Een fijnafstemming regulatie van gentranscriptie ten grondslag ligt aan embryonale cel lot beslissing. Hierin beschrijven we chromatine immunoprecipitatie assays gebruikt om epigenetische regulatie van zowel cardiale differentiatie van stamcellen en cardiale ontwikkeling van muizenembryo's te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Specifiek gen transcriptie is een belangrijk biologisch proces dat lot van de cel beslissing ten grondslag ligt tijdens de embryonale ontwikkeling. Het biologisch proces wordt gemedieerd door transcriptiefactoren die genomische regulatoire gebieden zoals enhancers en promoters van cardiale genen constitutieve binden. DNA wordt rond histonen die worden blootgesteld aan chemische modificaties. Modificaties van histonen verder leiden tot een onderdrukte, geactiveerd of poised gentranscriptie, dus brengt een ander niveau van fine tuning regulatie van gentranscriptie. Embryonale stamcellen (ES-cellen) herhalen binnen embryo organen (dwz cel aggregaten) of 2D kweek de vroege stappen van ontwikkeling van het hart. Ze bieden in principe genoeg materiaal voor chromatine immunoprecipitatie (chip), een technologie die in grote lijnen gebruikt om gen regulerende gebieden te identificeren. Verder menselijke embryonale cellen vormen een menselijke cel model van cardiogenese. In latere stadia van ontwikkeling, muis embryonale weefsels mogelijk makenonderzoek naar specifieke epigenetische landschappen die nodig zijn voor de bepaling van de cel identiteit. Hierin beschrijven we de protocollen van de chip, sequentiële ChIP gevolgd door PCR of ChIP-sequencing met behulp van ES-cellen, embryo lichamen en cardiale specifieke embryonale regio's. Deze protocollen laten onderzoeken van de epigenetische regulatie van cardiale gen-transcriptie.
Inleiding
Het hart is het eerste orgaan te vormen en functioneel in het embryo worden. Het hart is opgebouwd uit vele cellijnen die voortkomen uit de eerste en tweede embryonale hart velden 1. Uit de post-bevruchting blastocyst stadium tot aan de gevormde hart, embryonale cellen moeten dus veel mobiele beslissingen over het lot te maken. Gene transcriptie wordt geregeld in een tijd- en ruimte-afhankelijke manier en is een belangrijk biologisch proces dat lot van de cel beslissing ten grondslag ligt tijdens de embryonale ontwikkeling. Een dergelijke werkwijze wordt gemedieerd door specifieke transcriptiefactoren die regelende gebieden in het genoom waaronder en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. DNA-eiwit Verknoping
- Fix in 15 ml buisjes geoogste-ES-cellen (2 x 10 6 cellen regelmatige ChIP, 2 x 10 5 cellen Microchip), embryo organen (EBS) gegenereerd uit ES-cellen en embryonale hartweefsel ontleed van E9.5 muizenembryo's (atrioventriculaire kanaal uitstroombaan en ventrikel) middels 1% formaldehyde in PBS gedurende cellen of permeabilisatie buffer PB2 voor embryonale weefsels. Plaats de buizen op rondschudapparaat bij een snelheid van 60 rpm bij kamertemperatuur gedurende exact 10 minuten.
- Stop de verknopingsreactie door toevoeging van glycine tot een eindconcentratie van 125 mM en incubeer gedurende 5 minuten....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1A illustreert de eerste bereiding van DNA-bindende kralen en kwaliteitscontrole middels DNA van verschillende grootte (1 kb ladder). 0ne, 2 en 2,5 volumes (1-3) van de korrels werd een volume van het monster hoog en laag molecuulgrootte DNA-fragmenten te zuiveren toegevoegd.
Figuren 1 B, C, D zijn typische voorbeelden van DNA gelen uit geheel gesoniceerde DNA geëxtraheerd uit muizen ES.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Epigenetica is een belangrijk gebied van onderzoek in ontwikkelingsbiologie geworden. Hoe een genetische programma wordt geactiveerd in embryonale cellen om de cellen te laten verwerven van een specifieke identiteit binnen een embryonale geslacht is al lange tijd een belangrijke vraag voor de ontwikkelingsbiologie biologen.
Chip is in grote lijnen gebruikt in de laatste jaren en gecombineerd om DNA-sequencing volgende verbetering van de resolutie van sequencing. Dit is uitgegroeid tot een kr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen financiering van agentschappen, het IMI StemBANCC Europees gemeenschapsprogramma, de leducq Stichting (SHAPEHEART) en de Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cel Fixatie |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteasenremmer |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteasenremmer |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteasenremmer |
| Protein A magnetische kralen | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitatie |
| SPRI magnetische kralen | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA-zuivering |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Eiwitvertering |
| DNA BR standaard | Life technologies | Q32850 | Calibratiebereik |
| Syber groen | Molecular Probes | S-11484 | DNA-kwantificering |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA-kwantificering |
| PBX 1x | Life technologies | 14190-094 | Wassen |
| DNase RNase-vrij water | Life technologies | 10977-035 | Verdunning |
| Axygen buis | Axygen | MCT-175-C | ChIP-zuivering |
| Antilichaam | Bedrijf | Referentie | ChIP-concentratie |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg voor ESC en EB's, 1 µg voor weefsels |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg voor ESC en EB's, 1 µg voor weefsels |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg voor ESC en EB's, 1 µg voor weefsels |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg voor ESC en EB's, 1 µg voor weefsels |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg voor ESC en EB's, 1 µg voor weefsels |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg voor ESC en EB's, 1 µg voor weefsels |
Referenties
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
