Intradermal Immunisatie met levende verzwakte

DOI:

10.3791/53796

⸱

18 mei 2016

 ,  ,  , 
1Unité de Biologie et Génétique du Paludisme, Institut Pasteur, 2Unité dImmunobiologie des Cellules Dendritiques, Institut Pasteur

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven hier een protocol voor het isoleren van myeloïde cellen uit muizenhuid en drainerende lymfknoop na intradermale injectie van Plasmodium sporozoïeten. Stroomcytometrie van de verzamelde cellen biedt een betrouwbare test om de ontstekingsreactie in de huid en de drainerende lymfknoop op de parasiet te karakteriseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria infectie begint wanneer de sporozoieten stadium van Plasmodium wordt geïnoculeerd in de huid van een zoogdiergastheer door een muggenbeet. De zeer beweeglijk parasiet niet alleen bereikt de lever hepatocyten binnen te vallen en te transformeren in erytrocyten-infectieuze vorm. Migreert ook in de huid en de proximale lymfeklieren afvoer de injectieplaats, waar het kan worden herkend en afgebroken door bewoner en / of gerekruteerde myeloïde cellen. Intravitale beeldvorming meldde de vroege werving van helder fluorescente Lys-GFP positieve leukocyten in de huid en de interacties tussen sporozoieten en CD11c + cellen in de drainerende lymfeklier. We presenteren hier een efficiënte procedure om te herstellen, te identificeren en op te sommen de myeloïde cel subsets die worden gerekruteerd om de muis huid en drainerende lymfeklier na intradermale injectie van immuniseren doses van sporozoieten in een muismodel. Fenotypische karakterisering met behulp van multi-parametrische stroom levert cytometrieeen betrouwbare test om vroege dynamische cellulaire veranderingen tijdens ontstekingsreactie Plasmodium infectie te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria is een van de dodelijkste besmettelijke ziekten in de wereld, het doden van meer dan een half miljoen mensen per jaar. Infectie door Plasmodium, de veroorzaker van de ziekte, begint met een pre-erytrocytaire (PE) fase. Tijdens deze fase sporozoieten geïnjecteerd in de gastheer huid door een vrouwelijke Anophelinen mug bereikt de lever via de bloedstroom en differentiëren in hepatocyten in de parasiet vormen die rode bloedcellen infecteren, waardoor de symptomen van de ziekte.

De PE van Plasmodium vormen een bevoorrechte doelwit voor anti-malaria vaccinatie. Sterker nog, levende verzwakte vaccins tegen deze fasen, zoals straling verzwakt sporozoieten (RAS), hebben genetisch gearresteerd parasieten (GAP) of chemoprofylaxe en sporozoieten (CPS) hun vermogen om zowel knaagdieren en menselijke gastheren 1-9 beschermen aangetoond. In het knaagdier model meeste vaccinatiestudies uitgevoerd met gebruikmaking intraveneuze immunisatie, De gouden standaard op het gebied van beschermende werkzaamheid. Echter, de beschrijving van een skin podium en het belang van de huid geassocieerd drainerende lymfeklier (DLN) in het uitlokken van de bescherming van onze perceptie van de PE-fase veranderd en benadrukte het belang van de intradermale route van injectie. Intravitale beeldvorming van P. berghei sporozoieten geïnjecteerd in de huid van knaagdieren heeft aangetoond dat slechts ~ 25% van het inoculum de lever via de bloedbaan bereikt. De resterende 75% ~ verdeelt tussen de proximale DLN (~ 15%) en de huid (~ 50%) 10,11, waarbij een klein deel kan transformeren en in leven blijven wekenlang in huidcellen 12,13. Bovendien latere studies beschreven dat de oprichting van effectieve beschermende immuniteit na intradermale immunisatie vindt vooral plaats in de huid-DLN, waar de parasiet specifieke CD8 + T-cellen worden geactiveerd, en slechts marginaal in de milt of lever-DLN 14,15.

