Methodenartikel

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

DOI:

10.3791/53818

⸱

28 maart 2016

 ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een procedure gepresenteerd om selectief een neuronaal eiwit te activeren met een korte lichtpuls door genetisch een foto-reactieve onnatuurlijke aminozuur te coderen in een doelneuronaal eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen in cultuur of in vivo.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotostimulatie is een niet-invasieve manier om biologische gebeurtenissen te controleren met uitstekende ruimtelijke en temporele resolutie. Er zijn nieuwe methoden gewenst om endogene eiwitten te foto-regelen die in hun natuurlijke omgeving worden geëxpresseerd. Hier presenteren we een benadering om de functie van een neuronaal eiwit direct in neuronen optisch te controleren met behulp van een genetisch gecodeerde onnatuurlijke aminozuur (Uaa). Door een orthogonaal tRNA/aminoacyl-tRNA-synthetase-paar te gebruiken om het ambercodon te onderdrukken, wordt een foto-reactieve Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteïne (Cmn) op locatie specifiek ingebouwd in de poriën van een neuronaal eiwit Kir2.1, een naar binnen rechttrekkende kaliumkanaal. Het omvangrijke Cmn blokkeert fysiek de kanaalporiën, waardoor Kir2.1 niet geleidend wordt. Lichtbelichting converteert Cmn onmiddellijk in een kleiner natuurlijk aminozuur Cys, waardoor de Kir2.1-kanaalfunctie wordt geactiveerd. We brengen deze photo-induceerbare inwaarts richtende kalium (PIRK)-kanalen tot expressie in primaire neuronen van de hippocampus van ratten en tonen aan dat lichtactivering van PIRK de neuronale activatie stopt vanwege de uitstroom van K+-stroom door de geactiveerde Kir2.1-kanalen. Met behulp van in utero elektroporatie brengen we PIRK ook in vivo tot expressie in de embryonale muisneocortex, waarbij de lichtactivering van PIRK in neocorticale neuronen wordt getoond. Genetisch coderen van Uaa legt geen beperkingen op aan het type doeleiwit of de cellulaire locatie, en er is een familie van fotoreactieve Uaas beschikbaar voor het moduleren van verschillende natuurlijke aminozuurresten. Deze techniek heeft dus het potentieel om algemeen toegepast te worden op veel neuronaal eiwitten om optische regulatie van verschillende processen in de hersenen te bereiken. Het huidige protocol presenteert een toegankelijke procedure voor ingewikkelde Uaa-incorporatie in neuronen in vitro en in vivo om fotocontrole van neuronale eiwitactiviteit op moleculair niveau te bereiken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vergeleken met conventionele elektrische stimulatie, fotostimulering biedt meer temporele en ruimtelijke resolutie met een minimum aan interferentie met de fysiologische systeem van specimens. Sinds de demonstratie van het gebruik van lasers om neuronen te stimuleren in 1971 1, zijn veel creatieve manieren bedacht om exogeen controle neuronale activiteit met licht. Optische afgifte van photocaged agonisten is lange tijd gebruikt om fysiologische respons van het neuronale netwerk liganden 2,3,4 bestuderen. Deze techniek heeft een beperkte specificiteit door diffusie van gekooide agonisten. Genetische specificiteit wordt bereikt door ectopisch tot expressie lichtgevoelige opsin kanalen en pompen 5,6,7, en is met succes toegepast op geselecteerde neuronale netwerken in verschillende modelorganismen moduleren. Toch zou het moeilijk zijn om deze methode toe te passen optisch controleren van bepaalde neuronale eiwitten, aangezien enten photoresponsiveness van opsin eiwitten aan andere eiwitten would intense techniek die de natuurlijke eigenschappen van het eiwit kunnen veranderen bestudeerd vereisen. Chemisch tethering een exogene fotogevoelige ligand een eiwit is een andere manier om de functionaliteit van kanaalproteïnen 8,9,10 controle aangetoond. Het ligand wordt gepresenteerd of de bindingsplaats van het eiwit onttrokken door de foto-isomerisatie van het azobenzeen groep. Tethering chemie beperkt de toepassing voornamelijk aan de extracellulaire zijde van membraaneiwitten, exclusief de intracellulaire kant en intracellulaire eiwitten.

