Gecombineerde Registratie van mechanisch gestimuleerde Afferente Output en Nerve Terminal Etikettering Mouse haarfollikel Lanceolate Endings

Samenvatting

Een eenvoudige en nieuwe techniek voor het registreren van afferent ontlading als gevolg van mechanische stimulatie van lancetvormige uiteinden van palissade-uiteinden die muisorenhuid-haarzakjes innerveren, wordt gepresenteerd.

Samenvatting

Een nieuw dissectie en opnametechniek beschreven voor bewaking afferente afvuren opgewekt door mechanische verplaatsing van de haren in de muis oorschelp. De techniek is zeer kosteneffectief en eenvoudig uitgevoerd met materialen algemeen in de meeste laboratoria elektrofysiologie of gemakkelijk gekocht. De dissectie is eenvoudig en snel, met de mechanische verplaatsing geleverd door een generieke electroceramische wafer bestuurd door eigen software. Dezelfde software ook registreert en analyseert de electroneurogram output. De opname van de opgeroepen zenuwactiviteit is door middel van een commercieel differentiële versterker die is aangesloten bij brand gepolijst standaard glas micro-elektroden. Handige tips worden gegeven voor het verbeteren van de kwaliteit van de voorbereiding, het stimuleren en de opnamecondities om de opname kwaliteit te optimaliseren. Het systeem is geschikt voor het testen van de elektrofysiologische en optische eigenschappen van lancetvormige terminals palissade uitgangen van haarzakjes, alsmede deresultaten van de farmacologische en / of genetische manipulatie. Een voorbeeld van het combineren zoals elektrische metingen met mechanische stimulatie en labeling met een styryl pyridinium vitale kleurstof wordt gegeven.

Inleiding

De lancetvormige terminals van sensorische axonen innerveren haarfollikels bij zoogdieren vormen palissaden rond het haar as epitheel. Hun doel is de mechanische verplaatsing van de haren ze omringen detecteren. Ze zijn een mix van snel en langzaam aan te passen eindes die voornamelijk produceren korte uitbarstingen van activiteit in reactie op haar beweging. Activiteit beëindigt zeer snel wanneer beweging stopt, zelfs in aanwezigheid van voortdurende verplaatsing. Hier beschrijven we de ontwikkeling van de oorschelp murine model voor studies lieten structuur en functie in lancetvormige terminals. De oorschelp heeft veel voordelige kenmerken voor het bestuderen van deze uitgangen. Ten eerste, de oorschelp in wezen twee huidlagen apposed back-to-back, met weinig andere weefsel tussen verstoren toegang tot de follikels en terminals. De huid is dun en gemakkelijk ontleed door minimale hoeveelheden aan bindweefsel. De innervatie is gemakkelijk bereikbaar en herkenbaar. Terwijl haar follicles aanwezig, zij relatief dun verspreid, vergemakkelijkt het stimuleren van individuele of kleine groepen follikels mechanisch. De dunne onderliggende huidlaag geeft een goede toegankelijkheid van de zenuwuiteinden met farmacologische drugs en kleurstoffen. Dit maakt ze bijzonder geschikt voor imaging studies met behulp van fluorescentie microscopie. De beeldvorming kan ofwel in levende terminals of na fixatie en verdere histologische verwerking.

De reacties van mechanosensorische neuronen innerveren haarfollikels traditioneel onderzocht bij knaagdieren vibrissae ^1,2 en, in mindere mate, in geïsoleerde huidpreparaten ^3,4. Die hebben ons veel over de algemene beginselen van mechanosensorische fysiologie in de zenuwuiteinden rondom de haarschacht geleerd. De vibrissal voorbereiding maakt exquise controle over de beweging van een enkele haarfollikel. Het kan echter moeilijk zijn om de productie als gevolg van de complexiteit ontcijferen als vibrissalfollikels bevatten ten minste 8 verschillende types van anatomisch verschillende mechanosensorische einde ⁵ en het matchen van deze morfologische types aan specifieke elektrofysiologische reacties is nog steeds een kwestie van geschil. De muis huid / vena zenuw preparaat wordt meestal gebruikt in zijn onthaard staat aan te raken en pijn reacties te onderzoeken. De innervatie van haarfollikels in zo'n preparaat minder complex, maar de dichtheid van de haarzakjes, plus de aanwezigheid van drie verschillende types follikel (guard, Priem / auchene en zigzag haren) zodanig dichte nabijheid ^6, betekent het bestuderen van de specifieke reacties van een enkele follikel of één soort afsluiting wordt weer een uitdaging. Bovendien is dit preparaat een complex dissectie. Tenslotte, zowel vibrissal huid en andere preparaten, is het moeilijk om de uitgangen betrokken terwijl de ex vivo preparaten nog in leven visualiseren. Aldus wordt weefsel snijden Zelfs bij een GFP tot expressie muizenlijnen. Alternatitief, het vereist verdere histologische / immunologische verwerking, zoals fixatie en / of antilichaam incubatie voor immunofluorescentie.