Terwijlde meeste studies hebben zich geconcentreerd op de karakterisering van de effectorcellen betrokken bij de totstandkoming van beschermende immune respons, veel minder bekend over het lot van levende verzwakte parasieten geïnjecteerd in de huid, met name hun interactie met het aangeboren immuunsysteem. Vooral karakterisatie van antigeen presenterende cellen die deze parasiet antigen opname, verwerking en presentatie aan CD8 + T-cellen is van groot belang in de wetenschap dat PE antigen overname kan plaatsvinden zowel in de huid en dln compartimenten. Previous intravitale imaging studies beschreven een vroege toestroom van helder fluorescente Lys-GFP positieve cellen in de huid na een besmettelijke mugbeet 16 Terwijl eerder interacties tussen sporozoieten en dendritische cellen in de DLN 10,17 waargenomen. Meer recent is gerapporteerd dat sporozoieten geïnoculeerd in de huid door muggen verhoogt de motiliteit van zowel dendritische en regulatoire T cellen in de huid vanmuizen, terwijl het verlagen aantal antigeen presenterende cellen werd waargenomen in de DLN 18.

Ons doel identificatie en kwantificering nauwkeuriger de leukocyten subsets geworven in de huid en overeenkomstige DLN evenals die interactie met de parasiet na intradermale injectie van immuniserende dosis RAS 19. In deze context, die we myeloïde cellen (CD45 + CD11b +) Beide weefsels kenmerk subpopulaties plaats door multi = parametrische flowcytometrie. Consistent met de immuunrespons in de vroege fase van Leishmania major huidinfectie 20 beschreven, de primaire gastheer respons op injectie sporozoieten bestaat uit een opeenvolgende rekrutering van polymorfonucleaire neutrofielen (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) gevolgd door inflammatoire monocyten (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +), die zijn geïdentificeerd op basis van de verscal expressie van de Ly6G en Ly6C oppervlaktemerkers.

We beschrijven hier een protocol voor het isoleren van myeloïde cellen van de muis huid en DLN na intradermale injectie van immuniseren doses van RAS geëxtraheerd uit besmette mug speekselklieren. Reproduceerbare intradermale injecties en de verwerking van het weefsel zijn kritische stappen om fenotypische veranderingen van infiltrerende cel populatie binnen geïnfecteerde weefsels te kwantificeren. De aanpak hieronder verschaft een betrouwbare test om de huid en DLN ontstekingsreactie op Plasmodium parasiet beoordelen en kan worden uitgebreid tot verschillende experimentele systemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden goedgekeurd door de commissie van het Instituut Pasteur en door de lokale ethische commissie inzake dierproeven (Ethische commissie IDF-Paris 1, Parijs, Frankrijk; overeenkomst nummer: 2012-0015) en uitgevoerd in overeenstemming met de geldende richtlijnen en voorschriften.

1. Materialen en Reagentia

  1. Gebruik vrouwelijke Anopheles stephensi muggen (Sda500 stam) die zich voeden met besmette muizen 3-5 dagen na de opkomst en achter, zoals eerder 21 beschreven.
  2. Gebruik parasieten Plasmodium berghei ANKA kloon tot expressie Green Fluorescent Protein (GFP) gen onder controle van de constitutieve hitteshockproteïne 70 (HSP70) promoter. Dit levert heldere fluorescentie gedurende de parasiet levenscyclus 22.
  3. Gebruik vrouwelijke C57BL / 6JRj muizen (7 weken oud).
    LET OP: Alle gebruikt in de beschreven protocol reagentia zijn vermeld in de T staat of Materials / Equipment.
_title "> 2. Straling-verzwakte sporozoiet Isolatie van Mosquito speekselklieren

