Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53845

⸱

19 april 2016

 ,  ,  , 
1Schaller Research Group, University of Heidelberg and the German Cancer Research Center, 2Department of Infectious Diseases, Virology, University of Heidelberg

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een werkwijze uit te drukken en te zuiveren uitstekende kwaliteit norovirus (P) domeinen in E. coli voor röntgen- kristallografie studies. Deze methode kan worden toegepast op andere calicivirus P domeinen, alsmede niet-structurele eiwitten, bijv., Viraal eiwit-gekoppelde genoom (VPG), protease en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp).

Samenvatting

Norovirus capside is samengesteld uit een enkele belangrijke structurele eiwit VP1 genoemd. VP1 is onderverdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein. De S-domein vormt een aaneengesloten steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormen virale spikes op de S domein en bevat determinanten voor antigeniciteit en gastheer-cel interacties. De P-domein bindt koolhydraatstructuren, dwz., Histo-bloedgroep antigenen, die vermoedelijk belangrijk norovirus infecties. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het produceren van hoogwaardige norovirus P domeinen in hoge opbrengsten. Deze eiwitten kunnen vervolgens worden gebruikt voor röntgenkristallografie en ELISA om antigeniciteit en gastheer-cel interacties te bestuderen.

De P domein wordt eerst gekloneerd in een expressievector en tot expressie gebracht in bacteriën. Het eiwit wordt gezuiverd met behulp van drie stappen die gepaard geïmmobiliseerde metaalion-affiniteitschromatografie en gelpermeatiechromatografie. Inprincipe is het mogelijk om te klonen, express, zuiveren en kristalliseren eiwitten in minder dan vier weken, die dit protocol een snel systeem voor het analyseren van opkomende norovirus stammen maakt.

Inleiding

Human noroviruses zijn de belangrijkste oorzaak van acute gastro-enteritis in de wereld 1. Deze virussen behoren tot de familie Caliciviridae, waarvan er ten minste vijf geslachten, met inbegrip van Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus en Nebovirus. Ondanks hun grote impact op de gezondheidszorg en de brede verspreiding, is de studie van de menselijke norovirussen gehinderd door het ontbreken van een robuust celcultuur systeem. Tot op heden zijn er geen goedgekeurde vaccins of antivirale strategieën beschikbaar.

Norovirus belangrijkste capside eiwit VP1 genoemd, kan worden verdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein 2. De P-domein is verbonden met het S domein een flexibel scharnier (H) gebied. De S-domein vormt een steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormt de buitenste deel van het virale capside. P domein verzamelt in biologisch relevante dimeren bij expressie in bacteriën. De Pdimer interageert met koolhydraten structuren, genaamd histo-bloedgroep antigenen (HBGAs), die aanwezig is als oplosbare antigenen in het speeksel en te vinden op bepaalde gastheercellen 3 zijn. De P-domein HBGA interactie gedacht belangrijk voor infectie 4 te zijn. Inderdaad, een recent rapport bleek het belang van synthetische HBGAs of HBGA expressie bacteriën voor menselijke norovirus infectie in vitro 5.

Huidige studies over de gastheercel hechting van noroviruses hoofdzakelijk uitgevoerd met virusachtige deeltjes (VLP's) die kunnen worden uitgedrukt in insectencellen of recombinant P-domeinen tot expressie gebracht in Escherichia coli (E. coli). Om de P-domein-HBGA interacties op atomaire resolutie te begrijpen, kan P domein HBGA complexe structuren worden opgelost met behulp van X-ray kristallografie. We beschrijven hier een protocol P domein expressie en zuivering waarmee de productie van P-domein in hoge hoeveelheid en kwaliteit te gebruiken voor X-ray CrystallOGRAFIE. Bovendien kan deze methode worden toegepast voor andere calicivirus P domeinen en niet-structurele proteïnen.