Licht aansprekend Uaas, na te zijn opgenomen in eiwitten, zorgen voor een algemene strategie om eiwitten te manipuleren met licht. In het begin van de inspanningen, tRNA chemisch geacyleerd met photocaged Uaas werden micro-injectie in Xenopus oöcyten om de Uaas nemen in membraan receptoren en ion kanalen 11, die aan het inzicht in de structuur-functie relaties 12,13,14.Deze micro-injectie aanpak is vooral beperkt tot grote eicellen. Genetische incorporatie van een UAA omzeilt de technisch uitdagende tRNA acylering en micro-injectie met behulp van een orthogonaal tRNA / synthetase paar, waarin de UAA verwerkt door middel van endogene eiwit vertaling in levende cellen 15,16,17,18. UAA incorporatie in neuronale eiwitten is aangetoond in primaire neuronen en neurale stamcellen 19,20. Recenter licht aansprekend UAA genetisch is opgenomen in een neuronaal eiwit in de hersenen van zoogdieren in vivo voor het eerst 21. Deze ontwikkelingen maken het mogelijk om neuronale eiwitten met Uaas bestuderen in hun natieve cellulaire omgeving.

Binnenwaarts rectificatie kaliumkanaal kir2.1 is een sterke gelijkrichter die K + stromen gemakkelijker overgaat in dan uit de cel, en het is essentieel bij het ​​reguleren van fysiologische processen zoals mobiele exciteerbaarheid, vaattonus, hartslag, renal zout stroom en insuline vrij te geven 22. Overexpressie van kir2.1 hyperpolariseert de membraanpotentiaal van de doelwit neuron, minder prikkelbaar 23,24 wordt. Optisch kir2.1 beheersen zijn natieve cellen, Kang et al. Genetisch opgenomen een fotogevoelig UAA in kir2.1 expressie in zoogdierlijke cellen, neuronen en embryonale muizenhersenen 21. Een korte lichtpuls kon de UAA zetten in een natuurlijk aminozuur Cys, waardoor het activeren van het doelwit eiwit kir2.1. Toen deze foto-induceerbare innerlijk rectificeren kalium (Pirk) kanaal eiwit werd uitgedrukt in de rat hippocampus primaire neuronen, is onderdrukt neuronale afvuren in reactie op licht activering. Bovendien werd de Pirk kanaal tot expressie gebracht in embryonale muis neocortex, en het licht-geactiveerde Pirk stroom in corticale neuronen werd gemeten. De succesvolle implementatie van de OCG technologie in vivo in de hersenen van zoogdieren opent de deur naar optisch controle neuronale eiwittenin hun natieve omgeving, waardoor optische dissectie van neuronale processen en mechanismen op moleculair niveau mogelijk te maken.

In dit protocol beschrijven we de procedures voor genetische incorporatie van Uaas in primaire neuronen in cultuur en in de embryonale muizenhersenen in vivo. Het licht aansprekend UAA Cmn en kir2.1 worden gebruikt om het proces te illustreren. Methoden om succesvolle UAA integratie en optische controle van neuronale eiwit activiteit zijn voorzien te beoordelen. Dit protocol geeft een duidelijke leidraad genetisch coderen Uaas in neuronen en in vivo, en optisch reguleren neuronale eiwitfunctie via een op licht aansprekend UAA. We verwachten dat dit protocol bij de vaststelling van de in vivo OCG-technologie voor neurowetenschappen en optogenetic biologische studies vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures in de huidige studie werd uitgevoerd met behulp van Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurde protocollen voor de behandeling van dieren bij het Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA.

