Selectief oogsten van Marginating-pulmonaire Leukocyten

Samenvatting

Marginale-pulmonale leukocyten vertonen unieke kenmerken en verschillende immunologische functies in vergelijking met andere leukocytenpopulaties. Hier beschrijven we de selectieve oogst van deze subpopulatie van pulmonale leukocyten, door gedwongen perfusie van de longen bij ratten en muizen. Marginale-pulmonale leukocyten lijken cruciaal te zijn bij het bepalen van de gevoeligheid voor door bloed overgedragen en longgerelateerde ziekten.

Samenvatting

Marginerende-pulmonale (MP) leukocyten zijn leukocyten die zich hechten aan het binnenste endotheel van de longhaarvaten. MP-leukocyten bleken een unieke samenstelling en kenmerken te vertonen in vergelijking met leukocyten van andere immuuncompartimenten. Bewijs suggereert een hogere cytotoxiciteit van natuurlijke killercellen en een duidelijk pro- en anti-inflammatoir profiel van de MP-leukecytenpopulatie in vergelijking met circulerende of splenische immunocyten. De hier gepresenteerde methode maakt selectieve winning van MP-leukocyten mogelijk door gedwongen perfusie van de longen bij muizen of ratten. In tegenstelling tot andere methoden die worden gebruikt om longleukocyten te extraheren, zoals weefselvermaling en biologische afbraak, levert deze methode exclusief leukocyten op uit de longhaarvaten, onverantwoord met parenchymale, interstitiële en broncho-alveolaire cellen. Bovendien behoudt de perfusietechniek beter de integriteit en het fysiologische milieu van MP-leukocyten, zonder fysiologische reacties te veroorzaken als gevolg van weefselverwerking. Deze unieke MP-leukecytenpopulatie is strategisch gelegen om abnormale circulerende cellen te identificeren en hierop te reageren, aangezien alle circulerende kwaadaardige cellen en geïnfecteerde cellen worden tegengehouden tijdens het passeren van de longhaarvaten, fysiek in wisselwerking staan met endotheelcellen en residente leukocyten. Dus, selectieve winning van MP-leukocyten en hun studie onder verschillende omstandigheden kunnen ons begrip van hun biologische en klinische betekenis verbeteren, met name met betrekking tot het beheersen van circulerende afwijkende cellen en longgerelateerde ziekten.

Inleiding

Leukocyten zich te houden aan de haarvaten van de longen (dat wil zeggen, marginating-pulmonaire (MP) leukocyten) ¹ werd aangetoond dat verschillende leukocyten samenstelling en unieke activiteit vertonen in vergelijking met leukocyten uit andere immune compartimenten (bv, circulatie, milt, beenmerg) ^{2- 4.} Bijvoorbeeld, MP-leukocyten vertonen hogere natural killer (NK) cellen cytotoxiciteit tegen verschillende tumorcellen, in vergelijking met circulerende en milt NK-cellen, evenals gedifferentieerde messenger RNA (mRNA) niveaus en verhoogde uitscheiding van pro- en anti-inflammatoire cytokines. De samenstelling van cellen is ook onderscheiden van circulerende leukocyten als MP-leukocyten een hogere verhouding van aangeboren / adaptieve immuniteit in vergelijking met circulerende leukocyten (50% vs. 30%, respectievelijk). Het doel van de werkwijze die hierin wordt selectief oogsten van MP-leukocyten activeren om deze belangrijke en unieke immuuncompartiment (celpopulatie) bestuderen en elucIDATE de impact van verschillende manipulaties (bijvoorbeeld activering van het immuunsysteem) op deze specifieke cellen.

De betekenis van deze unieke populatie begrijpen, is het belangrijk op te merken dat het immuunsysteem regelen circulerende tumorcellen, micrometastasen en residuele ziekte door in vivo functies van celgemedieerde immuniteit (CMI). Dit vermogen blijkt ondanks het precedent falen van het immuunsysteem om de primaire tumor te controleren, en ondersteund door ruime in vivo bewijs kankerpatiënten en diermodellen ^5. Belangrijk, deze bevindingen vaak inconsistent met in vitro en ex vivo studies die aangeven dat de meeste autologe tumorcellen resistent tegen cytotoxiciteit van circulerende leukocyten in bloedmonsters van mensen en dieren (gemeten cytotoxiciteit assays) ^6,7. Dit verschil kan worden toegeschreven aan de in vivo aanwezigheid van verschillende leukocyt populaties, zoals de hiervoorgenoemde MP leukocytpopulatie en specifiek de subpopulatie van geactiveerde NK-cellen ^3. Inderdaad, syngene tumorcellen (MADB106), die bleken resistent tegen circulerende leukocyten en milt zijn, bleken worden gelyseerd door MP-NK-cellen ^3,8. Zo is de zogenaamd "NK-resistente 'MADB106 cellen die uitzaaien naar de longen van fischer344 (F344) ratten worden gecontroleerd door MP-NK-cellen, maar niet door het circuleren of milt NK-cellen, die gewoonlijk worden bestudeerd vanwege hun gemakkelijke toegang.