We hebben daarom de oorschelp voorbereiding en gebruikte het om elektrische opnames te maken van een beperkte populatie van haarfollikel afferentia en laten zien dat het membraan fietsen optreedt in deze lanceolate eindes, blijkt uit de opname van styryl pyridinium kleurstoffen. Tenslotte hebben we aangetoond dat de kleurstof niet interfereert met mechanische gevoeligheid wijst dit apparaat geen mechanotransductie kanalen blokkeren. De resultaten van eenvoudige stimulatie en analyseprotocollen geïllustreerd.

Protocol

Mouse post mortem weefsel oogst, moet u door erkende ethische methoden. In het Verenigd Koninkrijk, cervicale dislocatie is een door de overheid goedgekeurde methode voor volwassen muizen (een beursgenoteerde Schedule 1 methode in de UK Animals (Scientific Procedures) Act, 1986 en de Europese Richtlijn 2010/63 / EU). Deze wetgeving wordt lokaal afgedwongen bij de Universiteit van Aberdeen door de Animal Welfare en Ethical Review Board, die beoordeeld en alle procedures worden gebruikt in de volgende protocol goedgekeurd.

Opmerking: Deze werkwijzen werden gebruikt in de gerapporteerde Banks et al onderzoek ^7.

1. Voorbereiding Ears voor Elektrofysiologie

1. Vóór versnijding Bereid een standaard fysiologische zoutoplossing, zoals Liley's (1956) en verzadigd is met _90% O2 / 5% _CO2. Liley's zoutoplossing (mM) omvat: _NaHCO3 (12), KCl (4), KH _{2PO 4} (1), NaCl (138,8), _MgCl2 (1), _CaCl2 (2) en glucose(11).
2. Humaan euthanaseren een volwassen muis zonder beschadiging van de schedel in de buurt van de oren. Hier gebruiken we C57 / Bl6J en MF1 muizen, maar geen standaard laboratorium muis stam kan worden gebruikt. Gebruik bij voorkeur muizen die <25 g of elektrische opname moet worden gecombineerd met styrylkleurstof etikettering etikettering in grotere muizen minder betrouwbaar, vaak slechts in beperkte omschreven gebieden wordt gevonden.
3. Verwijder het hoofd met grote schaar of bot scharen.
4. Plaats het hoofd dorsale kant naar boven in vergast Liley in een brede bodem dissectie schotel (50 cm is meestal handig) op het podium van een stereo dissectie microscoop. Regelmatig (~ 10 min) sluis of dompelen het hoofd met vergaste zoutoplossing.
5. Zorgvuldig incise en scheid de huid aan de basis van de oorschelp (pinna) met springbow schaar en forceps # 3, het blootstellen van het kraakbeen van de externe gehoorgang (EAM). Identificeer de takken van de nervus (mandibulaire divisie, MDV) en goede auriculaire zenuwen als ze f ontstaanrom de schedel in de spleet van de onderkaak en gezamenlijke project door middel van het kraakbeen uitvalsbasis om de concave (anterior) en convexe (posterior) aspecten van de oorschelp huid innerveren, respectievelijk.
6. In de buurt van de schedel, te identificeren waar de twee zenuw takken exit in de groef tussen de kaak en de processus mastoideus. Maximaliseren van hun lengte door voorzichtig aan de pinna van het schedel en snijd de zenuwen nabij de schedel mogelijk.
7. Verwijder de pinna van het hoofd met springbow schaar en zorg ervoor dat het distale stompen van de verdeelde zenuwen voorkomen en minimaliseren van de hoeveelheid dichte vacht op basis van het oor die wordt verwijderd.
8. Breng de oorschelp een flexibele siliconen rubber (PDMS) heeft post gevat schotel gevuld met vloeistof begaste Liley's. Open de EAM door deze te delen op zijn smalst (anterior-de meeste) punt. Plat de oorschelp, anterior huid (holle) naar beneden en pin om de PDMS voorzichtig aan de randen met ~ 6-8 regelmatige afstanden zeer fijn (~ 0,2 mm diameter) insect pinnen.
9. Remove de huid van de dorsale zijde van de oorschelp en partieel de oorschelp kraakbeen door stompe dissectie verwijderd met # 3 tang, zodat de voorste huid intact gelaten.
10. Met de punt van een fijne insect pin greep met # 3 tang voorzichtig de takken (meestal 2) van de MDV dat posterior ontstaan ​​tussen de huid en EAM kraakbeen uit te breiden. Speld deze aan de PDMS met de best mogelijke insect pinnen, gespietst het bindweefsel aangrenzende hun afgesneden einden en niet het lef stammen zelf.
11. Verwijder het grootste deel van het omringende bindweefsel om hen heen, zorgvuldig vermijden van schade als gevolg van overmatige trekken of snijden.

