Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Cultiveren primaire nasale epitheelcellen van Kinderen en Programmeer in geïnduceerde pluripotente stamcellen

11K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53814

⸱

10 maart 2016

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Deze publicatie toont methoden voor succesvol bemonsteren en kweken van nasale epitheliale mucosa van kinderen, en het herprogrammeren van deze cellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's).

Samenvatting

Nasale epitheelcellen (NECs) zijn het deel van de luchtwegen dat reageert op luchtverontreinigingen en zijn de eerste cellen die worden geïnfecteerd door respiratoire virussen. Ze zijn ook betrokken bij veel luchtwegaandoeningen door hun aangeboren immuunrespons en interactie met immuun- en luchtwegstromacellen. NECs zijn van bijzonder belang voor studies bij kinderen vanwege hun toegankelijkheid tijdens klinische bezoeken. Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn gegenereerd uit meerdere celtypen en zijn een krachtig hulpmiddel voor het modelleren van menselijke ontwikkeling en ziekte, evenals voor hun potentiële toepassingen in regeneratieve geneeskunde. Dit is het eerste protocol dat methoden beschrijft voor het succesvol genereren van iPSCs uit NECs die zijn afgeleid van pediatrische deelnemers voor onderzoeksdoeleinden. Het beschrijft hoe nasale epitheelcellen bij kinderen kunnen worden verkregen, hoe primaire NEC-culturen uit deze monsters kunnen worden gegenereerd en hoe primaire NECs kunnen worden herprogrammeerd tot goed gekarakteriseerde iPSCs. Nasale mucosa-monsters zijn nuttig in epidemiologische studies met betrekking tot de effecten van luchtvervuiling bij kinderen en bieden een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van luchtwegaandoeningen. Primaire nasale cellen en iPSCs die daaruit zijn afgeleid, kunnen een hulpmiddel zijn voor het leveren van onbeperkt materiaal voor patiëntspecifiek onderzoek op diverse gebieden van de luchtweg-epitheelbiologie, inclusief astma- en COPD-onderzoek.

Inleiding

Geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke monsters (hiPSCs) zijn een snel ontwikkelende technologie van stamcelonderzoek. Ze bieden een alternatief voor embryonale stamcellen (hESC) onderzoek met veel minder ethische en morele bezwaren 1,2. Hoewel ze niet epigenetisch identiek hESCs 3-5, hiPSCs bieden een unieke manier om ontwikkeling en ziekte fenotypes modelleren, en ze kunnen worden afgeleid van weefsels naar de ziektetoestand 5-8 relevant. Nieuwe methoden voor het genereren hiPSCs worden voortdurend onderzocht om optimale celtypen te beginnen identificeren als een manier om GMP-kwaliteit iPSCs geschikt voor transplantatie te bereiden, en om de tijdigheid en efficiëntie van de herprogrammeringsproces 6,9-11 verhogen.

Epitheelcellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van allergische ontsteking 12 en het epitheel is een belangrijke oorzaak van allergische reacties en luchtwegremodellering door interactie met immune en stromale cellen. Het luchtwegepitheel speelt een essentiële rol bij het ontstaan ​​en voortduren van longziekten zoals astma. De geringere epitheelcellen moeilijk te verkrijgen in een klinische omgeving, vooral van gezonde controle patiënten en kinderen. Gegevens uit verschillende studies ondersteunen de vooronderstelling dat epitheliale cellen van het neusslijmvlies zijn van een geldig en praktische proxy voor de lagere luchtwegen epitheelcellen 13-20, in het bijzonder bij het ​​bestuderen van de reacties op luchtverontreinigende stoffen en allergenen. Het neusslijmvlies bestaat uit meer dan 90% haartjes bedekte epitheelcellen en bemonstering deze nasale epitheelcellen (NEM) kan gemakkelijk worden uitgevoerd bij kinderen vanaf de leeftijd van vier of vijf, omdat die minder invasief dan andere cellen / weefsels bemonsteringstechnieken en geassocieerd met een minimale kans op bijwerkingen zoals een infectie 20-23. Het biedt een snelle en eenvoudige manier om zowel gezonde als zieke kinderen zonder lange, onnodige en vaak pijnlijke bronchoscopie procedu proevenres die sedatie noodzakelijk. Eerdere studies hebben aangetoond dat ziekte subtypes in verband met de ernst van astma kan worden onderscheiden in zowel de nasale mucosa en bronchiale cellen monsters van astmatische kinderen en genexpressie tussen de twee weefseltypen was vergelijkbaar in ongeveer 90% van de niet-ubiquitous genen 22 , 24. Als bron voor iPSCs, NEC's bieden voordelen ten opzichte van andere vaak gebruikt celtypen. Fibroblasten worden vaak gebruikt voor iPSC generatie, maar hoewel deze cellen gemakkelijk gekweekt uit een huidbiopsie kan dit proces vereist gewoonlijk plaatselijke verdoving, een incisie, en hechtdraden, en is geassocieerd met een risico op infectie. Derhalve verkrijgen geïnformeerde toestemming van patiënten voor dit type biopsie kan lastig 25 worden. Een alternatief voor fibroblasten perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Het kan echter moeilijk zijn om voldoende bloed iPSC generatie verkrijgen bij pediatrische patiënten. Daarnaast zijn er beperkingen van stroomafwaartse appassingen voor fibroblast en bloed cel afkomstige iPSCs, met name hun differentiatie capaciteit om bepaalde celtypen 5,26. Daarom, gezien de relatieve bereikbaarheid en de lage risico op bijwerkingen na hun collectie, NEC's vormen een ideale mobiele bron voor iPSC generatie van pediatrische populaties.

