Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo's

14.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53877

⸱

12 maart 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Samenvatting

De zebravis (Danio rerio) is een krachtig modelorganisme om de ontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen. Hoewel veel aspecten van de embryonale ontwikkeling van de zebravis op morfologisch niveau zijn beschreven, is er weinig bekend over de moleculaire basis van cellulaire veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling van het organisme. Met recente vorderingen in microfluidische en multiplexing technologieën, is het nu mogelijk om genexpressie in enkele cellen te karakteriseren. Dit maakt onderzoek naar heterogeniteit tussen individuele cellen van specifieke celpopulaties mogelijk om celsubtypen te identificeren en classificeren, intermediaire toestanden te karakteriseren die optreden tijdens celdifferentiatie, en differentiële cellulaire reacties op stimuli te onderzoeken. Deze studie beschrijft een protocol om levensvatbare, enkele cellen te isoleren van zebravis-embryo's voor high throughput multiplexing assays. Deze methode kan snel worden toegepast op elk embryonaal celtype van de zebravis met fluorescente markers. Een uitbreiding van deze methode kan ook worden gebruikt in combinatie met high throughput sequencing technologieën om het transcriptoom van enkele cellen volledig te karakteriseren. Als bewijs van principe werd de relatieve abundantie van cardiale differentiatiemarkers beoordeeld in geïsoleerde, enkele cellen afgeleid van nkx2.5 positieve cardiale progenitors. Door evaluatie van genexpressie op het niveau van enkele cellen en op een enkel tijdstip, ondersteunen de gegevens een model waarin cardiale progenitors naast differentiërende nakomelingen co-exist. De hier beschreven methode en workflow is breed toepasbaar voor de zebravis onderzoeksgemeenschap en vereist slechts een gelabelde transgene vislijn en toegang tot microfluidische technologieën.

Inleiding

De meeste huidige studies van de cel- en moleculaire biologie gebaseerd op gemiddelden populatie. Echter, belangrijke biologische gebeurtenissen worden gemaskeerd door deze traditionele bevolking op basis van analyses aangezien kleine populatie grote rol in biologische processen en de ziekte uitkomst kunnen spelen. Inzicht in genexpressie in heterogene populatie in de enkele cel niveau kan (en moet) leiden tot relevante biologische en klinische inzichten 1,2. Van belang voor studies embryonale ontwikkeling, in een grotere populatie van cellen, progenitorcellen vaak ondervertegenwoordigd, waardoor het een uitdaging om subtiele veranderingen in genexpressie die uiteindelijk lot van de cel beslissingen 3 initiëren detecteren. Evenzo kan een enkel celtype verschillende expressieprofielen hebben in reactie op de micro 4. Bijvoorbeeld, woonachtig endotheelcellen in hetzelfde orgaan of in verschillende organen (bijv., Aorta of nier) vertonen aanzienlijke heterogeniteit, ondanks het delen van gemeenschappelijke morphological en functionele kenmerken 5. Bovendien kunnen kankercellen bevolken dezelfde tumor ook variërende moleculaire profielen of mutaties op de enkele cel niveau 6.

In modelsystemen heeft transcriptomics in enkele cellen met succes geïdentificeerd nieuwe cel populaties, gekenmerkt tussenliggende staten die optreden tijdens de celdifferentiatie, en onthulde differentiële cellulaire reacties op stimuli 7,8,9. Dergelijke inzichten zou zijn gemaskeerd in conventionele bevolking op basis van studies. Zebravis embryo's zijn een enorm weinig gebruikte bron van stamcellen, voorlopercellen, en differentiërende cellen voor het verkennen van vragen van enkele cel heterogeniteit en moleculaire regulatie van cellulaire identiteiten tijdens de ontwikkeling. Hun zeer stereotiep, ex vivo ontwikkeling en het gemak van genetische manipulatie maken ze een uitstekend modelsysteem voor deze aanpak 10,11. In het bijzonder, een belangrijke beperking van de interpretatie van enkele cel gene uitdrukking gegevens is dat een betrouwbare identificatie van nieuwe intermediaire cel toestanden tijdens de ontwikkeling vereist zeer zorgvuldige timing van weefsel collectie 9. Dit is nodig om ervoor te zorgen dat de heterogeniteit tussen gevangen cellen vertegenwoordigt heterogeniteit binnen een weefsel op een enkel tijdstip in plaats van heterogeniteit in genexpressie door leeftijdsafhankelijke celdifferentiatie. In vergelijking met muizen kunnen zebravisembryo ontwikkeling nauwkeurig gesynchroniseerd over een groot aantal embryo's 12. Bovendien, met grote clutch formaten zebravisembryo's kunnen worden gebruikt als een rijke bron van stamcellen en progenitorcellen.

