Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Summary

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Abstract

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K⁺ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Introduction

Vergeleken met conventionele elektrische stimulatie, fotostimulering biedt meer temporele en ruimtelijke resolutie met een minimum aan interferentie met de fysiologische systeem van specimens. Sinds de demonstratie van het gebruik van lasers om neuronen te stimuleren in 1971 ^1, zijn veel creatieve manieren bedacht om exogeen controle neuronale activiteit met licht. Optische afgifte van photocaged agonisten is lange tijd gebruikt om fysiologische respons van het neuronale netwerk liganden ^2,3,4 bestuderen. Deze techniek heeft een beperkte specificiteit door diffusie van gekooide agonisten. Genetische specificiteit wordt bereikt door ectopisch tot....

Protocol

Alle procedures in de huidige studie werd uitgevoerd met behulp van Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurde protocollen voor de behandeling van dieren bij het Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA.

1. UAA Integratie in kir2.1 en expressie van de resulterende Pirk in het primaire neuronale Cultuur

1. DNA Construction
   1. Selecteer een target site van kir2.1 voor UAA oprichting. Exploiteren voorkennis en gegevens over de structuur en functie van kir2.1, zodat de gekozen locatie met licht aansprekend UAA maakt Incorporated optische modulatie van kir2.1 functie ^21.
   2. Const....

Results

Om een ​​UAA genetisch te nemen in een eiwit in neuronen, de eerste belangrijke stap is om het ontwerpen van de juiste gen constructen te leveren en efficiënt genen tot expressie in neuronen. Er zijn drie genetische componenten UAA inschrijving: (1) het doelgen de TAG amber stopcodon geïntroduceerd op de gekozen locatie voor UAA opname (2) een orthogonaal tRNA om de gemuteerde TAG stopcodon herkent en (3) een orthogonale aminoacyl -tRNA synthetase de UAA rekenen op de orthogonale tRNA. E.......

Discussion

Om effectief foto-modulatie te bereiken, de belangrijke eerste stap is om te beslissen waar het licht aansprekend UAA te nemen in het doelwit eiwit. Structurele en functionele informatie van het doeleiwit is zeer nuttig om de selectie van kandidaatsites leiden. Tegelijkertijd zou het doel van lichtregeling bepalen welke site het meest geschikt. Na het kiezen van de kandidaat-sites, raden wij aan om de sites in zoogdiercellijnen zoals de humane embryonale nier (HEK) cellen voor gemakkelijker cultuur en manipulatie, te te.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm	Carolina Biologicals	633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine	Corning Discovery Labware	354210
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769
Iris Spatula-curved	Fine Science Tool	10092-12
Dissecting Knife - Fine Angled Tip	Fine Science Tool	10056-12
GlutaMAX-I Supplement	Life Technologies	35050-061
MITO+ Serum Extender	BD Biosciences	355006
Falcon 40 µm Cell Strainer	Corning Life Sciences	352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)	Sigma-Aldrich	B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385	Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade	Promega	V2111