2. Elektrofysiologische opname Set Up

1. Speld de oorschelp huid aan de PDMS-beklede basis van een opname kamer met fijne insecten kunnen de randen (~ 6-8 per oor), het plaatsen van het gereinigde zenuwen aan de basis van het oor nabij beide zuig elektroden - een voor opname (te neem de zenuw) en de othaar een onverschillige elektrode (in de neutrale signaal naar een differentiële versterker te bieden, zie ^7).
2. Voor de registratie-elektrode, goed overeenkomen met de opening en de binnendiameter van de opening aan de gecombineerde dikte van de twee zenuwen, zodat ze passen zo precies mogelijk en voor een zo groot mogelijke lengte.
3. Trek de zenuwen in de elektrode door voorzichtig afzuigen van een 2 ml spuit aan het andere uiteinde met silicone rubber slang. Zorg ervoor dat de zenuwen zijn recht, niet gevouwen of verdubbeld.
4. Het ontwikkelen van een hoge weerstand / impedantie fit elektrische door het gebruik van sterkere afzuigen bindweefsel of vetweefsel vestigen op een plug die strak sluit de opening rond de zenuw vormen.
5. Vul het andere (onverschillig) elektrode met een zoutoplossing door afzuiging indien nodig (kan vullen door capillaire werking).
6. Plaats identieke opname draden (zilver of platina) in de inwendige boring van de opname elektroden contact opnemen met de zoutoplossing en de zenuw(Opname) of vernauwde, vuur gepolijste uiteinde (onverschillig) van de elektrode. Elke elektrode wordt individueel gesoldeerd aan verschillende kernen van twee-aderige afgeschermde kabel. Plaats het bad (grond) elektrode (Ag / AgCl pellet) in het bad, en maalde het om het scherm van de twee-aderige kabel aangesloten op de registrerende elektroden.
7. Voed de elektrische activiteit van de twee elektroden in de afzonderlijke kanalen van een differentiële versterker, filter (-band gepasseerd 0,2-2 kHz), en het uitzicht op een oscilloscoop scherm. Controleer dat kanaal A (opname) en het kanaal B (onverschillig) elektrische ruis niveaus lijken. In deze fase kan het onmogelijk zijn om normale spontane actiepotentialen in kanaal A zien voor de twee elektroden in evenwicht.
8. Herstellen verschillen in achtergrondruis tussen de elektroden door het verhogen van de impedantie van de opname (kanaal A) of onverschillig (kanaal B) elektroden. Doe dit door te zuigen areolar (vet) bindweefsel verder in beide elektrode en /of het toepassen grotere zuigkracht op de 50 ml spuit.
   1. Once 'evenwichtig' op deze manier terug te schakelen naar differentieel (AB) opname en kijk voor spontane actiepotentialen (AP's) in het spoor of wanneer strelen haartjes aan de rand van de oorschelp. Als er geen activiteit (stekelige) wordt gezien, re-check de strakke pasvorm van de zenuw in de registratie-elektrode en de areolar bindweefsel in de onverschillige elektrode - meestal de strengere (hogere weerstand) de afdichting en de meer gelijk zijn aan de impedantie in de twee elektroden, hoe beter. signaal: ruisverhouding: met de praktijk, zal dit een goede kwaliteit (1> 2) te bereiken.
9. Noteer de electroneurogram via een lab-interface en elektrofysiologie software draait op een computer. Een audio-uitgang van spiking is zeer nuttig en kan worden bereikt door het toevoeren neurogram via een audioversterker en bijbehorende audio luidspreker. Stel de drempel net boven de basislijnruis (geïdentificeerd door de afwezigheid van witte-noise 'fluiten').
10. Om geneesmiddel of fluorescerende styrylkleurstof toegang tot de lanceolate eindes te verhogen, voorzichtig afpellen de sub-huid vetlaag in de buurt van de oorschelp marge, het openen van een raam van ~ 5 mm x 5 mm blootstellen van de huid en de basis van de follikels (Figuur 1A, B ).
11. Pin terug een plooi van ~ 1 mm-vet ontruimd oor huid op de toonaangevende marge (op het niveau van het venster net geproduceerd, indien van toepassing), waardoor een heldere zoutoplossing gevulde kloof tussen de apposed huidlagen. Voorzichtig slag haren uitsteekt langs de gevouwen rand met een pen of geaarde fijne tang zonder gebruikmaking van de huid, het gebied van maximale AP uitgang van de oscilloscoop en de kenmerkende 'klikken' en 'springt' in de audio-uitgang vinden.