Dit protocol beschrijft een werkwijze om cellen van zebravis embryo's te isoleren en te vangen enkele cellen met behulp van een commercieel verkrijgbare geïntegreerde schakeling microfluidics (IFC) chip en autoprep voor qRT-PCR analyse van genexpressie. Dit protocol kan snel overdraagbaar aan een high throughput multiplexing assays waaronder geheeltranscriptoom sequencing dat meer uitgebreide analyse van de cellulaire heterogeniteit 13 toelaat. Het biedt ook een aantal voordelen aan traditionele genexpressie testen. Ééncellig isolatieprotocol levert hoge levensvatbaarheid na FACS, waar het aantal besmette cellen die zijn opgenomen in stroomafwaartse toepassingen afneemt. Door het gebruik van een IFC, kan gevangen cellen direct worden genomen om vast te leggen tarieven te evalueren en morfologisch beoordelen gezondheid van de cellen. Bovendien, dit protocol is breed toepasbaar op de zebravis onderzoek gemeenschap, is er slechts een label transgene vis lijn en toegang tot microfluïdische cel afvangtechnologieën.

Als bewijs van het principe werden afzonderlijke cellen afkomstig van cardiale progenitors geïsoleerd en vastgelegd op een IFC chip, en vervolgens de relatieve hoeveelheid van cardiale differentiatie merkers werd gemeten met qRT-PCR. Genexpressie analyse op de single cell niveau toont aan dat cardiale voorlopercellen samengaan met hun differentiating nageslacht. Het inzicht verkregen uit eencellige profilering van cardiale voorlopercellen kan licht werpen op de heterogeniteit in genexpressie patronen onder cardiale stamcellen tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren, die kunnen zijn gemaskeerd in de traditionele bevolking op basis van analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol vereist het gebruik van levende, volwassen zebravissen om embryo's te produceren. De embryo's worden geoogst voor weefsel collectie. Het is essentieel om de goedkeuring van de juiste ethische review boards te verkrijgen om dit experiment uit te voeren.