  1. Tussen 18-25 dagen na de besmettelijke bloedmeel, te verzamelen en koude-verdoven muggen in een 15 ml buis op ijs zoals eerder 21 beschreven. Voorzichtig overbrengen naar een petrischaal van het buisje. Handhaving van de insecten op het ijs en bloot de muggen om een ​​12 krad dosis van γ- of x-straling.
  2. Isoleer verzwakte sporozoieten van bestraalde mosquito speekselklieren zoals eerder beschreven 21. Verzamel geïnfecteerde speekselklieren in een klein volume (ongeveer 15 pl) van 1 x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) op ijs en voorzichtig breken ze sporozoieten vrij.
    OPMERKING: De injectie van een sterk geconcentreerde parasiet suspensie in een klein volume kritisch is daarom essentieel om voldoende speekselklieren oogsten uit een groot aantal vooraf goed geïnfecteerde muggen, zoals blijkt uit hun robuuste expressie vangroen-fluorescentie.
  3. Filtreer de sporozoïet suspensie door een 35 um zeef cel dop aangepast om een ​​lage wrijvingscoëfficiënt 1,5 ml microcentrifugebuis om klonten en brokstukken muggen elimineren.
  4. Tel het aantal sporozoieten geïsoleerd zoals eerder beschreven 21 en dient de concentratie van parasiet suspensie met koud DPBS 1x tot 83.000 sporozoieten / ul te verkrijgen. Bewaar de parasieten op het ijs, terwijl de voortzetting van de volgende stappen.
  5. Verzamel de equivalente aantal speekselklieren van geïnfecteerde muggen die worden gebruikt als negatieve controle en verwerkt het monster, zoals beschreven in stappen 2,2 en 2,3. Verdun het monster zoals hierboven beschreven met gelijkwaardige concentratie speekselklier extracten in de suspensie te verkrijgen.
    OPMERKING: sporozoieten worden opgeslagen op ijs gedurende maximaal 2 uur. Echter, zij idealiter worden geïnjecteerd binnen een uur na het breken van de speekselklieren.

3. Injectie van sporozoieten in de Huid Layer van het Oor

  1. Verdoven dieren door intraperitoneale injectie van ketamine (50 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg) mengsel. 5-8 min wachten voor de muis in een toestand van bewusteloosheid en oftalmische zalf op de ogen om het hoornvlies uitdroogt. Evalueer de diepte van de anesthesie door het uitvoeren van een zachte teen knijpen aan beide achterpoten.
    OPMERKING: De dosis anesthesie duurt minder dan 20 minuten, zodat de volgende stappen moet snel gebeuren.
  2. Het stabiliseren van het oor oorschelp van de muis door de vaststelling van de ventrale kant met doorzichtige tape die eerder onder een stereomicroscoop (figuur 1A) geplaatst. Druk de oor om beschadiging van de bloedvaten te voorkomen.
  3. Laad een 10 ul injectiespuit / 35 gauge schuine naald met 0,6 pi geresuspendeerd parasieten 10.
  4. Lever de sporozoiet suspensie in 4 injectieplaatsen (0,15 pi per plaats), door voorzichtig de naald aan de rugzijde van het oor (figuur 1A), onder de epidermis, metde schuine kant op, zorg ervoor dat elke bloedvaten te voorkomen. Laat de naald in de lederhuid blijven gedurende een paar seconden om terugstromen van de geïnjecteerde voorkomen voordat verwijderen. Observeren eigenschap papule per injectie plaats aan het einde van de procedure (figuur 1B en 1C).
  5. Na injectie, verwijder voorzichtig het oor van de tape.
  6. Spuit de contralaterale oor met dezelfde dosis van parasieten door de stappen 3,2-3,4.
  7. Injecteer 2 additionele muizen met hetzij 0,6 pl 1x DPBS of 0,6 pl 1x DPBS + speekselklier extract van geïnfecteerde muggen om de ontstekingsreactie gemedieerd door de injectie staan ​​de afzetting van mug materiaal in de dermis te evalueren.
  8. Monitor muis herstel van de anesthesie voordat u het terug in de kooi.
    OPMERKING: De juiste sporozoiet afzetting in de huid kan worden gecontroleerd door fluorescentie microscopie (figuur 2A en 2B), De muis worden bereid zoals previsously 23 beschreven.