1. UAA Integratie in kir2.1 en expressie van de resulterende Pirk in het primaire neuronale Cultuur

  1. DNA Construction
    1. Selecteer een target site van kir2.1 voor UAA oprichting. Exploiteren voorkennis en gegevens over de structuur en functie van kir2.1, zodat de gekozen locatie met licht aansprekend UAA maakt Incorporated optische modulatie van kir2.1 functie 21.
    2. Construeren van een recombinant DNA dat codeert kir2.1 gen de gekozen locatie gemuteerd TAG amber stopcodon. Gebruik het standaard kloneringstechnieken 25 de kir2.1 TAG-DNA te kloneren in een zoogdierlijk expressieplasmide.
    3. Clone tRNA / synthetase genen die specifiek zijn voor de UAA zijn en nemen de UAA in reactie ophet TAG stopcodon in andere zoogdierlijke expressieplasmide 21.
      Opmerking: Voor een optimale UAA opname kunnen verschillende promoters en combinaties van gen cassettes (voor tRNA synthetase, en kir2.1) worden getest in verschillende plasmiden.
    4. Het verkrijgen van hoge kwaliteit plasmide DNA's met behulp van miniprep of Maxiprep commerciële kits volgens het protocol van de fabrikant. Ongeveer 1,9 van de 260/280-verhouding optimaal is voor het gezuiverde DNA. Indien nodig, voer een agarosegelelektroforese zuiverheid van het geprepareerde DNA 25 controleren. Gedraaide dubbele helix plasmide DNA's met een hoge zuiverheid zijn het beste voor neuronale transfectie.
  2. Cultuur Rat hippocampus primaire neuronen
    1. Plaats dekglaasjes (cirkels, 12 mm in diameter) in 24-well platen, een dekglaasje aan elk putje en smeer elk putje met 250 pl 0,5 mg / ml poly-D-lysine (in 100 mM boraat buffer: 1,24 g boorzuur zuur en 1,90 g natriumtetraboraat in 400 ml gedeïoniseerd gedestilleerd H 2 O of DDH 2 O bij pH 8,5) meer dan 10 uur bij kamertemperatuur gesloten. Bereid rond 10-12 gecoate dekglaasjes per pup.
    2. Op de dag van dissectie, het verzamelen van neonatale hersenen van postnatale ratten (1-4 postnatale dag) na hen verlamming met isofluraan, en onthoofden. Verdoven de pups in een verdoving kamer met isofluraan (2-4%). Wachten tot ze het bewustzijn verliezen en niet reageren op tactiele stimuli en knijpen van de poten.
    3. Met de standaardtechniek 26, ontleden hippocampus van de hersenen in warm (~ 37 ° C) zoutoplossing (10 mM HEPES en 20 mM D-glucose toegevoegd in gebalanceerde zoutoplossing Hank's), en verzamel hippocampus in een conische buis met 4,5 ml warme zoutoplossing .
    4. Voeg 500 ul van 2,5% trypsine aan de hippocampus (0,25% trypsine uiteindelijke concentratie) en incubeer gedurende 10 min in een waterbad bij 37 ° C.
    5. Reinig het weefsel met een zoutoplossing (3 x 10 ml) en vermaal spoel.
    6. Recover de los neuronen in 1 ml warm groeimedia bevattende Minimum Essential Medium (MEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 21,2 mM D-glucose, 2 mM L-glutamine, 2% B-27, en 0,1% serum extender.