1. Vraag Geënsceneerde Embryo's

  1. De dag voor het experiment, voor te bereiden gezonde, volwassen zebravissen voor de fokkerij. Plaats een mannelijke en een vrouwelijke aan weerszijden van een duidelijke divider in een kweekbak.
  2. Herhaal 1.1 voor zoveel kweekbakken als nodig is voor voldoende embryo productie voor de downstream toepassing. Verkrijgen van embryo's uit zowel wild-type vis en transgene vis die fluorescerende eiwitten in het celtype van belang uit te drukken.
    LET OP: Het aantal embryo's die nodig zijn voor downstream-toepassingen in de stappen 2-8, hangt af van de relatieve rijkdom van de cellen van belang op het moment point of interest. Hoewel dit kan verschillen per cel, 200 embryo's te produceren 2,000-5,000 gesorteerde cellen wanneer de cellen van belang vertegenwoordigen <1,0% van de totale cellen op 24 HPF (uur na de bevruchting).
  3. De volgende ochtend, ververs het water in het paneren tank door de overdracht van vis om een ​​frisse kweekbak en verwijder de verdeler. Kantel de tank schuin op kweek stimuleren.
  4. Verzamel geënsceneerd embryo's.
    1. Elke 15 min, het verzamelen van embryo's door het overbrengen van de volwassenen om een ​​frisse kweekbak en het passeren van de eieren die zijn achtergelaten door een theezeefje.
      OPMERKING: zebravis embryo's synchroon te ontwikkelen wanneer gehandhaafd op vergelijkbare dichtheden en temperaturen.
    2. Spoel de eieren met Ei Water (0,21 g / l Instant Ocean zouten in 1 L dubbel gedestilleerd water) en over te dragen aan een petrischaal. Breng de petrischaal op een vochtige incubator bij 28,5 ° C met luchtcirculatie.
  5. Twee uur na de laatste collectie, sorteren bevruchte, meercellige embryo's in 10 cm petrischalen en het verminderen van de dichtheid tot 50 embryo's per gerecht. Selecteer embryo's van een enkele, 15min tijdvenster van de collectie voor downstream-applicatie. Incubeer embryo's bij 28,5 ° C.
    LET OP: Bijvoorbeeld, het verzamelen van embryo's om 8:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 en 10:15. Het vergelijken van in de tijd punten, wanneer het grootste aantal bevruchte embryo's uit de verzamelde om 9:00 koppelingen, gebruik dan alleen deze embryo's voor downstream-toepassingen.

2. Stel voor Single Cell Dissociatie

  1. Ongeveer 30 minuten voorafgaand aan het tijdstip van belang (18 HPF) verwijderen embryo's uit hun chorion handmatig met fijne pincet.
  2. Verzamel en label het volgende voor elke voorwaarde: twee 2 ml microcentrifugebuizen, een 40 um cel zeef, een 35 mm celkweek gerecht, en twee FACS buizen met daarop een 35 micrometer cel zeef.
  3. Chill de volgende reagentia op het ijs: Egg Water met 0,21 g / l Instant Ocean zouten in 1L dubbel gedestilleerd water; De yolking-buffer bevattende 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl en 1,25 mM NaHCO3; en FACS buffer bevattende Leibovitz L-15 medium aangevuld met 5% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum.
  4. Breng 1 ml per monster celdissociatie Reagens 1 tot kamertemperatuur. Dooi 1 ml Cell Dissociatie Reagens 2 per monster op ijs. Breng direct KT voor gebruik.