Gezuiverde en actieve MP-leukocyten zijn toegankelijk via de standaard oogstmethodes leukocyten uit de longen, die gebaseerd zijn op longweefsel vermalen of biologische afbraak ^9. Onze aanpak heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van weefselverwerking benaderingen. Ten eerste, de perfusie aanpak oogst selectief MP-leukocyten, die hen scheidt van andere cellen die afkomstig zijn van de long parenchymale, interstitiële en broncho-alveolaire compartments. Ten tweede, de perfusie techniek beter behoudt de integriteit en de fysiologische milieu van MP-leukocyten, in tegenstelling tot het malen en biologische verwerking benaderingen die cellen beschadigen, verandering van hun morfologie, en induceren de productie en afgifte van verschillende factoren die het immuunsysteem moduleren en specifiek onderdrukken NK ¹⁰ cytotoxiciteit.

De longen zijn een belangrijk doelorgaan voor kanker metastase en verschillende infectieziekten. Alle circulerende maligne cellen en geïnfecteerde cellen passeren de longen haarvaten, waar ze moeten vervormen en interactie met capillaire endotheelcellen en resident leukocyten. Onder deze omstandigheden kunnen circulerende cellen gemakkelijk worden gericht op resident MP-leukocyten. Het lijkt derhalve gunstig biologisch geactiveerde leukocyten in deze immuuncompartiment, en het is belangrijk om deze unieke MP-populatie studie in verschillende biologische, experimentele en klinische settings. Het is het waard om op te merken dat systemic immune activering door verschillende biologische-respons-modificatoren (bijvoorbeeld polyinosinic-polycytidylic acid (poly I: C) Soort-C CpG oligonucleotiden (CpG-C ODN)) is aangetoond dat MP-leukocyten meer dan circulerende leukocyten ^{3 activeren 8,11.}

Protocol

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Tel-Aviv University.

1. Protocol Rat

1. voorbereidingen
   1. Schik 2 vlinder 21 G naalden. Eventueel, voor te bereiden 2-botte kanten vlinder 21 G naalden door het indienen van de scherpe rand van de naald.
   2. Steriliseren chirurgische instrumenten: 2 scharen, forceps afgestompte randen, hemostaat, tand-weefsel forceps gesteriliseerd door autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling.
   3. Bereid PBS met heparine (30 eenheden / ml) door toevoeging van 30 eenheden heparine per ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) oplossing. Gebruik bij RT. 35 ml is de minimaal benodigde volume per dier.
   4. Streamen gehepariniseerde PBS in de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te voorkomen.
2. Perfusie van de longen en het verzamelen van MP-leukocyten
   1. Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Bevestig euthanasie door bewaking ademhaling stoppen.
   2. Na stopzetting van de ademhaling, onmiddellijk openen de peritoneale en borstholte met behulp van de steriele schaar en tand-tissue tang. Voer een middenlijn abdominale incisie langs de buik naar de processus xiphoideus.
   3. Til het borstbeen met behulp van de tang, voorzichtig het snijden van de ribbenkast aan beide zijden, zonder aanprikken van een inwendig orgaan of grote bloedvaten. Klem een ​​hemostaat op het borstbeen en rostraal vouw de ribbenkast naar de cardiopulmonale complex bloot te leggen.
   4. Plaats een vlindernaald in de rechter ventrikel van het hart en binnen ongeveer een minuut verzamelen van de maximale hoeveelheid bloed in een spuit (~ 6 ml van een 250 g dier).
   5. Klem de vena cava met een hemostaat achteruit perfusie van de lever (zie bespreking) voorkomen.
   6. Houd de vlinder naald binnen de rechter ventrikel, terwijl het vervangen van de spuit met het bloed met de uitstroom pijp van de peristaltic pomp.
   7. Plaats een tweede vlinder naald aangesloten op een 5 ml oogsten spuit in de linker ventrikel, het vermijden van de penetratie van het septum interventriculare.
   8. Schakel de peristaltische pomp met een snelheid van ongeveer 5 ml / min en voorzichtig verzamelen in de spuit de eerste milliliters perfusievloeistof die zijn verontreinigd met bloed. Ga door tot het perfusaat kleur verandert van donker tot licht rood. (Gooi de met bloed verontreinigde perfuste).
   9. Zonder stopzetten van de peristaltische pomp, snel vervangen 5 ml oogsten spuit met een 20 ml spuit oogsten en laat 20 ml long perfusaat gebruik van een hogere snelheid van perfusie (tot 7 ml / min). Permanent toezicht op het perfusaat stroom in het verzamelen spuit, terwijl het vermijden van de vorming van vacuüm.
   10. Stoppen van de stroom van de peristaltische pomp.
3. leukocyten Extraction
   1. Centrifugeer de perfusaat gedurende 10 min bij 400 xg.
   2. Zuig het medium.
   3. Voeg 10 ml PBS of medium, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof. Herhaal deze stap twee keer. Het gebruik van PBS of medium afhankelijk van het consequente gebruik van het monster.
   4. Voeg 20 ml PBS of medium, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof.
   5. Reconstitueren de cellen tot de gewenste concentratie, gebaseerd op de samplegebruik (FACS, PCR, etc.).