De P domein codon-geoptimaliseerd voor E. coli expressie en gekloond in een standaard overdracht vector. De P domein wordt vervolgens opnieuw gekloneerd in een expressievector die een polyhistidine (His) tag en een mannose-bindend eiwit (MBP) die gevolgd worden door een protease-splitsingsplaats codeert. De MBP-His-P domein fusieproteïne wordt tot expressie gebracht in E. coli, gevolgd door drie zuiveringsstappen. De MBP-His-P-domein fusieproteïne gezuiverd met geïmmobiliseerd metaalion affiniteitschromatografie (IMAC). Vervolgens wordt het fusie-eiwit geknipt met humaan rhinovirus (HRV) -3C protease en de P-domein wordt van het MBP-His met een extra IMAC zuiveringsstap. Tenslotte wordt de P domein gezuiverd met size exclusion chromatografie (SEC). Het gezuiverde P domein kan dan worden gebruikt voor röntgenkristallografie. Screening van eiwit kristallisatie voorwaarden performed met commercieel verkrijgbare screening kits met behulp van verschillende P-domein eiwit concentraties. Kristalgroei wordt waargenomen en de meest veelbelovende omstandigheden worden geoptimaliseerd.

Met de hier beschreven methoden, is het mogelijk om van gen eiwit te structureren in minder dan vier weken. Daarom is onze werkwijze P domein expressie, zuivering en kristallisatie geschikt norovirus-gastheer interacties op moleculair niveau verschaffen belangrijke gegevens helpt bij up-to-date vaccinontwerp en drug discovery.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. P Domain Klonen

  1. Bepaal de P-domein coderende gebied door middel van sequentie uitlijning van norovirus stammen (bijv GII.10 stam, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) 6. Bovendien verwijdert het flexibele gebied aan het C-uiteinde van het P-domein (Figuur 2A). Codon-geoptimaliseerd DNA voor E. coli expressie en omvatten BamHI (N-terminal) en Notl (C-terminal) restrictie sites om sub-kloon van de P-domein coderende gebied in de pMalc2x expressievector 6,7.
    Opmerking: De P-domein coderende gebied wordt geoptimaliseerd en gesynthetiseerd door een commerciële dienst. De P-domein coderende sequentie (insert) ongeveer 1 kb lang en geleverd met normale transfervector.
  2. Digest 2 pg van de overdrachtsvector met elke 1 ui BamHI (20.000 U / ml) en Notl (10.000 U / ml) restrictie-enzymen gedurende 1 uur bij 37 ° C met fabrikant buffers.
  3. Scheid de gedigereerde inzetstuk op een 1% agarosegelgedurende 20 minuten bij 135 V en zuivert het insert-DNA uit de gel met behulp van een commerciële kit.
  4. Bereid de pMalc2x expressie vector door digestie 2 pg van deze vector met elk 1 ui BamHI (20.000 U / ml) en Notl (10.000 U / ml) restrictie-enzymen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Zuiver de vector uit een agarosegel zoals hierboven (1.3) beschreven. Opmerking: Beide monsters (1,2 en 1,4) kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
  5. Ligeren het gezuiverde insert in de gedigereerde vector pMalc2x de BamHI en NotI restrictieplaatsen met 1 pi T4-DNA-ligase (400.000 U / ml) gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT) (figuur 2B en 2C). Gebruik minimaal 20 ng van de pMalc2x vector en een vector: insert verhouding 1: 3 (moleculair gewicht). Het ligatiemengsel is gewoonlijk ~ 20 pi.
  6. Transformatie 2 ui van het ligatiemengsel in 50 ui chemisch competente E. coli DH5a bacteriecellen gebruik van een standaard transformatieprotocol (10 min op ijs, hitteschok 45 seconden bij 42 ° C) en groeien in 600gl SOC medium gedurende 1 uur bij 37 ° C. Centrifugeer de getransformeerde cellen gedurende 3 min bij 1000 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 30 gl SOC medium.
    1. Plaat het transformatiemengsel op LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline voor selectie en gedurende de nacht groeien bij 37 ° C. Kies ten minste vijf kolonies.
  7. Voor elk van de vijf kolonies enten 2-3 ml kweek van LB-medium aangevuld met 50 ug / ml ampicilline (LB-Amp) en groeien door schudden gedurende de nacht bij 160 rpm bij 37 ° C.
  8. Pak de plasmiden uit de kweek van een nacht met behulp van een commerciële kit. Controleer de aanwezigheid van de P-domein insert door sequentiebepaling met pMalc2x voorwaartse primer (5'- TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') en omgekeerde primer (5'- GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