3. Single Cell Dissociatie

  1. Met een wijde boring glazen pipet 100-300 embryo een 2 ml microcentrifuge buis een minimumhoeveelheid Egg Water.
  2. Euthanaseren embryo's door het vervangen van water met 1 ml ijskoude Egg Water en onder te dompelen buis in ijs gedurende 20 min.
    LET OP! Het is van cruciaal belang voor de goedkeuring van de juiste institutionele Animal Care commissie van toezicht voor deze euthanasie methode (chillen op ijs, gevolgd door de cel dissociatie als secundaire euthanasie) te verkrijgen. Standaard euthanasie vereist gewoonlijk dat embryo <3 dagen na bevruchting gebleekt nadat ze zijn gekoeld, die niet geschikt is voor het verkrijgen van levensvatbare cellen.
  3. Was de embryo tweemaal met 1 ml ijskoude Egg Water. Te wassen, gebruik van een breed boring glazen pipet naar Egg Water en een P1000 Egg water toe te voegen te verwijderen.
  4. Verwijder de dooier van embryo water vervangen door 1 ml Deyolking buffer en 8-12 maal tritureren met een P1000 tip of totdat de dooier opgelost en alleen de organen van het embryo zichtbaar.
  5. Verzamel het weefsel door centrifugatie bij 300 xg gedurende 1 min. Gebruik een pipet om de bovenstaande vloeistof voorzichtig te verwijderen zonder verstoring van het weefsel pellet. Re-schorten in 1 ml Egg Water.
  6. Herhaal stap 3.5 voor een totaal van drie wasbeurten, maar op de laatste wasbeurt, opnieuw te schorten in 1 ml RT Cell Dissociatie Reagent 1.
  7. Incubeer in celdissociatie Reagens 1 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met buizen horizontaal geplaatst. Elke 2-3 min voorzichtig vermaal met een P1000 pipet om klonteren te voorkomen.
    OPMERKING: ga monsters voorzichtig tijdens tritureren stappen. Ergens een enkele, grote klomp zal vormen in de buis van een wirwar van embryo lichamen. Dit zaluiteen te drijven met extra spijsvertering geholpen door zachte trituratie. NIET VORTEX.
  8. Verzamel materiaal door centrifugatie bij 300 xg gedurende 3 min. Verwijder supernatant en resuspendeer in 1 ml Cell Dissociatie Reagent 2.
  9. Incubeer gedurende 5-15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buizen horizontaal. Elke 2-3 min zachtjes vermaal om klonteren te voorkomen. Elke 5 min, beoordeelt de spijsvertering vooruitgang.
    1. Om de spijsvertering vooruitgang te beoordelen, te verdunnen 2 pl supernatant in 18 ul FACS buffer en pipet als een druppel op een celkweek schotel.
    2. Plaats een dekglaasje boven het monster en te observeren onder een weefselkweek microscoop bij 10X en 20X vergrotingen.
      NB: Het preparaat moet verschijnen als een mix van enkele cellen, kleine clusters, grote clusters, en af ​​en toe meestal intact embryo lichaam.
    3. Visueel beoordelen het aandeel van het preparaat die enkele cellen en kleine clusters.
      OPMERKING: Over-vergisting zal levensvatbaarheid te verminderen; onder-vergisting zal enkele opbrengst cel vermindert.
  10. Verzamel de celpreparaat door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 1 ml koud FACS buffer.
  11. Bevochtig een 40 micrometer cel zeef met FACS buffer. Passeer de cel suspensie door de 40 um cel zeef op een 35 mm celkweek schotel. Was de cel zeef één keer met 1 ml FACS sortering buffer.
  12. Transfer het doorstroomkanaal een 2 ml microcentrifugebuis. Verzamel cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in 100 gl FACS buffer.
  13. Celtelling met een hemocytometer opbrengst. Verdun monsters 5x10 6 cellen per ml of optimale concentratie aanbevolen voor FACS machine keuze. Optionele Bij het tellen cel rendement op de hemocytometer, tegenkleuring dode cellen met trypan blauw om de levensvatbaarheid van het preparaat cel voorafgaand aan FACS sortering bevestigen.
    LET OP: De voorbereidingen die te worden verdund zal het teveel tijd in beslag nemen om te sorteren. Preparaten die ook zijn concentrated neiging tot klonteren in multimeren en suboptimaal voor het sorteren van een zuivere populatie.
  14. Reserve 10-20% van elk monster als ongekleurde controls te gebruiken. Voor overige monsters, vlek dode cellen door toevoeging van een fluorescente live / dead (L / D) discriminatie kleurstof in elk monster. Niet wassen.
    OPMERKING: fluorescente kleurstof die cellen doordringt met een gecompromitteerde celmembranen en vlekken nucleïnezuren kunnen worden toegepast als de L / D kleurstof, op voorwaarde dat de fluorescentie spectra verenigbaar met de FACS machine keuze en fluorofoor labeling cellen plaats.
    1. Laat de voorbereiding niet wassen na het toevoegen van de kleurstof als sommige cellen zullen sterven op doorreis naar FACS zuivering en van de gesorteerde populatie moet worden uitgesloten.
  15. Bevochtig de 35 micrometer cel zeef bedekte FACS buis met 20 ul FACS buffer. cellen toe te voegen aan de zeef en het verzamelen door de zwaartekracht. Op te slaan op het ijs.