2. Mouse Protocol

1. voorbereidingen
   1. Schik 2 vlinder 25 G naalden. Eventueel, voor te bereiden 2-botte kanten vlinder 25 G naalden door het indienen van de scherpe rand van de naald.
   2. Steriliseren chirurgische instrumenten: 2 scharen, forceps afgestompte randen, hemostaat, tand-weefsel forceps gesteriliseerd door autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling.
   3. Bereid PBS met heparine (30 eenheden / ml) door toevoeging van 30 eenheden heparine per ml 1x PBS oplossing. Gebruik bij RT. 25 ml is de minimaal benodigde volume per dier.
   4. Streben gehepariniseerde PBS in de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te voorkomen.
2. Perfusie van de longen en het verzamelen van MP-leukocyten
   1. Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Bevestig euthanasie door bewaking ademhaling stoppen.
   2. Na stopzetting van de ademhaling, onmiddellijk openen de peritoneale en borstholte met behulp van de steriele schaar en tand-tissue tang. Voer een middenlijn abdominale incisie langs de buik naar de processus xiphoideus.
   3. Til het borstbeen met behulp van de tang, voorzichtig het snijden van de ribbenkast aan beide zijden, zonder aanprikken van een inwendig orgaan of grote bloedvaten. Klem een ​​hemostaat op het borstbeen en rostraal vouw de ribbenkast naar de cardiopulmonale complex bloot te leggen.
   4. Klem de vena cava met een hemostaat achteruit perfusie van de lever (zie bespreking) voorkomen.
   5. Plaats een vlindernaald verbonden met de uitstroompijp van de peristaltische pomp naar rechts ventricle van het hart, en een tweede vlinder naald aangesloten op een 2 ml oogsten spuit in de linker ventrikel van het hart, avoidingpenetration van de interventriculare septum.
   6. Schakel de pomp op een snelheid van ongeveer 2 ml / minuut; de eerste milliliters bloed besmet perfusaat in de oogst spuit totdat het perfusaat wordt van donker tot licht rood (Gooi het bloed verontreinigde perfuste).
   7. Zonder stopzetten van de peristaltische pomp, snel vervangen 2 ml oogsten spuit met een 10 ml injectiespuit oogsten en laat 10 ml long perfusaat gebruik van een hogere snelheid van perfusie (tot 4 ml / min). Permanent toezicht op het perfusaat stroom in het verzamelen spuit, terwijl het vermijden van de vorming van vacuüm.
   8. Stoppen van de stroom van de peristaltische pomp.
3. leukocyten Extraction
   1. Centrifugeer de perfusaat gedurende 10 min bij 400 xg.
   2. Zuig het medium.
   3. Voeg 10 ml PBS of medium, centrifuge bij 400xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof. Herhaal deze stap drie keer. Het gebruik van PBS of medium afhankelijk van het consequente gebruik van het monster.
   4. Voeg 10 ml PBS of medium, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof.
   5. Reconstitueren de cellen tot de gewenste concentratie, gebaseerd op de samplegebruik (FACS, PCR, etc.).

Resultaten

De MP-compartiment vertonen een andere leukocyten deelverzameling samenstelling ten opzichte van circulerende leukocyten. Gebruikt flowcytometrie analyse werden leukocytsubpopulaties geïdentificeerd en gekwantificeerd aan de samenstelling van zowel circulerende leukocyten en MP karakteriseren. Granulocyten en lymfocyten werden geïdentificeerd op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooit. Binnen de lymfocyten werden NKRP-1 ^heldere cellen geïdentificeerd als NK-cellen CD3 <...

Discussie

De werkwijze die hierin gepresenteerde maakt het selectief oogsten en het bestuderen van de unieke populatie van MP-leukocyten. Vergeleken met circulerende leukocyten of milt, de MP populatie karakteristiek met bijzondere samenstelling van leukocytsubpopulaties, hogere activeringsniveaus, hogere afgifte van verscheidene cytokinen en hogere mRNA niveaus van pro- en anti-inflammatoire cytokines ^2,3. Specifiek hebben we aangetoond dat MP-NK-cellen zijn cytotoxischer dan bloedsomloop NK cellen tegen verschillende...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26G
Butterfly needle	OMG		21G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
Heparin sodium porcine mucosa (perservative free)	Sigma Aldrich