3. Opname Stimulus-opgeroepen actiepotentialen

1. Plaats de mechanische stimulatie sonde - een brand-gepolijste 10 cm borosilicaat glas micro-elektrode bevestigd aan een Ceramic piëzo-elektrische aandrijving - zodat beweging evenwijdig aan de huidplooi. Plaats de tip ongeveer 0,5-1 mm van huidplooi, zodat de haren, maar niet de huid raakt. Controleer effectieve stimulatie door de sonde langzaam handmatig verplaatsen naar de haren af ​​te buigen en te observeren / luisteren naar de stekelige.
2. Met de software mechanische stimulatie van 1-3 haren trekken (bijvoorbeeld 3 sec bij 5 Hz sinusoïden, elke 10 sec. Sondeverplaatsing 200-500 urn), en de stimulatie opgewekte responsen in de zenuwen nemen.
3. Geef meerdere identieke mechanische stimulatie treinen op 10 sec intervallen. Optimaliseer de sonde positie voor de herhaalbaarheid, verlaag dan de frequentie van de stimulatie volgens experimentele protocol (bijv daling repeat rate van 10 sec tot 30 sec).
4. Gebruik de software AP-achtige activiteit bv discrimineren op eenvoudige drempel ingesteld op ~ 2x de hoogfrequente ruis amplitude en ~ 25% van de grootste AP.
5. Tel de AP's oversteken van de drempel"Events", het kwantificeren van de frequentie en de kenmerken van de geproduceerde AP.

4. Opname Stimulus-opgeroepen Firing In combinatie met N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide Labeling

1. Om de effecten van styrylkleurstoffen on-stimulus opgewekte afferente afvuren en klemnummering onderzoeken, voeg de juiste concentratie van een styrylkleurstof keuze, de badoplossing en verder met elektrische opname.
2. Na de vereiste blootstellingstijd (gewoonlijk ten minste 30 min), bereid de voorbereiding voor het bekijken van de follikels. Vouw de flap huid door het verwijderen van de borgpennen, en bloot de ontruimde huid gebied om de terminal labeling onthullen.
3. Wegspoelen externe kleurstof met dye-vrije zoutoplossing, waardoor 3 volledige veranderingen van de zoutoplossing.
4. Incubeer in de laatste verandering van vergast dye-vrije zoutoplossing 10-15 min om de meest hardnekkige kleurstof verontreiniging uitlogen van blootstelling / externe membranen.
5. Verwijder niet-geïnternaliseerde kleurstof achterblijft op membranen met een sequestreermiddel (sulfobutylated beta-cyclodextrine, 1 mM, 5 min) in zoutoplossing.
6. Breng de opname kamer op het podium van een rechtopstaande epifluorescentie microscoop en schakel de kamer met de stage / slide bewegingsmechanisme.
7. Verlichten de voorbereiding met excitatielicht geschikt is voor de styryl kleurstof. Gebruik een 10X en 25X fluorescentiemicroscoop doel de follikel kenmerking (figuur 1) waarnemen.