4. FACS Enrichment

  1. Gebruik FACS te verrijken voor alleenstaande, Levende cellen die de fluorescente merker.
    1. Zet een hek om cellen te onderscheiden van puin op een scatter plot van voorwaartse verstrooiing (FSC-A) amplitude vs zijwaartse verstrooiing amplitude (SSC-A), beide met lineaire scaling.
      Let op! Zebravis cellen zijn doorgaans kleiner zijn dan de muis of menselijke cellen. Dit komt tot uiting in een lagere basale scheiding van cellen en afval.
    2. Van de in 4.1.1 poort, zet een hek te verrijken voor enkele cellen zijn exclusief multimeren met behulp van een scatterplot van voorwaartse verstrooiing hoogte (FSC-H) en lage zijwaartse verstrooiing hoogte (SSC-H), beide met lineaire scaling.
      OPMERKING: Cellen met onevenredig hoge FSC-H en lage SSC-H zijn waarschijnlijk multimeren en zijn uitgesloten van het sorteren.
    3. Van de poort set in 4.1.2, met behulp van enkele kleur controles, stelt een poort om alleen levende cellen met behulp van een scatterplot van FSA-A met lineaire scaling en amplitude van het kanaal zijn onder andere gebruikt om de L / D vlek te detecteren met log scaling. Omvatten L / D-negatieve cellen.
    4. Vande poort in 4.1.3, met behulp van enkele kleur controles, stelt een poort om alleen levende cellen met positieve fluorescentie onder andere met behulp van een scatter plot van FSA-A met lineaire scaling en amplitude van het kanaal dat wordt gebruikt om fluorescerend eiwit cel marker te detecteren met log scaling . Inclusief positieve cellen.
    5. Stel schadevergoeding controle, indien nodig, verklaren interferentie tussen de L / D kleurstof en fluorescerende eiwit spectra.
  2. Set soort logica om cellen die in elk van de in stap 4.1 poorten vallen.
    1. Het gebruik van dubbel gelabelde cellen, controleren venstertijd voor celsortering.
      OPMERKING: Cellen voor het sorteren van cellen zal plaats puin, enkele cellen in plaats van multimeren, L / D negatief en fluorescentie positieve cellen.
  3. Soort 2.000-4.000 cellen uit de populatie van belang in 5 ui koude FACS buffer in een microcentrifuge buis op ijs. Om te snijden en druk op de cellen te minimaliseren tijdens het sorteren, gebruik dan de laagste druk mogelijk voor de celsorteerder.
    OPMERKING: De 5 ul druppel FACS buffer dient als een kussen voor het verlaten van de cellen FACS machine. Verzamelen van 2.000-4.000 cellen direct in FACS buffer elimineert de noodzaak van centrifugatie voorafgaand aan het laden op de IFC chips. Deze strategie wordt aanbevolen omdat centrifugeren kan leiden tot de vorming van multimeren of cellen aan elkaar hechten in de pellet.
  4. Beoordeel de post-soort levensvatbaarheid analyse.
    1. Breng 1 pl gesorteerde cellen een nieuwe FACS buis met 100 ui FACS sortering buffer en 1: 1000 verdunning van L / D vlek. Leid de cellen door FACS sorter de gating strategie in stap 4,1. Gebruik het aandeel van de L / D negatief naar positief om de levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen te schatten.