2. P Domain Expression

  1. Transformatie 1 pl (150 ng / ul - 400 ng / pl) van de pMalc2x vector codeert voor de MBP-His-P domeinfusie-eiwit in 50 pi competente E. coli BL21 cellen onder toepassing van een standaard transformatieprotocol (10 min op ijs, hitteschok 45 seconden bij 42 ° C) en groeien in 600 gl SOC medium gedurende 1 uur bij 37 ° C. Subcultuur in 120 ml LB-amp nacht bij 160 rpm en 37 ° C.
  2. Inoculeer negen liter (bijvoorbeeld 6 x 5 liter flessen met 1,5 liter medium elk) van LB-amp met de subcultuur (1: 100). Kweek de cellen onder schudden bij 160 rpm en 37 ° C totdat de OD600 0,4 bereikt - 0,6. Vervolgens laat de temperatuur tot 22 ° C gedurende ~ 1 uur en vervolgens het induceren van eiwitexpressie met 0,66 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 8. Groeien de cellen overnacht bij 22 ° C (~ 18 uur).
    Opmerking: De temperatuur kan worden gevarieerd, maar we raden aan 22 ° C of lager te gebruiken.
  3. Oogst de cellen door centrifugatie (10.543 x g, 15 min, 4 ° C). Verwijder het supernatant en vries de celpellet bij -20 ° C.

3. 1 ste zuiveringsstap en Protease Cleavage

  1. Bereid buffers die worden gebruikt tijdens de eiwitzuivering stappen van voorraadoplossingen reproduceerbaarheid en stabiliteit van de experimenten te garanderen. Neem vier verschillende buffers voor de geïmmobiliseerde metaalion affiniteitschromatografie (IMAC), die elk een andere concentratie imidazool (10 mM, 20 mM, 50 mM en 250 mM). Voor de SEC, stelt een gelfiltratie buffer (GFB) met een hogere zoutconcentratie, maar zonder imidazool. Gebruik gedeïoniseerd water en filter alle buffers voor gebruik met een poriegrootte van 0,45 urn.
    Opmerking: Voor een gedetailleerde buffer voorbereiding regeling, zie tabel 1.
  2. Ontdooi de celpellet van negen liter kweek en los op in 150 ml PBS bij 4 ° C. Ultrasone trillingen de celsuspensie drie keer gedurende 2 min (vermogen 130 W, 20% amplitude, pulsfrequentie 50%) om de cellen te verstoren. Houd de celsuspensie op ijs tijdens ultrasoonapparaat.
  3. centrifugalege de gesoniceerde celsuspensie (43.667 x g, 30 min, 4 ° C) om celafval te scheiden van het supernatans dat tot expressie gebracht eiwit. Verzamel de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet.
  4. Wassen en equilibreer 10 ml (= 1 kolomvolume [CV]) suspensie van Nikkel (Ni) NTA-agarose kralen met 10 mM imidazool buffer in een chromatografiekolom. Voeg de geëquilibreerde Ni kralen om de supernatant van stap 3,3 bevattende expressie MBP-His-P-domein fusie-eiwit en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder langzame rotatie.
  5. Na incubatie toepassen gehele Ni-bead-eiwitmengsel een chromatografiekolom. Was de kolom langzaam bij elke 5 CVs 10 mM, 20 mM en 50 mM imidazool buffers, te beginnen met 10 mM, 20 mM en vervolgens laatste 50 mM (Figuur 3A).
  6. Elueer het MBP-His-P domein fusieproteïne behulp 250 mM imidazool buffer (Figuur 3A). Tijdens elutie Controleer de OD 280 nm om de elutie van het fusie-eiwit (de toename van OD 28 verifiëren0nm). Ga door elutie totdat de OD 280 nm daalt tot ~ 0.1. Was de kralen met een gehalte van 250 mM imidazool buffer (minimaal 10 cv), gevolgd door ten minste 10 CV van 10 mM imidazool buffer. Sla de kralen voor de tweede zuiveringsstap (deel 4).
  7. Controleer de aanwezigheid van MBP-His-P-domein fusie-eiwit met SDS-PAGE onder toepassing van een 12% SDS-polyacrylamide gel (10 x 8 cm) 9 (Figuur 3A). Voer gelelektroforese op 45 A en 200 V gedurende 45 minuten.
  8. Concentraat (bijvoorbeeld met behulp van een commercieel concentrator) het geëlueerde MBP-His-P-domein fusie-eiwit tot een uiteindelijke concentratie van ~ 3 mg / ml. Klieven MBP-His-P domein fusie met HRV-3C protease tijdens dialyse tegen 2 liter 10 mM imidazool buffer (~ 1: 100) gedurende de nacht bij 4 ° C (Figuur 3A). Afhankelijk van het eindvolume van geconcentreerde proteïneoplossing Voer dialyse in een dialyse cassette of dialyse tubing.
    Opmerking: De hoeveelheid HRV-3C protease voor eiwittensplitsing wordt berekend volgens de specifieke proteaseactiviteit (2 U / pl, 1 U volstaat aanhangende 100 ug eiwit) en de hoeveelheid geëlueerd fusie-eiwit dat varieert het expressieniveau en kan geschat worden uit de SDS-PAGE resultaat (3,7 ).