Resultaten

De elektrofysiologische optekeninrichting, met het subcutane vetweefsel verwijderd om de haarfollikels blootgesteld, wordt getoond in Figuur 1A. Een gedeelte van deze blootgestelde oppervlak wordt weergegeven bij een sterkere vergroting in helderveld verlichting in figuur 1B. Vouwen van de oorschelp marge en op zichzelf terug in dit gebied loopt de epidermale oppervlak. Dit positioneert de haren op de rand van de vouw horizontaal uitsteken, in een ideale situatie voor mechanische stimulatie met een stompe sonde (niet getoond). Figuur 1C geeft na blootstelling kleurstof en het retourneren van de marge de ongevouwen positie weer, de gestimuleerde follikels op deze positie zijn gemerkt met een styryl pyridinium kleurstof. Electroneurograms van preparaten Typisch voor continue AP-activiteit, zelfs in afwezigheid van opgelegde verplaatsing van de glasvezel probe, waaronder AP de grootste maat (Figuur 2A i-iii). Activiteit plaatsvindt met een snelheid van ongeveer 10-20 pulsen / sec ( "spikes" trace), geeft geen structuur of tekenen van toniciteit, zoals de auto-correlatie van de intervallen tussen periodes van stimulatie vrij vlak. Gedurende 5 Hz, 100 um mechanische stimulatie van het haar schachten, de totale productie stijgt doorgaans naar 20-50 impulsen / sec, of 4-10 per sinusvormige cyclus. Constructie van cyclus histogrammen blijkt dan sterk entrainment (zogenaamde "fasekoppeling") van de reacties (figuur 2BI-iii)). Dit is zeer herhaalbaar, hoewel de fase van de golfvorm waarbij de reacties worden geblokkeerd afhankelijk van hun positie, dat wil zeggen op welk punt in de beweging de vibrerende sonde deze de haren. Een eenvoudige drempeldetectie (horizontale lijn die de sporen neurogram A (i-iii)) werd gebruikt voor deze analyse. Echter kan opnemen softwarefuncties vaak worden gebruikt in een meer verfijnde manier omdiscrimineren kenmerken van spike grootte en vorm. Dit kan vervolgens de antwoorden van bijzonder afferente vezels isoleren deze kenmerken om opname pseudo-single-unit analyse uit te voeren.