5. Plaats cellen op Microfluidics Chip

  1. Met behulp van een hemocytometer, meet zowel de concentratie en de grootte van gesorteerde cellen.
    1. Verdun gesorteerde cellen ten minste 10 pl. Verdun een hoeveelheid van 5 μ; L cellen met 5 pi trypan blauw. Laden op hemocytometer en dekglaasje aan.
    2. Verzamel heldere veld beelden van alle cellen in 4 x 4 roosters van hemocytometer. Tel het aantal levende cellen en bereken levende cellen / ml. Levende cellen nemen geen trypan blauw.
      OPMERKING: Gebruik een standaard beeldanalyse software om de diameter van alle levende cellen te meten. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van de celgrootte en selecteer een IFC plaat geschikt voor celgrootte bereik plaats. Als cel grootte variëren straddles een IFC plaat cel grootte, gebruik van meerdere platen om het volledige scala van cellen van belang vast te leggen.
  2. Load cellen op te IFC plaat volgens de instructies van de fabrikant (zie Materials).
    1. Verdun cellen 1x10 6 cellen / ml en uitvoeren drijfvermogen optimalisatie instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: drijfvermogen optimaliseren zodat cellen niet zinken naar de bodem of naar boven drijven van de lading well voor optimale belading op IFC chip. De verhouding van buffer tot cellen kan per celtype, maar varieert kenmerkend 6: 4-7: 3 cellen: buffer.
    2. cellen om primer-IFC plaat toe te voegen. Load plaat in compatibele fluidics machine, en uitvoeren van een cel laden script naar de cellen door te drukken microfluidics circuit en in capture rijstroken.
  3. Bevestigen dat cellen in capture sites op IFC plaat worden ingediend.
    1. Verwijder IFC plaat uit fluidica machine. Monteer de IFC plaat op een microscoop uitgerust met een plaat adapter.
    2. Verzamel snapshots van heldere veld en fluorescentie voor elke capture site op 10x vergroting.
      LET OP: Helderveld capture tijden kunnen variëren 10-50 ms, afhankelijk van de lamp intensiteit. Fluorescence capture tijden kunnen variëren 250-750 ms, afhankelijk van de helderheid fluorofoor. Vermijd overbelichten cellen photodamage voorkomen.

6. cDNA Synthesis

  1. Voeren cellysis in situ volgens Iinstructies FC plaat fabrikant.
    1. Voeg lysis buffers te putten op IFC plaat. Load plaat op compatibele fluïdica machine en run cellysis script volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Voer reverse transcriptie volgens de instructies van IFC plaat fabrikant.
    1. Voeg reverse transcriptie reagentia IFC plaat. Load plaat op compatibele fluidica machine. Run reverse transcriptie script. Sample fietsomstandigheden: 1 cyclus bij 25 ° C gedurende 10 min, 1 cyclus bij 42 ° C gedurende 1 uur, daarna 1 cyclus bij 85 ° C gedurende 5 minuten.
  3. Voer voorversterking met genspecifieke probes volgens de instructies IFC constructieplaat.
    LET OP: Door hun grotere specificiteit met een laag-kopie-aantallen, gebruiken fluorogene-gelabelde probes in plaats van probes geoptimaliseerd voor gebruik met intercalator kleurstoffen.
    1. Pool primers en verdun tot de uiteindelijke 180 nM elk. Voeg samengevoegd primers aan IFC plaat. Load plaat op compatibele fluidics machine. Run voorversterking script.
  4. Uitvoeren pre-amplificatie met de volgende cyclusomstandigheden: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 min, vervolgens 18 cycli voor 15 sec denatureren bij 95 ° C dan annealing en verlenging bij 60 ° C gedurende 4 min. WINKEL voorversterkte cDNA bij 4 ° C tot oogst. Oogst cDNA uit microfluïdische plaat volgens de instructies van de fabrikant en opslag bij -20 ° C tot gebruik.