4. 2 nd zuiveringsstap

  1. Equilibreren de Ni-korrels uit stap 3.6 in 10 mM imidazool buffer.
  2. Incubeer de gedialyseerde eiwit van stap 3,7 (bevattende gesplitst P-domein, MBP eiwit, en HRV-protease) met de geëquilibreerde Ni-parels (4,1) gedurende 30 min bij 4 ° C onder langzame rotatie.
  3. Breng de Ni-kraal mengsel naar een kolom en verzamel het doorstroomkanaal (gesplitst P-domein) (figuur 3B). Meet de eiwitconcentratie zoals het komt uit de kolom totdat de OD 280nm ~ 0,1 bereikt.
    Opmerking: De MBP-His moet gebonden blijven aan de Ni-korrels (Figuur 3B).
  4. Controleer de aanwezigheid van gesplitst P domein met behulp van SDS-PAGE met een 12% gel zoals hierboven (figuur 3B) beschreven. Concentreer het geëlueerde P domein ~ 3 mg / ml en dialyseer gedurende de nacht bij 4 ° C tegen GFB voor daaropvolgende SEC zuivering.

5. 3 rd zuiveringsstap

  1. Was de pompen en leidingen van de HPLC zuivering systeem en pre-evenwicht van de SEC-kolom (zie Materials List) met GFB.
  2. Injecteer de P-domein aan de kolom bij een debiet van 1 ml / min met behulp van een superloop (tot 12 ml) of lus (tot 3 ml), afhankelijk van het volume van de geconcentreerde monster. Nadat de injectie is voltooid, verhoging van de stroomsnelheid 2,5 ml / min.
  3. Aangezien de OD toeneemt en de P domein loskomt van de kolom laat fracties van 1,5 ml. Raadpleeg fracties middels SDS-PAGE met 12% gel (figuur 4A en 4B). Pool alleen de zuiverste fracties en concentreer tot ~ 3 mg / ml en ~ 8 mg / ml.
    Let op: Na ~ 110 ml (void volume) de meeste onzuiverheden worden uitgewassen uit een SEC-kolom met 320 ml bed volume. DeP domein wordt gewoonlijk geëlueerd als een dimeer. Elutietijd / volume van de P domein dimeer is afhankelijk van de graad prep (pg) van de kolom SEC.