Figuur 1:. Elektrofysiologische opname Arrangement en N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide Labeling van haarfollikel Afferente Lanceolate eindes (A) Een oorschelp voorbereiding opgericht voor een elektrofysiologische experiment toont de oorschelp oriëntatie, de locatie van de zenuwen, de registrerende elektroden en het blootgestelde oppervlak van follikel innervatie na vetweefsel verwijderd. (B) Verschillende haarfollikels zijn zichtbaar in helderveld verlichting in de ontruimde van bovenliggende vetweefsel naar beneden naar de dermis gebied. De donkere, meestal bilobed, vormen zijn talgklieren. ( C) vergroot aanzicht van de boxed gebied B) die twee lancetvormige uiteinden gelabeld met de styrylkleurstof N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide en afgebeeld na mechanische stimulatie door epifluorescentie microscopie . Vanaf ^7, met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: (A)-Stimulus opgeroepen Activity Opgenomen van de Muis Pinna. (Ai-iii) voorbeelden, afkomstig uit 3 verschillende experimenten, van de activiteit van de continue neurograms van pinnae in standaard Liley's zoutoplossing. Elk record toont een 5 sec deel ongeveer 5 minuten na het begin van de opname, inclusief 3 sec periode van sinusoïdale verschuiving van alsmall aantal van haar schachten. De mechanische stimulatie werd herhaald elke 30 sec gedurende de continue registratie, die meestal duurde 1-2 uur. Douanemanuscript bestanden gemarkeerd afzonderlijke gebeurtenissen die een drempel door de horizontale cursor (aren) ingesteld, en het begin van elke sinusvormige cyclus (periode) gekruist. (AIV) Het stuursignaal voor sinusvormige verplaatsing. (B) Analyse van Stimulus-opgeroepen Spiking activiteit. (Bi-iii) Cycle histogrammen in 3 ° bakken opgebouwd uit de neurogram monsters respectievelijk (Ai-iii), die de reacties van veronderstelde lanceolate eindes aan mechanische stimulatie door 5 Hz sinusvormige verplaatsing van haar schachten door een glazen sonde. Let op de gemarkeerde fasekoppeling, in verschillende fasen van de cyclus, afhankelijk van hun positie ten opzichte van de uitgangspositie van de mechanische sonde. Vastgoedmakelaars (BIV) genormaliseerde sonde verplaatsing sinusoïde; de werkelijke amplitude ongeveer 1001; m. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hier hebben we een betrekkelijk eenvoudige bewerking die snel kan worden ontleed ontwikkeld en geringe dichtheid haarfollikel en maakt relatief selectieve mechanische stimulatie van een klein aantal haarzakjes. Het is gemakkelijk toegankelijk voor elektrofysiologische opnemen en live-cell fluorescerende beeldvorming, met inbegrip van de reacties op aanvraag bij de mechanisch gestimuleerde haarzakjes, dwz beeldvorming follikels met gedefinieerde elektrofysiologische reacties te visualiseren verven. Hoewel we niet hebben gedaan, dit systeem lijkt ook gemakkelijk vatbaar is voor sub-verdelen van de sensorische zenuwen voor de eenheid (één zintuiglijke axon) opname en het gebruik van gerichte GFP-expressie voor het visualiseren van sensorische terminal eindigt morfologie.

Wij hebben de bereiding oorhuid de kenmerken van de opname en afgifte van het fluorescente membraan styryl kleurstoffen pridinium ⁷ onderzoeken, een techniek oorspronkelijk ontwikkeld om gelokaliseerde Vesic bestuderenle membraan recycling in synaptische terminals ^8. In synapsen wordt beeldvorming ook direct in combinatie met gelijktijdige registratie van elektrofysiologische respons op geïdentificeerde terminals ^8,9. Het was in deze vroege studies die we voor het eerst kennis genomen van de kleurstoffen werden ook geïnternaliseerd door mechanosensorische eindes ^10. Voor de sensorische neuronen in kweek en slakkenhuis haarcellen, veel van de kenmerken van pyridinium styryl kleurstoffen lijkt kleurstoffen die door de mechanosensorische kanalen, die zij dan geblokkeerd ^11,12 betrekken. De kleurstoffen label vervolgens intracellulaire membranen, en deze etikettering is onomkeerbaar. In haarcellen die niet mechanisch gestimuleerd ^13,14 en in volledig gedifferentieerde primaire sensorische zenuwuiteinden in situ, zoals Ia eindes in spierspoeltjes ^15, en de uitgangen lancetvormige hier ^7, styrylkleurstof kenmerken lijkt membraan endocytose geven, aangezien etikettering is omkeerbaar en niet de mechanosensorische res blokkerenponses ^7,15,16. Terwijl sommige kleurstof internalisatie per kanaal doordringen in deze endings niet volledig kan worden uitgesloten, blijkt uit de voortdurende afvuren tijdens kleurstof incubatie en de omkeerbaarheid van de etikettering, dat de grote meerderheid van de etikettering in gedifferentieerde terminals in situ is door internalisering met recycling blaasje membraan. Daarom is deze eenvoudige techniek gemakkelijk voor gecombineerde elektrische en optische controle van verschillende mechanosensorische terminal functies ex vivo weefsels.