7. Selecteer cDNA van Single Cellen voor Single Target qRT-PCR

  1. Verdun cDNA in 25 pl verdund reagens volgens de instructies van de fabrikant.
    LET OP: Geschatte uiteindelijke opbrengst is 28 ul van pre-versterkte cDNA per cel. Reserveren een hoeveelheid oplosmiddel voor toepassing als een no-template controle in qRT-PCR.
    1. Verwijzend naar helderveld en fluorescerende beelden die zijn opgenomen in stap 5.3.2, scoren elk capture website. Handmatig tellen en het aantal cellen nemen. Beoordelen en registreren of elke cel grieporescent.
      OPMERKING: Elke individuele site kan bevatten respectievelijk 0, 1, of> 1 cel, waarbij> 1 cel omvat capture sites die meerdere cellen en / of niet-identificeerbaar puin bevatten. Als de beelden voldoende kwaliteit kan een pixelwaarde tevens in de intensiteit van het fluorescentiesignaal kwantificeren.
  2. Select monsters voor qRT-PCR analyse.
    1. Selecteer cDNA monsters van capture locaties die in stap 7.2 dat exacte 1 cel met positieve fluorescentie bevatten. Pool 1 ui porties van cDNA uit elk monster.
      Opmerking: Dit is het "Pool" positieve controle voor het constateren van genen van belang zijn in willekeurig welke van de geselecteerde cellen.
    2. Kies cDNA uit ten minste een invangplaats die exact 0 cellen als een negatieve controle bevat. Gebruik verdunner uit stap 7.1.2 als een no-template controle.
  3. Run qRT-PCR assay.
    1. Uitsluitend probes gebruikt voor pre-amplificatie in stap 6.4.1. Laad alle monsters in triplicate. Fietsweerbericht een 10 ul reactie op een plaat met 384 putjes: 1 cyclus 50 ° C 2 min, 1 cyclus 95 ° C gedurende 10 min, 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C 15 sec daarna annealing en verlenging bij 60 ° C gedurende 1 min.