iPSCs hebben veel aandacht kreeg onlangs als een platform voor de studie van de menselijke ontwikkeling, het genereren van nieuwe ziekte-modellen, en als een potentiële bron van cellen voor gepersonaliseerde behandelingen. Voordat u het volledige potentieel van deze technologie kan worden gerealiseerd, de moleculaire onderbouwing van de herprogrammering proces moeten worden opgehelderd, maar voor nu dit protocol en de binnen geschetste procedures zullen de onderzoeken gericht op risico's van de luchtwegen toe te lichten, evenals een platform voor het bestuderen van de effecten van de gepersonaliseerde geneeskunde waarbij iPSCs.

De gezamelijke werk van verschillende labs heeft geleid tot de generation een succesvolle techniek voor niet uitsluitend bemonsteringen het neusslijmvlies, maar ook kweken NEM en herprogrammering van deze cellen iPSCs 23. Dit artikel geeft een overzicht van een protocol voor een optimale bemonstering, kweken en herprogrammering omstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het volgende protocol volgt de richtlijnen van de instellingen menselijk onderzoek ethische commissie.

1. Sampling het neusslijmvlies

OPMERKING: Zorg monsters van patiënten die vrij zijn van symptomen van de luchtwegen virale infectie.

  1. Bereid een 15 ml conische verse voordat de deelnemer bezoek en voeg 2 ml BEGM (bronchiale epitheelcellen Growth Medium) plus 20 ul steriel Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
  2. Open cytologie borstel net voor het nemen van het monster, en zorg ervoor dat borstel steriel te houden en het niet aanraken om elk oppervlak naast de nasale oppervlakken.
  3. Vraag deelnemer om stil te zitten en tilt hoofd omhoog naar het plafond. Hebben kleinere of meer onrustige kinderen zitten op hun handen en / of liggen om te voorkomen swatting borstel weg.
  4. Richt borstel aan de achterkant van de neus, waar de doorgang vernauwt (Ziet eruit als een klein zwart gat). Schuif borstel naar beneden en draai de polsen als de borstel nostri wordt verwijderdl.
  5. Plaats de borstel in conische en dompel in BEGM. Snijd overtollig borstel en dop te vervangen op de buis. NIET VORTEX.
    LET OP: Als de deelnemer bereid is, het verkrijgen van een tweede borstel op dezelfde manier, maar in de tweede neusgat. Het verkrijgen van een poetsen van beide neusgaten leidt tot een grotere kans dat de bemonstering succesvol zal zijn. Bemonstering van hetzelfde neusgat kan leiden tot bloeden en zal waarschijnlijk niet verbeteren van het monster.
  6. Houd monsters zo dicht mogelijk bij 37 ° C mogelijk tijdens transport met een bekerglas met warm water.