      Opmerking: Voeg L-glutamine en B-27 op de dag van dissectie verse groeimedia bereiden.
    7. Tel de neuronen met een hemocytometer en plaat ze op dekglaasjes in platen met 24 putjes bij 1,0-1,5 x 10 5 cellen / putje dichtheid met 500 ul groeimedium na gefiltreerd door een 40 pm nylon mesh.
    8. Incubeer de neuronale kweek bij 35 ° C in een 5% CO2: 95% lucht bevochtigde incubator gedurende 2-3 weken. Voor het beste resultaat, vermijd de cultuur zoveel mogelijk storen tijdens incubatie.
  3. Calciumfosfaat (Ca-P) Transfectie van primaire neuronale Cultuur
    1. Maak voorraadoplossingen en bewaar bij 4 ° C: 0,5 M BES (N, N-bis [2-hydroxyethyl] -2-aminoethaansulfonzuur) -buffer (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); steriele DDH 2 O; steriel 1 N NaOH.
    2. Op de dag van transfectie maken verse 2,5 M CaCl 2-oplossing in DDH 2 O en steriel filter met 0,22 urn filter. Maak verse 2x BES-gebufferde zoutoplossing (BBS) buffer die 50 mM BES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, en 280 mM NaCl bij pH 7,00 (aan te passen pH met NaOH) en steriel filter met 0,22 pm filter.
      Opmerking: Bereken de hoeveelheid CaCl 2-oplossing en BBS buffer afhankelijk van het aantal dekglaasjes te transfecteren. Kijk ook op 1.3.4.
    3. Vervang de cultuur groei media met 500 ul vers voorverwarmde transfectie groeimedia. (Transfectie media kunnen worden gemaakt met MEM plus 21,2 mM D-glucose).
      Opmerking: de oude media niet weg.
    4. Bereken de hoeveelheid DDH 2 O en bereid voegen teneinde de transfectie-oplossing (33 gl per elk dekglaasje) met 1,65 gl CaCl2, 0,7 ug DNA en 16,5 & maak# 181; l 2x BBS.
    5. Bereid de transfectie oplossing onmiddellijk alvorens het aan de kweek. Ter voorbereiding, voor het eerst te combineren CaCl2 en DDH 2 O, terwijl langzaam schudden van de buis. Verder roeren en voeg langzaam DNA in de oplossing. Ten slotte, voeg 2x BBS buffer druppelsgewijs onder roeren.
    6. Voeg onmiddellijk 30 ul van de transfectie oplossing in elk dekglaasje van neuronale kweek.
    7. Schommel de kweekschaal een paar keer om de oplossing te mengen en incuberen bij 35 ° C in een 5% CO2: 95% lucht bevochtigde incubator gedurende 45 minuten 1 uur. Na neuronen geïncubeerd met de transfectieoplossing, zou zeer fijne precipitaten Ca-P een laag te vormen die neuronen.
    8. Vervang de transfectie media met 500 ul voorverwarmde wasbuffer (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, 10 mM glucose bij pH 7,3, steriel gefiltreerd met 0,22 urn filter) en incubeer bij 356, C in een 5% CO2: 95% lucht bevochtigde incubator gedurende 15-20 min. Ca-P neerslagen zou verdwijnen na het wassen stap.
    9. Vervang de wasbuffer met 500 ul vers groeimedium. Nogmaals, vervang dan de groei van media met de opgeslagen originele media.