4. Huid en aftappen lymfklierdissectie

  1. Bereid standaard medium (SM) als volgt: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), aangevuld met 400 U / ml collagenase en 50 ug / ml desoxyribonuclease (DNase) .
  2. Bereid twee 6 putjes met vlakke bodem weefselkweek platen op ijs met 4,5 ml SM + 70 micrometer cel zeef per goed voor DLN monsters (Plate A) en 4,5 ml SM per goed voor de huid monsters (Plate B).
  3. Op het gewenste tijdstip na inoculatie sporozoieten diep verdoven de muis door intraperitoneale injectie van ketamine (125 mg / kg) / xylazine (12,5 mg / kg) mengsel voorafgaande cervicale dislocatie. Zorg ervoor dat de muis toont tekenen van klinische dood en beginnen met de dissectie onmiddellijk.
    OPMERKING: De kinetiek van myeloïde celrecrutering kunnen op verschillende tijdstippen na inj onderzochtectie (bijvoorbeeld 2 uur, 4 uur en 24 uur zoals eerder beschreven 14).
  4. Desinfecteren geïnoculeerde oor en de bijbehorende nek met 70% ethanol om de mogelijkheid van verontreiniging te verminderen.
  5. Met behulp van een steriele schaar en pincet, aseptisch ontleden de proximale auriculaire DLN zonder het verzamelen van de omliggende vet. Voer een eerste incisie in de jugulo-carotidian sulcus en verwijder de haren uit het operationele veld. Rek de incisie met 2 tang om de DLN dat grijsachtig lijkt in vergelijking met het omringende weefsel bloot.
  6. Knijp het bindweefsel voorzichtig op de bovenkant van de DLN met tang om de verwijdering te vergemakkelijken. Extraheer de DLN door een tang onder het lymfoïde weefsel (Figuur 3A en 3B). Plaats de DLN in een putje met 4,5 ml SM + 70 micrometer cel zeef (Plate A).
  7. Oogst de gehele geënt oor met steriele scherpe schaar en pincet (Figuur 4A). Separaten de dorsale en ventrale aspecten van het oor door te knijpen en de afstand van elkaar de cut eindigt met twee tang (Figuur 4B - 4E). Leg ze in een putje met 4,5 ml SM (Plate B) ervoor te zorgen dat beide weefsels worden volledig ondergedompeld in het medium.
    Opmerking: Om de betrouwbaarheid van het experiment te verbeteren en het aantal cellen van belang, pool 2 geïnjecteerd aren of 2 DLN's van dezelfde muis per monster.
  8. Oogst en het proces in parallel de oren en DLNS muizen geënt met ofwel 1x DPBS of speekselklier extracten. Inclusief 2 extra oor en lymfeklieren monsters geoogst uit een naïeve muis voor de negatieve en enkele vlekken compensatie controles.

5. Cell Isolatie van lymfeklieren

  1. Incubeer de lymfeklieren (Plaat A) bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende 15 minuten onder zacht schudden. Voeg 10 mM uiteindelijke Ethyleendeniaminetetraacetaat (EDTA) per goed op collagenase en DNase acti neutraliserenteiten. Voer de volgende stappen op het ijs.
  2. Distantiëren lymfeklieren met het boveneinde van een 5 ml spuit zuiger. Druk in cirkelvormige bewegingen tegen de zeef totdat alles wat overblijft is wit bindweefsel.
  3. Spoel de cel zeef tweemaal met 500 pl 1x DPBS + 2% foetaal runderserum (FBS) + 2 mM EDTA. Transfer gehele volume van het putje in een 15 ml buis.
  4. Spoel de goed tweemaal met 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA en breng het volume in de buis van 15 ml. Houd buizen op ijs.