2. celgetal en Cytospin

  1. Schud voorzichtig de borstel in BEGM en neem 10 ul van het monster voor een telling cel met behulp van een hemacytometer. Voeg 10 ul van een levende / dode vlek tellen alleen levende cellen onder een microscoop.
  2. Neem 50 pi van het monster en verdun tot 200 gl met 1x PBS. Naar cytospin trechter bevestigd aan glasplaatje en centrifugeren bij 300 rpm gedurende 2 min. Laat schuif droge O / N en vlek dia followininstructies g fabrikant. Laat O / N drogen, bij voorkeur in het donker.
  3. Vlek Slide met Hema 3 Stain
    1. Transfer elke oplossing (Hema fixatief, lichtblauw, Hema 3 Solution I, roze en Hema 3 Solution II, diep blauw) in een kleuring schotel; Houd bedekt wanneer niet in gebruik. Plaats dia's in slide kleuring boot
    2. Dip dia's voortdurend in fixatief gedurende 30 seconden, dan laat overtollige uitlekken. Dip dia's continu in oplossing I gedurende 30 seconden, dan laat overtollige uitlekken. Dip dia's continu in oplossing II voor 30 sec, dan laat overtollige uitlekken
    3. Spoelen met gedemineraliseerd water tot het water helder is. Laten drogen O / N bij voorkeur in het donker
  4. Kijk naar dia onder de microscoop en tellen cellen te bepalen percentage van de epitheelcellen. Zou moeten zijn 90% of meer indien de monsterneming is goed.

3. Seeding Cellen

OPMERKING: Voer alle celcultuur procedures op de juiste en gecertificeerde weefselkweekkap met behulp van steriele techniek.

  1. Coat platen met Bovine Collagen Dermaal (BDC), het type 1. Voeg 0,5 ml van 3 mg / ml BDC verdund in 49,5 ml 1x PBS. Bereid minder als slechts een enkele plaat worden gebruikt. Coat een T25 kolf met 2 ml BDC en incubeer in steriele kap O / N of bij 37 ° C gedurende 2 uur, indien nodig.
  2. Na incubatie zuig resterende vloeistof. Expose kolven aan UV-licht voor 30min in steriele kap. Store kolven voor maximaal een maand bij 4 ° C, maar breng ze naar kamertemperatuur of 37 ° C voor het zaaien cellen.
  3. Houd borstel en cellen in BEGM bij 37 ° C tot klaar aan zaad. Voorzichtig swish borstel binnen conisch, maar niet vortex.
    1. Plaat 7 x 10 5 cellen in een T25 fles. Als er minder, een kleinere houder, zoals een putje van een 6-wells plaat. Deze omvang plaat vereist ongeveer 3 x 10 5 cellen.
      LET OP: Als er niet zoveel cellen, is het niet raadzaam om verder te gaan.
  4. Onder een steriele kap, neem borstel uit de buis en gently roteren borstel op het oppervlak van de gecoate fles, zorg dat u de coating niet bekrast. Gooi penseel in een geschikte biohazard container.
  5. Langzaam pipet de resterende cellen in BEGM uit de conische en in de T25 fles. Houd u aan de cellen onder de microscoop. Een aantal drijvende cellen worden waargenomen en kan er enige vuil van de neus, die in dit stadium (figuur 3A) aanvaardbaar zijn.

4. Cell Culture

  1. Na het zaaien cellen, laat ze genoegen nemen met 48 uur zonder onderbreking (figuur 3). Na 48 uur, langzaam en voorzichtig voeg 2 ml warm BEGM en 20 ul steriel penicilline / streptomycine / Fungizone (P / S / F).
    LET OP: NIET zuig het oorspronkelijke 2 ml media.
  2. Op de 4de dag na het uitzaaien, zuig zorgvuldig alle vloeibare en vervangen door 4 ml vers verwarmd BEGM plus 1x Pen / Strep (fungizone niet meer nodig). Wijzig de media om de twee dagen en cellen hechten beoordelenment, groei en samenvloeiing. Wanneer cellen te bereiken ~ 80% confluentie, meestal in 2-3 weken, zijn ze klaar om te worden gepasseerd.
  3. Een T25 fles (ongeveer 2,5 x 10 6 cellen wanneer confluent) kan worden gepasseerd in drie T25 flessen of een T75 kolf. Na de eerste passage, moeten de cellen robuust en gezond, tot confluentie ongeveer drie dagen.