    10. Voeg de UAA Cmn (vooraf gemengd in 50 ul warm groei media) om de cultuur tot 1 mM uiteindelijke concentratie te bereiken.
    11. Incubeer de getransfecteerde kweek bij 35 ° C in een 5% CO2: 95% lucht bevochtigde incubator gedurende 12-48 uur voor assays.
  4. Hele Cell Opnemen met Light Activation
    1. Bereid extra / intracellulaire oplossingen. De intracellulaire oplossing bevat 135 mM kaliumgluconaat, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP en 0,3 mM GTP Li 2 bij pH 7,4. De extracellulaire oplossing bevat 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, 5 mM glucose en 10 mM HEPES bij pH 7,4.
    2. Stel de elektrofysiologie rig voor whole-cell patch klemmen: microscoop uitgerust met 4X en 20X doelstellingen, differentieel interferentie contrast (DIC), en mCitrine filter (excitatie: 495/10 nm, emissie: 525/25 nm); manipulator; patch-clamp versterker; digitizer; data-acquisitie en analyse software.
      1. Installeer een light-emitting diode (LED) met een emissie van 385 nm door de microscoop op het tuig aan het licht te leveren aan het brandpunt van 1 cm afstand in een hoek van 45 °. Controleer de kracht van de LED met een lichte power meter.
    3. Trek patch pipetten van glas elektrodes met behulp van een commercieel micropipet puller tot 3-6 MQ pipet weerstand. Volg de instructies van de fabrikant voor het opzetten van de micropipet trekker.
      1. Om pipet weerstand te testen, eerst de pipet met de intracellulaire oplossing vullen en plaats het op de elektrode houder. Dompel de pipet in een 35 mm kweekschaal gevuld met de extracellulaire oplossing, die op de microscoop platform. Dompel een aardelektrode in de schaal om een ​​circuit te sluiten.
      2. Zet de versterker / digitizer en start een data-acquisitie software. Monitor pipet weerstand met een membraan testprotocol.
    4. Neem een ​​dekglaasje van het neuron cultuur uit de incubator en een keer spoelen in de extracellulaire oplossing. Met behulp van vacuüm vet, houdt u de dekglaasje in het midden van een 35 mm cultuur schotel gevuld met de verse extracellulaire oplossing.
    5. Plaats het dekglaasje / schotel op de elektrofysiologie microscoop platform.
    6. Met behulp van de standaard patch klemmen technieken, patch een neuron met mCitrine fluorescentie 27. Record neuronale activiteit met stroomtang (I-clamp) methode. Ten eerste, pas dan de rustpotentiaal tot ongeveer -72 mV door het injecteren van een kleine stroom. Dan injecteren een stap stroom (10-200 Pa) om continu branden (15/05 Hz) van actiepotentialen te induceren.
    7. Handmatig of met behulp van de data-acquisitie software, knipperen een puls (a single puls van 100 msec -1 sec duur) van de LED-licht om de neuron tijdens de opname, en kijk of actiepotentialen worden beïnvloed.
    8. Voeg 0,5 mM BaCl2 aan het bad en controleer of actiepotentialen worden teruggewonnen.