6. Cel Isolatie van de huid van het Oor

  1. Incubeer het oor folders (Plaat B) bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende 1 uur onder zacht schudden.
    LET OP: Na 20 min incubatie, snijd het oor folders met een schaar in kleine stukjes weefsel spijsvertering te vergemakkelijken en zet de sample terug in de incubator voor de resterende 40 min. Enkele cellen kunnen worden waargenomen in het medium aan het einde van de incubatietijd.
  2. Voeg 10 mM finale EDTA per goed op collagenase en DNase activiteiten te neutraliseren. Voer de volgende stappen op het ijs.
  3. Breng het oorweefsel fragmenten en het gehele volume van medium in een nieuw putje dat een 70 urn cel zeef met een 1 ml pipet. Snijd 2-3 mm van het uiteinde van de punt aan het oor weefselfragmenten gemakkelijker te verzamelen.
  4. Distantiëren oorweefsel fragmenten met het boveneinde van een 5 ml spuit zuiger. Druk in cirkelvormige bewegingen tegen de zeef totdat alles wat overblijft is wit bindweefsel.
  5. Spoel de cel zeven tweemaal met 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
  6. Breng de gehele volume van de put in een 50 ml-buis door een 70 um cel zeef.
  7. Spoel het goed met 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA en breng het volume in de 50 ml buis. Houd de buis op ijs.
    OPMERKING: De verschillende stappen aan totale cellen te isoleren van de huid en DLN weefsels zijn samengevat in Figuur 5.
title "> 7. Tel en levensvatbaarheid van de verzamelde cellen

  1. Centrifugeer de huid en DLN monsters 5 min bij 450 xg bij 4 ° C en werp de supernatant. Voorzichtig resuspendeer de pellet met 300 pl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
  2. Verzamel een klein volume van elk monster aan het totale aantal cellen geïsoleerd uit de huid en DLN behulp van een hemocytometer geteld. Voeg 0,04% trypan blauw aan de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen.

8. Het blokkeren van niet-specifieke antigeen bindende

  1. Voeg 10 ug / ml ongelabeld CD16 / CD32 Fc-block antilichaam. Incubeer 20 min bij 4 ° C (kan langer gaan).
  2. Voeg 2 ml koude 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifugeer het monster gedurende 5 min bij 450 xg bij 4 ° C en werp de supernatant. Voorzichtig resuspendeer de pellet met 300 pl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA en de monsters op ijs te houden.