5. Passage Cells

  1. Zuig het materiaal uit de plaat. Voeg 1 ml 0,05% trypsine oplossing per T25 fles aan de plaat en plaats in de incubator gedurende 4 min of totdat cellen los van de plaat. Controleer het niveau van onthechting van de cellen om de 2 min en niet verlaten trypsine op meer dan 10 min.
  2. Voeg 5 ml trypsine neutraliserende oplossing (TNS) of serum-bevattende media om het enzym te neutraliseren. Verwijder alle vloeistof en cellen uit de kolf en plaats in een 15 ml conische buis.
  3. Centrifugeer bij 200 xg (versnelling 0 deceleratie 0) gedurende 5 min een celpellet te verkrijgen. aspireren Supernatant en resuspendeer cellen in BEGM + P / S in het gebruikte volume van de nieuwe flessen (4 ml voor een T25 kolf 10 ml van een T75 kolf)
  4. Voer celgetal met een live / dode vlek zoals hierboven (2.1) beschreven. Voeg juiste hoeveelheid BEGM en cellen voor de beklede kolven en terug naar de incubator. Handhaaf gedetailleerde boven of worden ingevroren in invriesmedium (70% BEGM, 20% FBS en 10% DMSO) bij een concentratie van 0,5-2 x 10 6 cellen per ml.

6. herprogrammeren om iPSCs

LET OP: Voor het genereren van iPSCs, zorgen voor naleving van alle institutionele regels voor de productie en het gebruik van menselijke iPSCs. Steriele techniek is vooral belangrijk voor iPSC culturen, als kweekmedium antibiotica niet routinematig bevat. Het is cruciaal dat NEC's gezond lijken en zijn robuust proliferatieve voor een succesvolle herprogrammering.

  1. Plate 5 x 10 5 NEC's per putje van een 6-well weefselkweek plaat. Na 24 uur, voeg polybreenBEGM om tot een eindconcentratie van 8 ug / ml en transduceren NEM door toevoeging lentivirale deeltjes expressie Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc aan de media. Streven naar een veelvoud van infectie (MOI) te realiseren van 5 ~ 27.
    1. Om het bepalen van de MOI, voor te bereiden seriële verdunningen van de geconcentreerde-lentivirale voorraad en transduceren HT1080 cellen met deze verdunningen. Na eerste ondubbelzinnige detectie van dTomato expressie in HT1080 cellen, bereken het aantal "transducerende eenheden / ml" door het scoren van het aantal dTomato-positieve cellen / kleine klompjes cellen bij elke verdunning.
      LET OP: Typisch, zal er verdunningen die te hoog zijn (alles is dTomato positief) en te laag is (geen of slechts een paar positieve cellen).
    2. Voer scoren uit de verdunningen waarin discrete positieve cellen / kleine klompjes cellen geïdentificeerd. Bepaal de titer door het corrigeren van het aantal transducerende eenheden / ml met de juiste verdunningsfactor. MOI is dan de verhouding van het aantalgetransduceerde cellen om het aantal virusdeeltjes 27.