Zoals bij de meeste praktische technieken zullen reproduceerbaarheid herhaling en werkwijzen is. Enkele van de belangrijkste punten waard bijzondere aandacht zal nu worden beschreven. Hele dissectie en opnamesessie maximaliseren weefsel levensvatbaarheid en overleving door zowel de bereiding constant geperfundeerd met zoutoplossing volledig verzadigd met _95% O2 / 5% _CO2. Zorg ervoor dat de haarzakjes worden tijdens dit proces niet verplaatst, which will zintuiglijke einde vuren te stimuleren. Ofwel een continue laminaire stroming perfusiesysteem of zorgvuldig bel gas via het orgaanbad met fijne buis op afstand van de bereiding of zorgvuldig verversen producten elke 20-30 min, waarbij het preparaat onder de zoutoplossing onder alle omstandigheden. Zuig opname elektroden worden gemaakt door het modificeren van scherpe electrode borosilicate pipetten normaal gebruikt voor intracellulaire opname. Ten eerste, voorzichtig afbreken van de scherpe punten met # 3 tang om de juiste binnendiameter aan de zenuwen en brand-polish fit door zeer korte (<1 sec) blootstelling aan bunsenbrander vlam te geven (zie 2.4 en 2.5). Om een ​​goede signaal-ruisverhouding bij het opnemen te krijgen, is het essentieel dat de elektrische impedantie (weerstand) in deze twee elektroden zowel gemaximaliseerd en gelijke. Doe dit door aandacht te besteden aan de volgende in de twee elektroden. Voor de registratie-elektrode, zorgen voor de inwendige diameter is een goede pasvorm voor de zenuw, en de maximale lengte van de nerve wordt in de registratie-elektrode. Probeer het bindweefsel rond de zenuw te gebruiken om effectief af te dichten de elektrode tip. Alternatief, of daarnaast, trekken het dunne uiteinde van een geschikte grootte, verloopstuk van vetweefsel langs de zenuw. Steek dan de elektrode door het toepassen van sterke zuigkracht voor ~ 1 min met een 50 ml spuit bevestigd aan de slang. Voor een goed afgesloten tip, het toepassen van sterke zuigkracht gewoon versterken van de effectiviteit van de plug en zal niet tekenen in meer liquide of zenuw. Om schade aan de zenuwen te voorkomen, echter voor zorgen dat het bindweefsel is het opvangen van de zenuw van compressie op het omringende materiaal en EAM kraakbeen. De indifferente elektrode moet de weerstand / impedantie van de registratie-elektrode zo dicht nabootsen mogelijk. Dit wordt geholpen door het zorgvuldig brand-polijsten van de tip om zo klein een opening mogelijk zonder daadwerkelijk te dichten. Als de verdere weerstand nodig is, dan sluit het einde van de onverschillige elektrode met Adipose bindweefsel, zoals hierboven voor de registratie-elektrode beschreven.

De electroceramische geeft exquise controle over de mechanische verplaatsing, zowel ruimtelijk als in de tijd. Echter, zorgen voor het maken van elektrische verbindingen - hoge temperaturen te vernietigen, dus geen gebruik maken van warm solderen. Gebruik-metal beladen epoxy lijm, of gebruik een specialist push-fit aansluiting aanbevolen door de leverancier. Dit zal zowel houd het stevig vast en stellen elektrische verbindingen. Bevestig het glas stimulerende sonde naar de electroceramische met standaard epoxyhars. Brand-polish na een standaard 10 cm x 1,5 mm diameter borosilicaatglas capillaire buizen gebruikt voor het maken patch of scherpe elektroden voor elektrofysiologische opname om het risico van weefselbeschadiging te minimaliseren. Als één haarfollikel stimulatie nodig is, brand-polish de tip om een ​​enkele haar passen, en de positie van de sonde met een enkele haren in de open diafragma. Dit geeft exquise controle over een enkele haar. Voor styryl dye labeling is algemeen uniform weefsels jongere dieren. Het is niet geheel duidelijk waarom, maar dit weerspiegelt waarschijnlijk minder mechanische trauma en effectievere deep tissue verwijdering van de jongere weefsels. Wees grondig in het verwijderen van de schuimende laag gelijkende geëxpandeerd polystyreen bovenop de haarfollikel bases. Vermijd echter al te krachtig, omdat dit risico het verwijderen van de zenuw plexus laag en bijbehorende lancetvormig terminals. Als er weinig of geen elektrische responsie op haarfollikel beweging en styrylkleurstof toepassing leidt tot overheersende kenmerken van talgklieren (geel / wit) met verschillende autofluorescentie van de basis van de haarschacht plaats lancetvormige eindes (oranje / geel), over-enthousiaste goedkeuring heeft schade toegebracht aan de onderliggende weefsels. Bovendien zullen, met een kleurstof-cheleringsmiddel voor de beeldvorming sterk verbetert het contrast en de kwaliteit van het uiteindelijke beeld.