2. UAA Opneming in kir2.1 en expressie van de resulterende Pirk in de muis embryonale Brain In Vivo

  1. DNA Construction
    1. Ontwerp het plasmide-DNA eveneens als in stap 1,1. Voor in vivo expressie, gebruik een sterke promotor zoals CAG (kippen beta-actine promoter van CMV enhancer).
    2. Zuiver DNA met een endotoxine-vrij maxiprep commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Uitvoeren fenol-chloroform extractie gevolgd door ethanol precipitatie 25 extreem hoge kwaliteit DNA (gecondenseerd tot 2,5 ug / ul) verwerven.
  2. In Utero Elektroporatie van de muis embryonale Neocortex
    Opmerking: De basis Technique in utero elektroporatie is eerder 28 beschreven.
    1. Verdoven een getimede zwangere muis op embryonale dag 14,5 (E14.5) met natrium pentobarbital (intraperitoneale injectie, 50 ug per gram lichaamsgewicht) of isofluraan (inhalatie, 2-4%). Monitor verdoving diepte door het controleren van het verlies van bewustzijn en geen reactie op tactiele stimuli en knijpen van de poten.
    2. Maak een kleine snede in de buik middellijn. Voorzichtig bloot de baarmoeder hoorns met een tang en vingertoppen.
    3. Injecteer ongeveer 1 ui DNA-oplossing (2,5 ug / ul van elk plasmide, afhankelijk van het construct) in de laterale ventrikel van elk hetzelfde nest met een glazen pipet ingebracht door de baarmoederwand. In de meeste gevallen, ongeveer 60-80% van embryo's geïnjecteerd.
    4. Electroporate de embryo's met een electroporator (33-35 V, 50 msec, 950 msec interval 4-8 pulsen).
    5. Zet de baarmoeder hoorns naar de buikholte zachtjes vooreekhoorntjesbrood en vingertoppen. Hecht de spierwand en de huid met chirurgische hechtdraad om het embryo te blijven ontwikkelen.
  3. UAA Micro-injectie
    1. Maak een kleine snede in de buik middellijn opnieuw bij E16.5, en voorzichtig bloot de baarmoeder hoorns met een tang en vingertoppen.
    2. Injecteer ongeveer 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) aan de geëlektroporeerde zijde of beide zijden van het laterale ventrikel met een glazen pipet ingebracht door de baarmoederwand. CMN biologische beschikbaarheid te verhogen, gebruik maken van de dipeptide Cmn-Ala (CMN-alanine) CMN te leveren in vivo 21.
    3. Nogmaals, de terugkeer van de baarmoeder hoorns naar de buikholte voorzichtig met een pincet en vingertoppen. Hecht de spierwand en de huid met chirurgische hechtdraad om het embryo te blijven ontwikkelen.
  4. Verkrijgen Acute Brain Slices
    1. Voeg 1 L kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) bevattende 119 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,3 mM MgCl2, 2,5 mM CaCh 2, 1 mM NaH 2PO 4, 26,2 mM NaHCO 3 en 11 mM glucose bij pH 7,3.
    2. Neem 200 ml ACSF en snel invriezen bij -80 ° C gedurende 20-30 min. Bel de rest van ACSF met 5% CO2: 95% O2 gas bij kamertemperatuur.
    3. Bereid en steriliseer de operatie-instrumenten om de hersenen van de embryo's te oogsten. Ook bereiden een emmer ijs.
    4. Voeg ~ 100 ml 4% laag smeltpunt agarose oplossing in een kolf door verwarmen in een magnetron. Afkoelen oplossing gedurende 5 minuten voordat het begint te stollen.
    5. Euthanaseren de muis 12-24 uur na Cmn-Ala injectie van CO 2 overdosis. Maak grote incisies in de buikstreek en ontleden de geëlektroporeerde / micro-injectie embryo's uit de baarmoeder met een fijne schaar en pincet.
    6. Harvest hersenen van de embryo's met een fijne schaar en pincet.
    7. Plaats elke hersenen op een 10 cm cultuur schotel geplaatst op het ijs emmer. Verdeel twee hersenhelften met een scherp mes, en leg elkehemisfeer op de schaal met het sagittale vlak raakt de bodem van de schaal. Snel giet de agarose oplossing over hersenen (ongeveer 500 pl per halfrond).
    8. Met behulp van een scherp mes, vierkant snijd de agarose rond een brein naar een brain ingebed agarose blok te maken.
    9. Met behulp van weefsel lijm, lijm langs de sagittale vlak oppervlak van de agar blok op een mount voor vibratome. Vul het vibratome kamer met pre-gekoelde ACSF en snijd 200 pm sagittale hersenen plakjes.
    10. Incubeer acute segmenten in ACSF aangevuld met 3 mM myo-inositol, 0,4 mM ascorbinezuur en 2 mM natriumpyruvaat bij 33 ° C gedurende 42 minuten onder doorborrelen met 5% CO2: 95% O2 gas.
    11. Na 42 min, zet de verwarming en blijven de schijfjes bij kamertemperatuur incuberen met borrelen. Start whole-cell patch opname minstens 15 minuten na het uitschakelen van de kachel.