      OPMERKING: Elke dTomato positieve cel / klein groepje wordt verondersteld afkomstig te zijn uit een enkel virusdeeltje.
  2. Ongeveer 3 uur na transductie, verwijder de media en te vervangen door frisse BEGM. Gooi lentivirus-bevattende media met behulp van institutioneel-goedgekeurde procedures. Terugkeren getransduceerd NEC de incubator gedurende 3 dagen.
  3. Op dag 3, vervangen met verse media BEGM, en incubeer gedurende nog 3 dagen. Zuig doorgebracht media, cellen te wassen met 1x PBS en voeg 1 ml 0,05% trypsine-oplossing naar de bron. Passage cellen met trypsine zoals hierboven (hoofdstuk 5) geschreven. aspireren supernatant en resuspendeer cellen voorzichtig in 4 ml BEGM + P / S. Cellen kunnen worden gepasseerd om een ​​nieuwe put van een 6 wells plaat bekleed met BDC, of ​​toegevoegd aan MEF culturen, als klaar (zie volgende stap).
  4. Bereid MEF beklede platen. Op dag 4 voeg 0,1% gelatine-oplossing (1 ml / putje) tot 2 putjes van een 6 putjes (+/- uitvoeren Thiazovivin (SPT) zie stap 6,6). Op de volgendedag ontdooien een flacon geïnactiveerd MEFs 28.
  5. Plaats MEF in 10 ml van MEF media (DMEM + 1x NEAA + 10% DFC's). Spin bij 200 xg gedurende 5 minuten tot pellet. Resuspendeer in MEF media. Aspireren gelatine van 6 well plaat en voeg 1,87 x 10 5 MEF per putje van de gelatine-gecoate plaat met 6 putjes. Incubeer O / N bij 37 ° C, of ​​gedurende ten minste 24 uur.
  6. Overdracht 2 ml BEGM bevattende getransduceerde cellen per putje in 2 putjes van een eerder beklede plaat met 6 putjes en incubeer O / N. Op de volgende dag vervangen BEGM met 2,5 ml per putje van standaard hESC media met 4 ng / ml basische fibroblast groeifactor. Voeden cellen met verse hESC media +/- SPT daags gedurende 10 dagen
    LET OP: Het is mogelijk om een cocktail van kleine moleculen (SB431542, PD0325901 en Thiazovivin (SPT) cocktail) toe te voegen aan de efficiëntie en de kinetiek van herprogrammering voor NECs 23 te verbeteren.
  7. Na tien dagen blijven dagelijks voeden met behulp van hESC media zonder SPT. Feed culturen dagelijks tot hESC-achtige koloniesverschijnen (Figuur 5A, P0 kolonie). Identificeer kolonies herbergen vermeende iPSCs door hun hoge kern: cytoplasma-verhouding en prominente nucleoli.
  8. Handmatig accijnzen en overdracht kolonies met hESC-achtige morfologie te putten scheiden voor cultuur en uitbreiding als afzonderlijke lijnen in een feeder-free-systeem. Weggesneden kolonies moet snel aan te passen aan deze voorwaarden.
    1. Na plating weggesneden kolonies deze discrete vermeende iPSC lijnen nu worden beschouwd passage 1 (P1). Feed culturen per dag met mTeSR1. Passage en uit te breiden iPSC lijnen met behulp van standaard procedures. Het kan enkele dagen duren om een ​​week voor p1 kolonies op de grootte waarop ze moeten worden gepasseerd bereiken.