9. kleuring van de huid en lymfkliertest myeloïde cellen

  1. Incubate eerder geblokkeerd skin en DLN geïsoleerde cellen met Live / Dead tracker (bijvoorbeeld 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool of DAPI), anti-CD45 en anti-CD11b antilichamen.
    OPMERKINGEN: Om de myeloïde cel subpopulaties plaats, vooral zeldzamen verrijken, CD45 + cellen en lymfocyten worden gezuiverd uit respectievelijk de huid of verarmd van de DLN door magnetische bead faciliterend celsortering. Aangezien de meeste van de cellen geïsoleerd uit de DLN zijn CD45 +, het gebruik van anti-CD45 is niet verplicht. Andere markers kunnen worden opgenomen om myeloïde cel subpopulaties van belang vast te stellen door positieve of negatieve-gating strategie. In dit protocol werden de myeloïde cellen gerekruteerd in de DLN verrijkt met uitzondering CD8a + -cellen (het geheel T-cel compartiment worden gericht door anti-CD3 antilichaam).
  2. Incubeer 30 min bij 4 ° C in het donker. Voeg 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, gecentrifugeerd monster 5 min bij 450 xg bij 4 ° C en werp de supernatant. Herhaal de wasstap tweemaal.
  3. Resuspendeer de monsters met 300 pl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Breng de gehele volume in een FACS buis door een 35 um cel zeef. Spoel het filter met 100 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
  4. Voer het gekleurde cellen in een flowcytometer. Gate wonen enkele cellen (DAPI -, FSC-W) om dode cellen en wambuizen uit te sluiten. Plot CD45 + CD11b + evenementen voor de huid (figuur 6A) en (CD45 +) CD8a - CD11b + evenementen voor de DLN (figuur 6B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben onlangs aangetoond dat naaldloze injectiespuit injectie van immuniserende dosis P. berghei sporozoieten in de muis huid induceert een opeenvolgende rekrutering van polymorfonucleaire neutrofielen gevolgd door inflammatoire monocyten in de huid en dln 19. De afdeling protocol hierboven beschreven welke procedure voor levende myeloïde cellen uit beide weefsels na meervoudige injecties groot aantal sporozoieten in het oor dermis succes isoleren (figuren...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het perspectief van grootschalige vaccinatie van mensen met een hele sporozoite malariavaccin, een van de belangrijkste uitdagingen te overwinnen is om routes en werkwijzen van toediening parasiet ontwikkelen om succesvolle immunisatie en bescherming 24,25 waarborgen. Bij mensen is de evaluatie van de beschermende werkzaamheid gemedieerd door levende verzwakte parasieten (LAP) uitgevoerd volgende natuurlijke muggenbeten 2, en intradermale, subcutane 25,26 en IV immunisaties 27.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Patricia Baldacci, Vanessa Lagal en Sabine Thiberge voor kritisch lezen, Irina Dobrescu en Sabine Thiberge voor hulp bij het ​​maken van foto's en Pauline Formaglio voor het onderwijs in vivo beeldvorming van sporozoiet beweeglijkheid in de muis huid. We willen ook graag Marek Szatanik en het Centrum bedanken voor Productie en Infectie van Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) voor mosquito fokken. Deze studie werd ondersteund door de AXA Research Fund en de middelen van het Laboratoire d'Excellence "Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases '(verlenen geen. ANR-10-LabX-62-IBEID).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ketamine: Imalgene® 1,000Merial-50 mg/kg: voorafgaand aan sporozoieten injectie 125 mg/kg: voorafgaand aan opoffering
Xylazine: Rompun® 2%Bayer-5 mg/kg: voorafgaand aan sporozoieten injectie 12,5 mg/kg: voorafgaand aan opoffering
NanoFil spuit + 35 gauge naaldWorld Precision Instruments --
Omnican® 50 Insuline spuit 0,5 ml/50 I.U.B. Braun Medical 9151125-
MultiwellTM 6 putjes weefselkweekplaat – Platte bodemBD Falcon 353046-
70 µm cel zeef BD Falcon 352350-
2 ml spuitTerumoSS-02S-
BLUE MAXTM 15 ml Polypropyleen kegelvormige buisBD Falcon 352097-
BLUE MAXTM 50 ml Polypropyleen kegelvormige buisBD Falcon 352098-
5 ml Polystyreen Ronde-Bodembuis met 35 µm Cel-Zeef DopBD Falcon 352235-
DPBS 1x CaCl2- en MgCl2--vrijLife Technologies14190-094-
DMEM 1x + GlutaMAXTMLife Technologies31966-021-
Collagenase uit Clostridium histolyticum, Type IV 0,5-5,0 FALGPA eenheden/mg vast Sigma-Aldrich C5138400 U/ml 
Deoxyribonuclease I uit bovien pancreas, type IV Sigma-Aldrich D502550 µg/ml
EDTA dinatriumzoutSigma-Aldrich E-513410 mM of 2,5 mM
FBSBiowestS1810-500-
HEPES bufferoplossing (1M)Gibco15630-05625 mM
Trypan blauwe kleurstof (0,4%)Life Technologies15250-061Verdunning 1:10 
Anti-muis CD16/CD32 (2.4G2 kloon)BD Biosciences55314210 µg/ml eind (1:50)
DAPI FluoroPureTM graadLife TechnologiesD214901 µg/ml eind
Anti-muis CD45 (30-F11 kloon)BD Biosciences559864 Verdunning 1:200
Anti-muis CD11b (M1/70 kloon)BD Biosciences557657 Verdunning 1:400
Anti-muis CD8α (5H10 kloon)Life TechnologiesMCD0830 Verdunning 1:100
Vrouwelijke C57BL/6JRj muizen (7 weken oud) Janvier Laboratories--

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
  2. Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
  3. Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
  4. Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
  5. Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
  6. van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
  7. Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
  8. Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
  9. Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136(2014).
  10. Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
  11. Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
  12. Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
  13. Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
  14. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
  15. Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
  16. Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
  17. Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637(2015).
  18. da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
  19. Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
  20. Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536(2012).
  21. Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
  22. Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
  23. Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
  24. Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
  25. Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
  26. Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
  27. Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
  28. Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
  29. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040(2012).
  30. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lymfeklieren van de muizenhuidflowcytometrieanalyseprotocol voor injectie van sporozo tenmethode voor weefseldigestietechniek voor celdissociatieextractie van lymfeklierenverwerking van oorweefselenumeratie van immuuncellenPlasmodium sporozo tenmodel

Gerelateerde artikelen