6. Kristallisatie van het P Domein

  1. Gebruik de P domein aan ~ 3 mg / ml en 8 mg / ml voor de initiële kristallisatie screening. Maak minstens 100 ul P domein per concentratie voor de eerste schermen met 384 in de handel verkrijgbare screening omstandigheden. Gevolgd door screening bij 18 ° C in een 96-well plaat formaat, waarbij het reservoir bevat 100 ul moederoplossing en een druppel uit 0,2 pi moederoplossing en 0,2 ul eiwit.
  2. Herhaal en optimaliseren succesvolle kristallisatie omstandigheden. Gebruik daarom 15-well platen die 3 rijen bevatten. Het opzetten van de eerste rij met 100% moeder oplossing, de tweede rij met 90% moeder-oplossing en 10% water, en de derde rij met 80% moeder-oplossing en 20% water. Gebruik een druppelgrootte van 2 pl (1 ul eiwit + 1 gl moederoplossing) en 50081; l van de moeder oplossing als reservoir volume.
  3. Gebruik geoptimaliseerd kristal voorwaarden voor co-kristalliseren van het P domein liganden. Bereid platen zoals beschreven in 6.2. In plaats van 2 pl druppelgrootte ingestelde druppels bevattende 1 pi moederoplossing, 1 ul eiwit, en 1 ul van ligand bij een concentratie van 1 mg / ml.
  4. Verzamel data sets van enkele kristallen met behulp van synchrotronstraling. Voer moleculaire vervanging met behulp van gepubliceerde P-domein structuren met een hoge sequentie-overeenkomst als initiële zoekopdracht model 6,10-13.
    Opmerking: De aanwezigheid van een ligand te zien als-un gemodelleerd blob van elektronendichtheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het schema van de beschreven protocol is in Figuur 1. Het protocol omvat 6 belangrijke delen die klonering van het doelwitgen, expressie, een drie-staps zuivering en kristallisatie omvatten. Figuur 2 illustreert het ontwerp van het expressieconstruct (EC) en kenmerken van de pMalc2x expressievector. De volgorde van de meervoudige kloneringsplaats (MCS) van de pMalc2x vector toont restrictie en protease splitsingsplaatsen. Figuur 3 toont ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een protocol voor de expressie en zuivering van norovirus P domeinen in hoge kwaliteit en kwantiteit. Norovirussen zijn niet goed bestudeerd en structurele gegevens worden voortdurend nodig. Voor zover wij weten, heeft P domein productie met behulp van andere protocollen (bv-GST gelabeld P domeinen) problematisch geweest, tot nu toe, en voldoende structurele gegevens over norovirus-gastheer interactie hebt gemist. Met de hier beschreven methode, hebben we onlangs aanzienlijk bijgedragen aan ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De financiering voor deze studie werd verstrekt door de CHS-stichting. Wij danken het platform voor eiwitkristallisatie binnen het uitmundigheidscluster CellNetworks van de Universiteit van Heidelberg voor het screenen van kristallen en de Europese Synchrotronstralingsfaciliteit voor het ter beschikking stellen van synchrotronstralingsfaciliteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
P domein DNALife TechnologiesGeneArt Gene Synthese
pMalc2x  vectorOp aanvraag
BamHINew England BiolabsR0136L
NotINew England BiolabsR0189L
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
QIAquick Gel Extractie KitQiagen28704
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
S.O.C. MediumLife Technologies15544-034
Econo-Column Chromatografie KolomBio-Rad73725122.5 x 10 cm, mogelijk om andere grootte te gebruiken
Ni-NTA AgaroseQiagen30210
Vivaspin 20GE Healthcarevariouscutoff van 10 kDa, 30 kDa en 50 kDa gebruikt
Subcloning Efficiency DH5α Competente CellenLife Technologies18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemisch Competente E. coliLife TechnologiesC6000-03
HRV 3C ProteaseMerck Millipore71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PGGE Healthcare28-9893-34SEC kolom
JCSG Core suitesQiagenvarious4 screens met elk 96 putjes
KoolhydratenDextra Laboratories, UKvariousBloedgroep producten

Referenties

  1. Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
  2. Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
  3. Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
  4. Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
  6. Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
  7. Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
  8. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
  11. Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
  12. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
  13. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  14. Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
  15. Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
  16. Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
  17. Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Norovirus P-domeineiwitexpressieE. coli-expressiegrootte-uitsluitingschromatografiegeïmmobiliseerde metaalaffiniteitSDS-PAGE-analyseeiwitzuiveringantigeniciteitsstudiesinteractie met gastheercel
De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.