8. Data Analysis

  1. Valideren qRT-PCR-producten door middel van standaard gelelektroforese. Bevestig product is een enkele band bij verwachte molecuulgewicht (verschilt per sonde).
    LET OP: Als een sonde produceert meerdere banden of een enkele band op een ongeschikt formaat, dan specificiteit is twijfelachtig, en dit is exclusief het gen uit de analyse.
  2. Controleer alle versterking rondingen en zijn goed voor eventuele afwijkingen 14. Bereken de gemiddelde CT-waarde voor elk monster / gencombinatie 15.
    LET OP: CT-waarden voor positieve controles variëren doorgaans 10-30. CT-waarden voor de negatieve controles variëren doorgaans 35-40 (geen versterking). CT waarden 30-35 worden beschouwd als zeer lage expressieen moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd 14.
  3. rapport data
    1. Wanneer monsters in de CT = 10-30 vallen, kunnen gegevens worden gerapporteerd als voudige verandering in overvloed transcript ten opzichte van een controlemonster.
      OPMERKING: Fold change gelijk aan 2 ^ (- ΔΔCT) waarbij OCT heeft betrekking op een housekeeping gen door het gemiddelde CT van het monster uit het huishoud-gen en ΔΔCT de verschillen in OCT tussen het monster en een positieve controle 15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als proof of principle, werd genexpressie onderzocht om differentiatie dynamiek te verkennen tijdens de ontwikkeling van het hart. In de zebravis, cardiale voorlopercellen ontstaan ​​uit een mesodermale populatie van cellen die migreren naar de voorste laterale plaat mesoderm waar ze fuseren met de lineaire hart buis te vormen. Voorafgaand aan fusie, cardiale voorlopercellen beginnen de transcriptiefactor Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), waarvan wordt gedacht dat het eerste specifieke m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van expressie van een fluorescerend eiwit onder controle van een cel-type specifieke promotor om een ​​populatie van cardiale progenitorcellen van zebravis embryo's voor gebruik in microfluïdische steungebied eencellige beeldverwerkingssysteem verrijken expressie van een subset van cardiale genen in één evalueren cellen. Mits FACS laser excitatie en emissie vermogen verenigbaar met het fluorofoor (s) naar keuze, kan deze methode worden gebruikt voor elke fluorescerende re...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Dr. C. Geoffrey Burns voor de visvoorraad. De auteurs zijn dankbaar aan UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core voor de middelen die dit project mogelijk maken, en de ZAC faciliteit voor dierenverzorging. L.S. wordt ondersteund door NIH T32-subsidie HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. wordt ondersteund door NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. Dit onderzoek werd ondersteund door NIH P30DK034987-subsidie (aan UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 en Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (aan Dr. Qian), en NIH R00 HL109079-subsidie (aan Dr. Liu).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Benodigdheden
Dumont #5 forcepsFine Science Tools11254-20Voor het verwijderen van het chorion uit embryo's
Microcentrifugebuis 2 mlGeneMateC-3261-1
40 um celzevenBiobasicSP104151
35 mm kweekschotelFalcon351008
FACS-buizen voorzien van 35 um celzevenFalcon352235
P1000 en tipsRainin17005089
P20 en tipsRainin17005091
Protocol van de fabrikant van IFC-chipFluidigm100-6117Versie 100-6117 E1 werd gebruikt in representatieve experiment
Wide bore pasteur glazen pipetVWR14673-010Voor het overbrengen van embryo's
Volwassen wilde type zeebaarsN/AWe gebruikten AB-lijn
Volwassen transgene zeebaarsN/AWe gebruikten Tg(nkx2.5:ZsYellow)
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia voor celdissociatie
Dubbel gedistilleerd waterN/A
Instant Ocean ZeezoutInstant OceanSS15-10
NaClFisherScientificS271-3Maak stock in water en gebruik voor de-yolking buffer
KClSigma AldrichP5405Maak stock in water en gebruik voor de-yolking buffer
NaHCO3Sigma AldrichS6014Maak stock in water en gebruik voor de-yolking buffer
Leibovitz's L-15Gibco21083-027
FBSFisherScientific03-600-511Verwarm inactief; elk merk van FBS zou prima moeten zijn
Celdissociatie Reagens 1 -TrypLELife Technologies12605-010Bewaar op kamertemperatuur.
Celdissociatie Reagens 2 - FACSmaxGenlantisT200100Bewaar -20; ontdooi op ijs; breng naar kamertemperatuur voor gebruik
pronase (optioneel)SigmaP5147
L/D Kleurstof - Sytox BlauwLife TechnologiesS34857Elke leven/dood kleurstof geschikt voor flowcytometrie zal werken
Trypan BlauwGibco15250-061
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia voor IFC-plaatgebruik en qRT-PCR
Gen-specifieke sondesSondes variëren per experiment
TaqMan Sonde ef1aLife TechnologiesDr03432748_m1
TaqMan Sonde gata4Life TechnologiesDr03443262_g1
TaqMan Sonde nk2-5Life TechnologiesDr03074126_m1
TaqMan Sonde myl7Life TechnologiesDr03105700_m1
TaqMan Sonde vmhcLife TechnologiesDr03431136_m1
TaqMan Sonde isl1Life TechnologiesDr03425734_m1
TaqMan Gen Expressie Master MixLife Technologies4369016
Reagentia vermeld in het protocol van de IFC-fabrikant
C1 ReagenskitFluidigm100-5319Reagentia voor het laden van cellen op IFC-plaat
Ambion Single Cell-to-CTTMLife Technologies4458237Reagentia voor reverse transcriptie en pre-amplificatiestappen
Moleculair biologie kwaliteitswaterCorning46-000CM
C1 IFC voor PreAmp (5-10 µm)Fluidigm100-5757IFC-plaat voor kleine cellen
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
C1 AutoPrep-machineFluidigm100-5477Voor IFC-plaatgebruik
HemocytometerSigma AldrichZ359629Voor het tellen van cellen en het beoordelen van celgrootte
DissectiemicroscoopVoor het verwijderen van embryo's uit het chorion
WeefselkweekmicroscoopVoor het beoordelen van enkele celdigestie
FACS-machineVoor het isoleren van cellen van belang

Referenties

  1. Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
  2. Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
  3. Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
  4. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
  5. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
  6. Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
  7. Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
  8. Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
  9. Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
  10. Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
  11. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  13. Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644(2014).
  14. McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
  15. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
  16. Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
  17. Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
  18. Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
  19. Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
  20. McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102(2008).
  21. Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
  22. Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
  23. de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
  24. Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
  25. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
  26. Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van enkelvoudige cellenmicroflu dische chipFACS sorteringcel dissociatiegenexpressieanalysefluorescente markersTrypan Blue exclusiege ntegreerd flu disch circuitqRT PCR
Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo's
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.