7. Handhaving iPSCs in Cultuur

  1. Voeden en culturen dagelijks te evalueren. Handmatig accijnzen gebieden tentoonstellen openlijke differentiatie door schrapen met een steriele glazen pipet of micro pipet tip. Verander media na dag plukken.
  2. Passage cellen na approximadellijk elke vier dagen: voorzichtig aspiraat media, voeg 1 ml warm Dispase (1 mg / ml) per putje van een 6-well plaat (half feeding volume), vervolgens incuberen bij 37 ° C gedurende ongeveer 4 minuten. De randen van de kolonies zal beginnen op te heffen, die eruit ziet als een wit overzicht rond de kolonie. Zuig voorzichtig het Dispase en was 3x met verwarmde DMEM / F12.
  3. Voeg 2 ml mTeSR1 en het gebruik van een cel lifter naar de koloniën te tillen van de plaat. Gebruik een 5 ml serologische pipet of P1000 micropipet om voorzichtig vermaal de cellen tot de kolonies worden opgesplitst in kleinere clusters.
    1. Voorkomen die zeer kleine clusters of enkelvoudige cellen, zoals overleving en daaropvolgende proliferatie suboptimaal zijn. Bij het opnieuw uitplaten kolonies, een 1: 4 tot 1: 6 wordt gespleten optimale kolonie dichtheid handhaven. Voorzichtig koloniën en media te verwijderen uit de plaat en toe te voegen aan nieuwe, Matrigel beklede putjes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het eerste gedeelte van de neus, genaamd de nasale vestibule, is het gebied omringd door kraakbeen 29. De borstel moet soepel voorbij het ​​gebied van de neus, buiten de nasale klep (ostium internum, of de "zwarte gat" gezien op de achterkant van de nare), en het monster wordt verkregen van de inferieure turbinate (figuur 1). De nasale turbinates zijn benige structuren die het oppervlak van de neus 29 te verhogen, waardoor ze een ideale lo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Nasale epitheelcellen (NEC) zijn een toegankelijk platform voor het bestuderen van luchtwegaandoeningen en NEC-iPSCs bieden een spannende laan aan de ziekte ontwikkeling, de behandeling en therapie 1,31,32 verkennen. NEC's kunnen gemakkelijk worden verkregen zonder stress of potentieel schadelijke procedures 6,23. In onze ervaring, wordt de bemonstering van het neusslijmvlies zoals beschreven in dit protocol minder stressvol en beter ervaren dan bloedafname voor de kinderen te zijn. Daarom is d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag de pluripotente Stem Cell Facility en de confocale Imaging Core op Cincinnati Children's Hospital te erkennen. Dit werk werd ondersteund door R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) en 2U19AI70235 (GKKH).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 ml conischeFisher Scientific14-959-49DProtocol Step 1.1.
BEGMLonzaCC-3170Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/FungicideLife Technologies15240-062Protocol Step 1.1.
Penn/StrepLife Technologies15140-122Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology borstelFisher Scientific22-263-357Protocol Step 1.2.
trypan blauwFisher ScientificMT-25-900-CIProtocol Step 2.1.
hemacytometerFisher Scientific02-671-54Protocol Step 2.1.
PBSFisher ScientificBP2438-4Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel ClipsFisher Scientific10-357Protocol Step 2.2.
cytospin trechterFisher Scientific23-640-320Protocol Step 2.2.
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003Protocol Step 2.2.
lege glijFisher ScientificS95933Protocol Step 2.2.
hema 3 kleurkitFisher Scientific22-122-911Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1Life TechnologiesA1064401Protocol Step 3.2.
T25 flesFisher Scientific08-772-45Protocol Step 3.3.
TrypsineLonzaCC-5012Protocol Step 5.2.
Trypsine Neutralizing SolutionLonzaCC-5002Protocol Step 5.2.
Fetaal bovien serum (FBS), verwarmd op 65 °C gedurende 30 minSigma-AldrichF2442Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor hybridoma, ≥99.7%Sigma-AldrichD2650Protocol Step 5.5.
polycistotisch lentivirus*bijv. MilliporeSCR511Protocol Step 6.4. 
Een commerciële bron van herprogrammeringsvector wordt vermeld. We gebruiken routinematig het 4-in-1 plasmide gerapporteerd door Voelkel et al (PMID: 20385817) om VSV-G-pseudotyped polycistotisch herprogrammeringslentivirus in-house te genereren. Dit plasmide kan worden verkregen door contact op te nemen 
polybreenSanta Cruz Biotechnologysc-134220Protocol Step 6.4.
Bestraalde CF1 MEFsGlobalStem GSC-6301GProtocol Step 6.4.
hESC mediaZie recept in het protocolProtocol Step 6.11.
SB431542Stemgent04-0010Protocol Step 6.11.
PD0325901Stemgent04-0006Protocol Step 6.11.
Thiazovivin Stemgent04-0017Protocol Step 6.11.
hESC-gekwalificeerde MatrigelBD Biosciences354277Protocol Step 6.13.
Corning plaat, 6 putjesFisher Scientific08-772-1BProtocol Step 6.13.
mTeSR1StemCell5850Protocol Step 6.13.
250 ml wegwerp filterfles (0.22 µm)FisherSCGP-U02-RE 
dispaseStemCell7923Protocol Step 7.3.
DMEM/F12Life Technologies11320-033Protocol Step 7.3.
cell lifterFisher Scientific08-100-240Protocol Step 7.4.
hESC Media**Protocol Step 6.11.
componenten moeten worden gemengd en vervolgens filter gesteriliseerd. Media kan maximaal twee weken op 4 °C worden bewaard. Bij het opwarmen van media, niet langer dan 15 min op 37 °C laten staan
DMEM-F12 50/50 mediaInvitrogen 11330-032Finale Concentratie
KO vervangende serum (KO-SR)Invitrogen10828-0280.2
200 mM L-glutamineInvitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-mercaptoethanolInvitrogen21985-0230.1 mM
100x niet-essentiële aminozurenInvitrogen11140-0501x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)Invitrogen13256-0294 ng/ml

Referenties

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076(2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Primaire celkweeklentivirale transductieherprogrammeringsprotocolpediatrische bemonstering van de luchtwegenhESC mediumMEF coatingkolonie expansiefeeder vrij systeem
Cultiveren primaire nasale epitheelcellen van Kinderen en Programmeer in geïnduceerde pluripotente stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.