Deze techniek kan bruikbaar zijn bij een reeks verdere studies. deze could omvatten bijvoorbeeld screening op de mechanosensorische (s) die verantwoordelijk zijn voor rek opgewekte responsen door incuberen het preparaat met farmacologische liganden selectief voor kandidaat kanalen of screening muizenlijnen met dergelijke kanalen genetisch geschrapt. Deze laatste kan worden gecombineerd met fluorescentie beoordeling van eventuele veranderingen in terminal morfologie te wijten aan genetische manipulatie in de muis lijnen, bijvoorbeeld met NPY2R gekoppelde GFP expressie ^17. Een laatste voorbeeld kan onderzoek naar de rol van synaptische-achtige blaasjes (SLV) ⁷ in deze lancetvormige terminals door het onderzoeken van het effect van modulatoren omzet SLV (Ca, Mg, alfa-latrotoxine, glutamaat receptor liganden) op het rek opgewekte reacties en styryl kleurstofopname / release. Dus, deze nieuwe techniek opent een reeks van potentieel interessante mogelijkheden van het onderzoek in mechansensory neurowetenschappen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PDMS - Sylgard 184	Dow Corning		Flexibele, inerte, doorschijnende vaste siliconen polymeer.
No. 3 Dumont forceps	Fine Science Tools	11231-20
Austerlitz Insect pins	Fine Science Tools	26002-10	Zeer fijne pinnen om pinna-voorbereiding veilig te bevestigen aan de PDMS met minimale schade.
AC Differential Preamplifier	Digitimer	Neurolog NL104A	Versterking van de grootte van het binnenkomende afferent electroneurogram. Differentiële opname minimaliseert de externe elektrische ruis en baseline drift.
High/Low-pass Filter	Digitimer	Neurolog NL125	Signaalverwerking, door het verminderen van externe elektrische ruis om de beste signaal-ruisverhouding te garanderen.
Spike Trigger	Digitimer	Neurolog NL201	Stel de drempelwaarde van het gebeurtenisdetector in en toon deze op de oscilloscoop. Dit toont de detectiëfficiëntie van het actiepotentiaal.
Audio Amplifier & speakers	Digitimer	Neurolog NL120S	Handige audio monitoring voor de aanwezigheid van elektrische ontsteking van de sensorische uiteinden tijdens het aanpassen van de mechanische stimulatie voorbereiding onder de microscoop
Oscilloscope	Digitimer	PM3380A	We gebruiken dit oude model, maar elke standaard oscilloscoop zal volstaan.
Piezo electroceramic  wafer	Morgan Electroceramics, Southampton UK	PZT507	Elektrofysiologie/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply	Home made		0-200 V DC uitgang om de verplaatsing van de keramische wafer aan te drijven, met variabele elektronische besturing van de uitgang via opname/stimulatiesoftware en computerinterface. We gebruiken Spike2-software en 1401micro computerinterface.
Elektrofysiologie Software	Cambridge Electronic Design (CED)	Spike2 v7	Elektrofysiologie opname-, stimulatie- en dataanalysesoftware
Laboratory interface	Cambridge Electronic Design (CED)	1401 micro	Elektrofysiologie interface, tussen de versterker/filters en de computer. Het voert het electroneurogram in en drijft ook de elektrokeramische beweging aan.
FM1-43/Synaptogreen C4	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70020	Fluorescente membraan sonde die omkeerbaar partitioneert in het buitenste blad van celmembranen. Voornamelijk gebruikt voor het monitoren van endo-/exocytose van vesikelmembranen.
Advasep 7	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70029	Een sulfoneerd bèta-cyclodextrine derivaat dat FM1-43 (& andere styryl pyridinium kleurstoffen) cheleert uit de blootgestelde membranen, waardoor geïnternaliseerde kleurstof duidelijker zichtbaar wordt door de achtergrondlabeling/fluorescentie te verlagen.
Retiga Exi Fast 1394	Qimaging		Monochroom, gekoelde CCD-camera - basismodel
Volocity 3D Image Analysis Software	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Software voor beeldvastlegging en -analyse.