  5. Hele Cell Opnemen met Light Activation
    1. Bereid de Intracellular oplossing die 130 mM kaliumgluconaat, 4 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1,1 mM EGTA, 3,4 mM Na2 ATP, 10 mM natrium- creatinefosfaat en 0,1 mM Na 3 GTP bij pH 7,3 ingesteld met KOH.
    2. Trek patch pipetten van glas elektrodes met behulp van een commercieel micropipet puller tot 3-6 MQ pipet weerstand.
    3. Stel de slice elektrofysiologie rig voor whole-cell patch klem- en superfuse de opname kamer met ACSF bij 2 ml / min rate met een perfusie pomp. Stel de kamertemperatuur tot ongeveer 33 ° C.
      Opmerking: De plak elektrofysiologie rig is voorzien van een perfusie kamer, een water immersie objectief en een temperatuurregelaar. Ook GFP filter (excitatie: 480/30 nm, emissie: 535/40 nm) en mCherry filter (excitatie: 580/20 nm emissie: 675/130 nm) zijn verplicht.
      1. Installeer een LED met emissie van 385 nm door de microscoop op het tuig aan het licht te leveren aan het brandpunt van 1 cm afstand op een 45 °hoek. Controleer de kracht van de LED met een lichte power meter.
    4. pick-up zorgvuldig hersenen slice met een glazen pipet en plaats in de perfusie kamer. Houd het schijfje met een harp.
    5. Patch een neuron met mCherry / GFP fluorescentie van de neocortical regio 27. Record Pirk activiteit met voltage clamp (V-klem) methode. Ten eerste, houd de membraanpotentiaal bij -60 mV. Vervolgens opnemen stromen op vaste negatieve membraan potentials (-100 mV) of spanning opritten (-100 mV tot 40 mV). In het bijzonder, te monitoren kir2.1 specifiek naar binnen stromen bij -100 mV.
    6. Handmatig of met behulp van de data-acquisitie software, knipperen een puls (een enkele puls van 100 msec -1 sec duur) van LED-licht om de neuron tijdens de opname, en kijk of Pirk eiwitten worden geactiveerd. Zodra Pirk geactiveerd, zou binnenwaartse stromingen -100 mV aanzienlijk toenemen.
    7. Voeg 0,5 mM BaCl2 aan het bad en controleer of Pirk weer wordt geïnactiveerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een ​​UAA genetisch te nemen in een eiwit in neuronen, de eerste belangrijke stap is om het ontwerpen van de juiste gen constructen te leveren en efficiënt genen tot expressie in neuronen. Er zijn drie genetische componenten UAA inschrijving: (1) het doelgen de TAG amber stopcodon geïntroduceerd op de gekozen locatie voor UAA opname (2) een orthogonaal tRNA om de gemuteerde TAG stopcodon herkent en (3) een orthogonale aminoacyl -tRNA synthetase de UAA rekenen op de orthogonale tRNA. E...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om effectief foto-modulatie te bereiken, de belangrijke eerste stap is om te beslissen waar het licht aansprekend UAA te nemen in het doelwit eiwit. Structurele en functionele informatie van het doeleiwit is zeer nuttig om de selectie van kandidaatsites leiden. Tegelijkertijd zou het doel van lichtregeling bepalen welke site het meest geschikt. Na het kiezen van de kandidaat-sites, raden wij aan om de sites in zoogdiercellijnen zoals de humane embryonale nier (HEK) cellen voor gemakkelijker cultuur en manipulatie, te te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. S. Szobota voor de nuttige discussie over neuroncultuur en Ca-P transfectie. L.W. erkent de steun van The Salk Innovation Grant, het California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1) en de National Institutes of Health (1DP2OD004744).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dekglazen, Cirkels, 12 mm, Dikte 0,13-0,17 mmCarolina Biologicals633029
Corning BioCoat Poly-D-LysineCorning Discovery Labware354210
D-(+)-Glucose oplossingSigma-AldrichG8769
Iris Spatula-gebogenFine Science Tool10092-12
Dissectiemes - Fijne Afgeronde TipFine Science Tool10056-12
GlutaMAX-I SupplementLife Technologies35050-061
MITO+ Serum ExtenderBD Biosciences355006
Falcon 40 µm Cel ZeefCorning Life Sciences352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)Sigma-AldrichB6420
LED LICHTBRONK – Zwarte LED 385Prizmatix Ltd.
Agarose, Laag Smeltpunt, Analytische KwaliteitPromegaV2111

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kir2 1 kanaalfoto induceerbare PIRKhippocampale neuronenin utero elektroporatiecalciumfosfaattransfectielichtactivatie

Gerelateerde artikelen